劉芳

摘 要：對變異的大腸桿菌ATCC 11105中提取的青霉素G?；傅姆磻捌淠娣磻獎恿W的研究和其反應常數(shù)的確定，結果表明，酶會被過量的青霉素G和兩種產(chǎn)物所抑制。在正反應方向的脫酰作用中觀察到6-氨基青霉烷酸（6-APA）的非競爭性抑制和苯乙醛酸的競爭性抑制。逆?；磻淖钸mpH是5.7。此逆反應的機制被研究，底物抑制的影響也被研究，如6-APA，苯乙酸和產(chǎn)物。結果表明，青霉素G是逆反應的混合型抑制劑。版權為2001 Elsevier科學股份有限公司所有。

關鍵詞：青霉素G酰化酶；單一可逆反應；可逆單一反應；抑制；動力學；反應機理

中圖分類號：TB 文獻標識碼：A doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2017.34.096

1 簡介

青霉素G酰化酶（PG?；?，EC3.5.1.11）催化青霉素分子中線性氨鍵水解成β-內酰胺分子，6-氨基青霉烷酸（6-APA）和相應的羧酸。PG?；赣糜诠I(yè)半合成青霉素和頭孢菌素的6-APA和7-氨基-3-脫酰頭孢菌酸（7-ADCA）的生產(chǎn)過程中。半合成青霉素是在酸性或中性環(huán)境中（pH4.0-7.0）產(chǎn)生，而6-APA和7-ADCA則是在堿性中（pH7.5-8.5）產(chǎn)生。PG?；缚梢岳媒湍?，細菌或霉菌生產(chǎn)。多數(shù)的PG?；甘怯么竽c桿菌生產(chǎn)的。重組大腸桿菌（如ATCC 31052，11105，21285和14945）消除了一些PG?；干a(chǎn)中遇到的問題如糖和其他碳源的代謝抑制。在多數(shù)的工業(yè)生產(chǎn)過程中，部分純化酶用在細胞或酶在不同支持物上的固定化。由于產(chǎn)品成本低，細胞的固定催化會更有利益。

在間歇和連續(xù)培養(yǎng)的攪拌反應器中用固定化青霉素酰化酶和它的不能溶解衍生物，描述為大腸桿菌中PG酰化酶的分離和動力學青霉素?；皋D化為6-APA。最近的研究包括從大腸桿菌ATCC 11105的變種中提取出的并固定在過氧聚丁二烯-丙烯酸凝膠上青霉素G?；傅姆磻獎恿W機理，青霉素G?；干锎呋瘎┑奶攸c和應用以及工業(yè)上以硅土為載體的青霉素G?；傅臏蕚涞墓潭ɑ芯?。

在水相中，青霉素G酰化酶斷開青霉素G分子的肽鏈，產(chǎn)生一種羧酸和6-APA。目前，青霉素G酰化酶無論是自由的還是固定化的都只有其正反應動力學被研究過，至今還沒有關于其逆反應動力學的報道，例如6-APA和羧酸在青霉素G?；傅淖饔孟庐a(chǎn)生青霉素G和水的生物催化反應。正逆反應的研究和因此整個反應動力學的參數(shù)與完成比率的相等的結論需要用來預測應用在這種酶反應的反應器的性能。在目前的文章中，研究了正逆反應的穩(wěn)態(tài)動力學。底物和產(chǎn)物對反應機理和抑制的影響以及整個反應的動力學參數(shù)都已經(jīng)確定了。

2 材料和方法

2.1 材料和微生物

6-APA從Nakalai Tesque（東京，日本）購買，青霉素G鈉鹽由Jaber Ibn-e-Hayan Pharmaceutical公司（德黑蘭，伊朗）提供。所有試劑都是微生物純或分析純的。分析純的和酶分離與純化的化學純的試劑是從Merck AG（達姆施塔特，德國）和Sigma（圣路易斯，澳門）。

