許航 丁一 劉文星 劉天龍 文愛東

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032)

·論著·

黃芪甲苷和羥基紅花黃色素A配伍抗腦缺血再灌注損傷的協(xié)同作用及機(jī)制研究

許航 丁一 劉文星 劉天龍 文愛東*

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032)

目的探討黃芪甲苷(AST-IV)和羥基紅花黃色素A(HSYA)配伍治療大鼠腦缺血再灌注損傷作用及其機(jī)制。方法100只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、AST-IV組、HSYA組、AST-IV和HSYA配伍組等5組，采用線栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，再灌注72 h評(píng)分后處死；腦組織制片后采用蘇木素-伊紅(HE)染色，免疫組化檢測(cè)血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(CD31)表達(dá)；氧化炎癥檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)指標(biāo)。結(jié)果與模型組比較，各給藥組均有療效，AST-IV組、HSYA組、AST-IV和HSYA配伍組均能改善大鼠神經(jīng)損傷并減輕腦缺血再灌注損傷，促進(jìn)CD31表達(dá)，改善SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，降低TNF-α和IL-β水平，其中配伍組的治療效果最為顯著。結(jié)論AST-IV和HSYA配伍可以顯著發(fā)揮協(xié)同抗腦損傷作用，其抗炎、抗氧化和促血管新生作用是潛在作用機(jī)制。

腦缺血再灌注; 黃芪甲苷; 羥基紅花黃色素A

缺血性腦卒中是指血管阻塞引起腦缺血和缺氧損傷導(dǎo)致的腦功能障礙，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，是威脅人類健康的重大疾病之一。近年來，缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease, ICVD)呈現(xiàn)出全球年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重危害了人類的健康和生活，并且缺乏有效的治療藥物[1]，因此，缺血性腦損傷保護(hù)藥物的研發(fā)已成為醫(yī)藥界的研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)，中藥及其藥效物質(zhì)在腦缺血性疾病治療中發(fā)揮著越來越重要的作用[2]。中藥配伍具有多組分多靶點(diǎn)的整合藥效學(xué)優(yōu)勢(shì)，能夠在抗炎、抗氧化、促血管生成等方面發(fā)揮協(xié)同增效作用[3-4]。黃芪與紅花配伍使用常見于治療氣虛血瘀證的方劑，其中黃芪重在補(bǔ)氣，紅花旨在活血，二者配伍使用完全契合缺血性腦卒中氣虛血瘀的病理機(jī)制[5]。前期研究以及本課題組的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷(astragaloside IV, AST-IV)和羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)分別是黃芪和紅花的主要藥效活性成分。AST-IV是黃芪主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可通過抗炎、促進(jìn)血管新生等機(jī)制發(fā)揮腦缺血再灌注的保護(hù)作用[6-7]。HSYA是紅花的藥效物質(zhì)，可在腦缺血后提升腦血流量，減小梗死面積，以及通過其抗氧化作用保護(hù)腦細(xì)胞免受缺血損傷[8-9]。然而，目前僅有AST-IV或HSYA單組或與其他少數(shù)中藥有效成分配伍在治療抗腦缺血再灌注損傷的研究，二者配伍在該方面的防治效果卻鮮有報(bào)道。因此，本研究基于中醫(yī)理論的多組分多靶點(diǎn)理念，基于大鼠腦缺血再灌注模型，通過蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色和免疫組化染色等方法，檢測(cè)損傷后各組病理學(xué)改變、神經(jīng)學(xué)功能評(píng)分和抗炎、抗氧化生化指標(biāo)以及血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, CD31)表達(dá)，探討AST-IV和HSYA配伍抗腦缺血再灌注損傷及其機(jī)制，為該類組方的二次開發(fā)及其應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料方法

一、材料

黃芪甲苷(批號(hào)A0070)和羥基紅花黃色素A(批號(hào)78281)購自中國成都曼思特生物科技有限公司，純度≥95%，使用時(shí)以5%的羧甲基纖維素鈉配成混懸液備用。SD雄性大鼠100只，體質(zhì)量為250～300 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

二、實(shí)驗(yàn)分組和給藥

將100只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、AST-IV組、HSYA組、AST-IV和HSYA配伍組，每組各20只。假手術(shù)組和模型組分別注射等劑量0.9%氯化鈉注射液3 mL；AST-IV組給予40 mg/kg的AST-IV，用0.9%氯化鈉注射液稀釋至3 mL腹腔注射；HSYA組給予60 mg/kg的HSYA，用0.9%氯化鈉注射液稀釋至3 mL腹腔注射；配伍組給予混勻的20 mg/kg AST-IV和30 mg/kg HSYA，分別于手術(shù)前12 h和30 min注射1次，手術(shù)后每隔12 h再注射1次，直到72 h后最后1批大鼠被處死。各組劑量選擇基于以往藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[3, 10]。

三、動(dòng)物模型建立

局灶性腦缺血再灌注模型鼠參照Zea Longa法進(jìn)行制作。大鼠麻醉后，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端用電凝器灼斷。頸外動(dòng)脈殘端剪一切口，將線栓經(jīng)左側(cè)頸外動(dòng)脈主干切口緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn)至大腦中動(dòng)脈。阻斷3 h后，撥出線栓至有輕微阻力時(shí)為止，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組將線拴插入頸內(nèi)動(dòng)脈6 mm，模型組將線拴堵塞推進(jìn)至大腦中動(dòng)脈，阻斷3 h后，撥出線栓至有輕微阻力時(shí)為止，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組將線拴插入頸內(nèi)動(dòng)脈6 mm，模型組將線拴堵塞大腦中動(dòng)脈，不加藥物處理。標(biāo)本分別于腦缺血2 h再灌注72 h各時(shí)間點(diǎn)用10%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)大鼠后獲取。4%多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦，切取冠狀腦片，石蠟包埋及切片。納入統(tǒng)計(jì)的大鼠為80只，損失包括制作腦缺血再灌注模型中不符合標(biāo)準(zhǔn)的12只大鼠和術(shù)中操作失誤導(dǎo)致大出血死亡的8只大鼠。

四、神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分

按照Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在術(shù)后72 h對(duì)各組大鼠按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。0分為無神經(jīng)損傷癥狀，1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，3分為向?qū)?cè)傾倒，4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

五、腦梗死面積計(jì)算

腦缺血24 h后處死大鼠，斷頭取腦，將大鼠腦組織置于腦磨具中，切成2 mm厚度，置于1%的氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride, TTC)染液，避光，37 ℃恒溫箱中染色30 min，然后將完成染色的腦組織用4%的多聚甲醛置于4 ℃保存固定。用數(shù)碼相機(jī)拍照后，用Image Pro Plus 7.0處理并計(jì)算腦梗死面積的百分比。

六、HE染色

采用HE染色觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后的病理變化。大鼠缺血再灌注72 h后經(jīng)肝素生理鹽水和4%的多聚甲醛灌注內(nèi)固定后斷頭取腦，取視交叉向后3 mm腦塊進(jìn)行4%的多聚甲醛外固定，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋及切片，將各組切片分成兩組，一組進(jìn)行常規(guī)HE染色，另一組進(jìn)行免疫組化染色。

七、免疫組化檢測(cè)CD31表達(dá)

采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex, SABC)方法對(duì)CD31表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。石蠟切片脫蠟至水；5%～10%正常山羊血清經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline, PBS)稀釋后封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，滴加1∶100比例稀釋的一抗，陰性對(duì)照采用正常山羊血清替代一抗進(jìn)行；4 ℃過夜。用PBS沖洗，5 min×3次。加1∶100比例的生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育10～30 min。用PBS沖洗，5 min×3次。加試劑SABC，37 ℃孵育10～30 min。再用PBS沖洗，5 min×3次。采用二氨基聯(lián)苯氨(diaminobezidin, DAB)顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染2 min，沖洗10～15 min，然后進(jìn)行酒精脫水、二甲苯浸泡透明、中性樹膠封片和鏡檢。顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)，平均每張切片取10個(gè)視野，并計(jì)算其平均值。

八、腦組織氧化和炎癥指標(biāo)

大鼠造模后72 h被處死，迅速取腦，在冰上分離右側(cè)海馬組織，-80 ℃保存，將組織用生理鹽水勻漿后進(jìn)行蛋白提取及濃度測(cè)定。利用谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測(cè)其氧化和抗氧化水平，利用腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)測(cè)定其炎癥和抗炎水平。按照各檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行操作，試劑盒購自南京建成生物工程公司。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、神經(jīng)學(xué)功能評(píng)分

再灌注72 h時(shí)，各給藥組與模型組之間存在的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AST-IV和HSYA配伍組的評(píng)分顯著高于AST-IV組和HSYA組，說明配伍組在神經(jīng)功能作用改善方面優(yōu)于單用組(P<0.05)，如圖1A所示。

二、腦梗死面積變化

如圖1B所示(紅色為正常，白色為梗死灶)，假手術(shù)組沒有出現(xiàn)梗死灶，而模型組腦組織出現(xiàn)大片白色梗死灶。與模型組比較，給藥組的腦梗死灶面積明顯減少，說明AST-IV和HSYA的藥效物質(zhì)對(duì)腦神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，可以減輕腦梗死面積，而且配伍組對(duì)腦梗死的緩解作用顯著優(yōu)于AST-IV組和HSYA組。

圖1 各組模型動(dòng)物72 h腦損傷評(píng)估情況
Fig 1 Evaluation of brain injury at 72 h in five groups
A:Neurological deficit scores at 72 h (Each "。" symbol refers to one rat and horizontal line means median); B:Infarct volume measurement at 72 h.
aP<0.05,vsmodel group;bP<0.05,vsAST-IV+HSYA group.