大腸桿菌ATCC 11105的變種是由沙里夫技術大學（德黑蘭，伊朗）的生化和生物環(huán)境工程研究中心提供的。間歇培養(yǎng)在0.500 L的搖瓶中裝入0.100 L。震動設為250 rpm溫度25℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)基組成如下（重量/體積）%：苯乙酸0.20%，酵母膏0.50%，NH4Cl 0.10%，K2HPO4 0.10%， KH2PO4 0.01% 和MgSO4·7H2O0.02%。

2.2 酶分離和純化

大部分細胞都是菌懸液在轉速6000rpm溫度為0-4℃條件下通過40分鐘管狀離心從培養(yǎng)基中分離出來的。細胞破壁是菌懸液在pH7.8的0.10M的磷酸緩沖液中利用90周波的超聲儀作用90秒。菌懸液經(jīng)過在轉速8000rpm溫度為0-4℃條件下通過管狀離心去除細胞碎片。利用（NH4）2SO4溶液沉淀法使酶液部分純化。酶液在（NH4）2SO4的飽和度為40-60%時沉淀分離在0.10M、pH7.8的磷酸緩沖液中。溶液滲析后，收集沉淀，利用EDTA-纖維素作進一步純化。

2.3 蛋白含量和酶活的測定

利用Lowry法測蛋白含量。用Balasingham法測定PG?；傅谋然盍?，如下。PG?；富盍σ粏挝患?U，指在pH7.8、溫度37℃100mM的磷酸緩沖液中1分鐘分解1μmol的青霉素G轉化為6-APA所需的酶量。

3 結果與討論

3.1 整個反應動力學與平衡常數(shù)

從不同種類的大腸桿菌獲得的PG?；傅拇呋碌那嗝顾氐乃鈺坏孜锏母邼舛纫种疲朔磻漠a(chǎn)物6-APA和苯乙酸（PAA）分別產(chǎn)生非競爭性抑制和競爭性抑制。在PG酰化酶（E）催化下的青霉素的脫?；磻姆€(wěn)態(tài)動力學包括一種底物和兩種產(chǎn)物即6-APA和PAA（Q）。

3.2 正反應的動力學

3.3 正反應中底物（青霉素G）抑制的影響

高濃度的青霉素G（30.00， 40.00， 50.00，60.00 和70.00 mM）對底物抑制的影響很明顯，據(jù)研究它也受底物抑制常數(shù)Kia的影響。青霉素G濃度在這樣的范圍（30.00-70.00mM），6-APA的產(chǎn)率會隨著青霉素G的濃度的增加而降低。這表明了青霉素G在上述濃度范圍內的抑制影響。

3.4 正反應產(chǎn)物（PAA和6-APA）的抑制影響

實驗結果表明青霉素G酰化酶會產(chǎn)生底物抑制。為了研究產(chǎn)物的抑制影響，分別測定PAA或6-APA的不同量時的反應速率。

缺乏6-APA時，不同濃度的PAA （0.50，0.75，1.00，1.25mM）和青霉素G （1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）的截距值，表明了PAA的競爭性抑制。endprint

缺乏PAA時，研究不同濃度的6-APA （0.20，0.30，0.40，0.50 和0.60mM）和青霉素G （1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）的抑制影響，在抑制物的缺乏與存在時，6-APA的非競爭性抑制受到影響。結果顯示青霉素G的加入可產(chǎn)生兩種產(chǎn)物抑制：首先非競爭性抑制（6-APA）然后是競爭性抑制（PAA）。因此，PG?；复呋那嗝顾谿反應是一種有序的單一雙向反應。