三、病理學(xué)形態(tài)變化

HE染色結(jié)果顯示，模型組(B)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)與假手術(shù)組(A)相比出現(xiàn)異常，胞核固縮、深染，核仁不清楚。AST-IV組(C)和HSYA組(D)腦缺血再灌注72 h后，出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常，胞體和胞核固縮和深染，核仁不清楚，細(xì)胞周間隙增大，但與模型組比較，損傷較輕。AST-IV和HSYA配伍組(E)腦缺血再灌注72 h后，與藥物單用組(C、D)比較，細(xì)胞間隙縮小，細(xì)胞形態(tài)基本可辨，未出現(xiàn)大量神經(jīng)元死亡，如圖2所示。

四、氧化和炎癥指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組大鼠的SOD和GSH-Px活性顯著降低，TNF-α和IL-1β濃度增加(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，藥物預(yù)處理組SOD和GSH-Px活性顯著升高，TNF-α和IL-1β水平明顯減少(P<0.05)；與兩單用組進(jìn)行分組比較，發(fā)現(xiàn)配伍組的SOD和GSH-Px活性均顯著升高，而TNF-α和IL-1β水平明顯減少(P<0.05)；如表1所示。

五、腦組織CD31的表達(dá)差異

免疫組化染色結(jié)果顯示，各給藥組缺血再灌注72 h時(shí)，CD31陽性細(xì)胞表達(dá)與模型組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；再灌注72 h后，配伍組(E)與AST-IV組(C)和HSYA(D)組之間存在顯著差異(P<0.05)，如圖3所示。

GroupnSODU/mgGSH?PxU/mgTNF?αPg/mgIL?1βPg/mg Sham20153．5±11．473．1±7．47．6±1．315．5±1．2 Model1288．6±9．149．6±4．722．3±3．849．2±4．1 AST?IV16109．3±9．7ab69．8±7．5ab13．2±2．0ab31．6±3．8ab HSYA1497．9±13．5ab62．4±6．9ab14．7±2．7ab27．6±2．2ab AST?IV+HSYA18112．3±10．6a74．1±12．1a9．4±2．1a19．1±3．4a

aP<0.05,vsmodel group;bP<0.05,vsAST-IV+HSYA group.

圖2 腦皮層梗死區(qū)HE染色結(jié)果(×400)
Fig 2 The cerebral cortex infarction by HE staining (×400)
A:No histopathological abnormalities were observed in sham group; B:Most neurons in the damaged area in model group appeared shrunken and unclear; C, D:Decreased cell swelling and pyknotic nuclei took place in both AST-IV and HSYA groups; E:The most apparent reduction of cell swelling and pyknotic nuclei was observed in AST-IV+HSYA group.

圖3 腦皮層梗死區(qū)免疫組化染色CD31表達(dá)結(jié)果(×400)
Fig 3 The CD31 expression in the cerebral cortex infarction by immunohistochemical staining (×400)
A:Many CD31-positive cells were observed in sham group; B:Decreased number of CD31-positive cells was observed in model group; C, D:Increased number of CD31-positive cells was observed in both AST-IV group and HSYA group compared with model group; E:CD31-positive cells in AST-IV+HSYA group outnumbered that in both AST-IV group and HSYA group.

討 論

腦血管疾病是造成人類死亡的三大疾病之一，其中缺血性腦血管病占很大比例。腦缺血后神經(jīng)元能量衰竭、壞死，并出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[11]。再灌注引起大量的活性氧自由基釋放，同時(shí)刺激缺血區(qū)的炎癥細(xì)胞分泌多種炎性介質(zhì)，導(dǎo)致更多細(xì)胞損傷[12]。缺血性腦血管病在中醫(yī)學(xué)屬于中風(fēng)，活血化瘀的中藥可以通過改善抗炎和清除氧自由基促進(jìn)血管生成從而改善腦組織代謝，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[13]。

自從張伯禮院士等學(xué)者提出“以組分配伍來研制現(xiàn)代中藥”以來，中藥組分配伍不僅受到中醫(yī)藥學(xué)界的關(guān)注，而且成為目前方劑配伍研究的熱點(diǎn)。中藥組分配伍針對(duì)應(yīng)用廣泛、療效顯著的中藥或方劑進(jìn)行深入研究，在藥效成分和作用機(jī)制比較明確的前提下，選取中藥的有效部位或有效成分，運(yùn)用現(xiàn)代藥理技術(shù)對(duì)配伍組分進(jìn)行優(yōu)化篩選，最終獲得具有最佳治療效果的組成和配比。AST-IV和HSYA均對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，兩者主要作用機(jī)制雖有重疊，但在抗炎、抗氧化、促進(jìn)血管新生的相關(guān)靶通路存在差異，因此我們對(duì)兩組分單用及配伍抗腦缺血再灌注的作用進(jìn)行了對(duì)比研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，各給藥組大鼠的腦梗死面積比模型組明顯縮小，治療前后神經(jīng)功能缺失評(píng)分變化與模型組相比差異顯著；皮質(zhì)區(qū)的病理變化與模型組相比損傷較小，該結(jié)果與前期對(duì)AST-IV和HSYA兩種單體的諸多藥效學(xué)研究結(jié)果完全一致，而且藥物配伍組比單用組的療效更為顯著。此外，我們進(jìn)一步從抗氧化、抗炎、促進(jìn)血管新生三個(gè)方面對(duì)抗腦缺血損傷的藥效物質(zhì)從單用和配伍進(jìn)行了對(duì)比分析。SOD和GSH-Px作為生物體內(nèi)清除自由基的主要酶系[14]，其活性的高低反映了生物體自身清除氧自由基的能力。TNF-α和IL-1β是眾多細(xì)胞因子的重要啟動(dòng)因子，也是參與腦缺血再灌注損傷的重要炎癥細(xì)胞因子之一，可以作為腦缺血損傷炎癥標(biāo)志物。研究結(jié)果表明，配伍組在抗氧化和抗炎指標(biāo)改善方面比單用組更為顯著。細(xì)胞表面抗原CD31是很多造血祖細(xì)胞共有的細(xì)胞表面蛋白，當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)，CD31+細(xì)胞進(jìn)入外周循環(huán)后歸巢至損傷區(qū)域，促進(jìn)血管新生[15]，因此，外周血液及損傷組織中的CD31+細(xì)胞水平可以作為評(píng)估組織修復(fù)程度的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與單用組相比，配伍組可以顯著增加CD31表達(dá)，說明其在腦缺血后促進(jìn)血管新生方面能夠發(fā)揮協(xié)同增效的作用。

綜上所述，AST-IV和HSYA配伍組在大鼠腦缺血再灌注模型中對(duì)腦缺血再灌注損傷的治療作用明顯優(yōu)于AST-IV治療組和HSYA治療組，其協(xié)同機(jī)制與抗炎、抗氧化、促進(jìn)血管新生密切相關(guān)，證明了兩藥效物質(zhì)在改善腦卒中血瘀證方面存在“相須”和“相使”作用。雖然AST-IV和HSYA配伍對(duì)腦缺血再灌注損傷的治療作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但是本研究為黃芪紅花配伍治療缺血性腦血管病提供了新思路，為中藥大品種二次優(yōu)化升級(jí)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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ThesynergisticeffectsandmechanismofastragalosideIVandhydroxysaffloryellowAagainstcerebralischemiareperfusion

XUHang,DINGYi,LIUWenxing,LIUTianlong,WENAidong

DepartmentofPharmacy,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe effects and mechanism of astragaloside IV (AST-IV) and hydroxysafflor yellow A (HSYA) in combination against cerebral ischemia reperfusion in rats were studied.MethodsOne hundred Sprague Dawley rats were randomly divided into sham group, model group, AST-IV group, HSYA group and AST-IV+HSYA group. The model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) was established by thread ligation. Neurological system symptoms were evaluated at 72 h after ischemia reperfusion. The histopathological changes of brain tissues were stained with hematoxylin and eosin (HE) and the platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31) expression was detected via immunohistochemistry. The markers of oxidation and inflammation including superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) were examined.ResultsThe symptoms of neurological injury in treatment groups were improved significantly compared with those in model group. The expressions of CD31 were increased, the activities of SOD and glutathione peroxidase (GSH-Px) were improved, and the levels of TNF-α and IL-1β were decreased. Moreover, the most remarkable effect of treatment occurred in AST-IV and HSYA combination group.ConclusionAST-IV and HSYA in combination can exhibit obvious synergistic protective effects on ischemia reperfusion injury in rats, which is related to anti-inflammation, anti-oxidation and angiogenesis pathway.

Cerebral ischemia reperfusion; Astragaloside IV; Hydroxysafflor yellow A

1671-2897(2017)16-427-05

R 651

A

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373947)

許航，碩士研究生，E-mail:xuhang@fmmu.edu.cn

*通訊作者： 文愛東，教授、主任藥師，博士生導(dǎo)師，E-mail:adwen-2004@hotmail.com

2017-06-01；

2017-07-25)