3.5 逆反應的pH最優(yōu)化

正反應是在堿性條件（pH=7.8）下的，在青霉素G?；复呋碌?-APA與PAA（酰化）反應在酸性條件下。這個反應在一定pH之下才能進行，pH是由酶反應與6-APA，PAA，青霉素G和酶原之間折中決定的。青霉素G（正反應）酶水解的最適pH為7.8，產(chǎn)物的形成和青霉素G和6-APA的退化都可以忽略。在最適pH下，水解時的緩沖要求會降低，低的產(chǎn)物抑制影響會很明顯。眾所周知這種?；磻荒茉趐H5.0到6.0中進行。磷酸鹽，檸檬酸鹽和磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液用于pH為4.5，5.0，5.3，5.7和6.0，為了優(yōu)化?；磻膒H值和選擇合適的緩沖液類型。產(chǎn)物濃度，青霉素G濃度在反應120s中測定1.00mM6-APA和PAA。產(chǎn)生最大量的青霉素G的條件為pH=5.7，100mM檸檬酸鹽緩沖液濃度可得到0.05mM的青霉素G。青霉素G的最高濃度為0.03和0.02mM，條件為pH=5.7由100mM磷酸鹽和磷酸-檸檬酸鹽緩沖液提供。因此，逆反應的最優(yōu)條件為用100mM檸檬酸緩沖液構建pH=5.7，產(chǎn)物（青霉素G）和反應物（6-APA和PAA）對于后續(xù)的反應處理要足夠，而且酶反應的速率（青霉素G產(chǎn)量最大）也最大。

3.6 逆反應的動力學

研究逆反應的動力學要在兩種不同條件下：在不斷改變的PAA濃度時測定6-APA的濃度。當6-APA濃度改變，逆反應的速率方程如等式（4）所示有Segel給出。

不同濃度的PAA（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00mM）的逆反應動力學結果即當副底物6-APA在不同的固定濃度（2.00，3.00，4.00 和5.00 mM）時1/v和1/Q成比例。在6-APA或PAA作為變化的底物的兩種不同情況下，其逆反應的動力學常數(shù)的結果都很一致。因此，此可逆反應的假設機理也很好的符合了這個以PG?；复呋a(chǎn)生6-APA和PAA的可逆雙向單一反應的實驗動力學資料。

3.7 在可逆反應中產(chǎn)物（青霉素G）的抑制影響

低濃度的青霉素G（0.02，0.04，0.06和0.08 mM）用于研究此可逆反應中青霉素G的抑制反應。較高濃度的青霉素G可能會導致正反應過強。在兩種獨特的條件下研究這種抑制反映：固定PAA的濃度（2.00mM）改變6-APA的濃度（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）和固定6-APA的濃度（2.00mM）改變PAA的濃度（1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mM）。測定產(chǎn)生的6-APA（青霉素G的產(chǎn)物）的濃度，利用檸檬酸緩沖液將pH調制5.7。此變化6-APA濃度的雙向單一可逆反應的產(chǎn)物抑制速率平衡方程如等式（6）所示由Segel給出。

反應中產(chǎn)物抑制的動力學常數(shù)是由A的不同濃度下和一定的P不飽和濃度下，1/v與1/Q的比值得出的。由P和Q的不飽和濃度得出的Kia和Kma的值。表示青霉素G作為一種混合型抑制劑在PAA不飽和時與6-APA有關。飽和的PAA會掩蓋這種抑制。另一方面，青霉素G是一種在任意6-APA濃度下都與PAA有關的競爭性抑制劑。飽和6-APA使當前的Vmax變?yōu)檎鎸嵉腣max，但當前的Kmq依然取決于A。速率比率的常數(shù)是： k1/k-1=0.05； k2/k-2=-1.28； k3/k-3=1.69。從1/A的斜率或1/v軸的截距與抑制物濃度的比值計算得出的表觀值kis值，此值可以由反應的動力學常數(shù)的定義或酶抑制物混合物的不相關常數(shù)來確認。正反應和逆反應的機理和它們的比率等式以及動力學常數(shù)可用來分析反應的動力學和預測青霉素G向6-APA轉化的酶生化反應的表現(xiàn)。

參考文獻

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