郭丹 宋錦寧 尹倩雯

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院:1神經(jīng)外科, 2檢驗(yàn)科, 陜西 西安 710061)

·論著·

大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血清lincRNA-p21的變化水平研究

郭丹1宋錦寧1*尹倩雯2

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院:1神經(jīng)外科,2檢驗(yàn)科, 陜西 西安 710061)

目的動態(tài)監(jiān)測血清基因間長鏈非編碼RNA-p21 (lincRNA-p21)表達(dá)水平與急性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的相關(guān)性，從而為臨床早期診斷SAH提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法將105只SD雄性大鼠隨機(jī)分為SAH手術(shù)組(63只)、假手術(shù)組(21只)和正常對照組(21只)，采用頸內(nèi)動脈穿刺法制作SAH模型，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)檢測血清中l(wèi)incRNA-p21水平，于預(yù)定時(shí)間進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評估和干濕重法測定腦組織含水量。結(jié)果相對于正常對照組，急性SAH組在2～18 h lincRNA-p21表達(dá)呈下降趨勢(P<0.05)，18～48 h呈急劇上升趨勢后恢復(fù)至正常水平(P<0.05)，而0～2 h、48～72 h和假手術(shù)組相對于正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對神經(jīng)行為學(xué)評分、腦組織含水量與lincRNA-p21表達(dá)相關(guān)性分析結(jié)果顯示神經(jīng)行為學(xué)(P=0.924)和腦組織含水量(P=0.224)均與lincRNA-p21表達(dá)無相關(guān)性。結(jié)論血清lincRNA-p21的表達(dá)水平可以作為急性蛛網(wǎng)膜下腔出血潛在的生物學(xué)診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)，但不能作為病情嚴(yán)重程度指標(biāo)。

蛛網(wǎng)膜下腔出血; 基因間長鏈非編碼RNA-p21; 血清

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是指各種病因?qū)е碌哪X底或腦及脊髓表面血管發(fā)生病變而突然破裂，血液直接進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的統(tǒng)稱，是一類非常嚴(yán)重的腦卒中亞型，主要發(fā)病年齡在50～60歲人群[1]，具有很高的發(fā)病率和死亡率。早期預(yù)測診斷可以提高SAH患者的生存率并能夠改善長期預(yù)后，目前主要依賴影像學(xué)技術(shù)，尚無有效預(yù)測SAH的血液生化檢測指標(biāo)，因?yàn)檠荷瘷z查的快速方便費(fèi)用低的優(yōu)勢，臨床上迫切需要尋找能夠早期診斷SAH并有較高敏感性及特異性的新的生物標(biāo)志物作為輔助診斷技術(shù)，提高SAH診斷的準(zhǔn)確性。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)和基因間長鏈非編碼RNA (long intergenic non-coding RNAs, lincRNAs)是近年來被發(fā)現(xiàn)的。WU等[2]發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21參與血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程，參與血管內(nèi)膜增生，平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡等過程。SAH后p53在缺氧等多種因素作用下被激活，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[3]，促進(jìn)靶基因p53上調(diào)的凋亡調(diào)節(jié)物(p53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA)的表達(dá)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生血管痙攣[4]。Huarte等[5]首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一種與p53表達(dá)關(guān)系最為密切的lncRNA、lincRNA-p21、p53可直接結(jié)合于lincRNA-p21的上游調(diào)控區(qū)并正調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平。由此我們設(shè)想lincRNA-p21可能也參與了SAH疾病的發(fā)生發(fā)展過程，并且lncRNA可以形成相對穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)可以在體液(如血液、尿液)中被監(jiān)測到，因此本研究主要通過檢測血清中l(wèi)incRNA-p21的表達(dá)水平來探討與急性蛛網(wǎng)膜下腔出血之間的臨床意義。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康成年雄性SD大鼠105只，質(zhì)量在280～330 g之間，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，24 h晝夜循環(huán)光照，術(shù)前術(shù)后自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)動物倫理已經(jīng)過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物倫理委員會批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分組，SAH組63只，假手術(shù)組21只，正常對照組21只。

二、主要試劑和儀器

無水乙醇、氯仿、異丙醇、焦碳酸二乙酯 (diethylpyrocarbonate, DEPC)處理的水、RNAiso Plus (TaKaRa, 日本)試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, 日本) 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM II (TaKaRa, 日本)試劑盒、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)〔GAPDH(內(nèi)參照物)：上游引物GGGAAATTCAACGGCACAGT；下游引物:AGATGGTGATGGGCTTCCC，華大基因；特異性lincRNA-p21：上游引物CCTGTCCACTCGCTTTC；下游引物GGAACTGGAGACGGAATGTC，華大基因〕。

三、主要儀器

低溫離心機(jī)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀、UV-Vis Spectrophotometer。

四、模型制作

SAH模型組采用PRUNELL等[6]文獻(xiàn)中的方法，暴露右側(cè)頸總動脈分叉處，分離頸外動脈然后用血管夾阻斷血流，從頸總動脈分叉處插入3-0單股尼龍線進(jìn)入頸內(nèi)動脈長度約18～20 mm時(shí)感覺有阻力再進(jìn)入約3 mm刺穿大腦前動脈和中動脈，停留15 s左右拔出，關(guān)閉縫合。假手術(shù)組除了不刺破血管外，其余操作均與SAH模型組相同。SAH組和假手術(shù)組的每只大鼠按照實(shí)驗(yàn)安排，均于術(shù)后的不同時(shí)間段經(jīng)左心室灌注生理鹽水及40 g/L多聚甲醛后取腦，觀察腦組織大體標(biāo)本的變化。

五、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)分組、取血：模型制作成功后，按照表1設(shè)置的時(shí)間段隨機(jī)分組，然后開胸心臟取血。

表1 105只SD雄性大鼠心臟取血時(shí)間分組
Tab 1 Different groups of 105 SD male rats according to the time of taking blood from heart

Groups0～2h2～6h6～12h12～18h18～24h28～48h48～72h SAH9999999 Sham3333333 Normal3333333

2.提取血清：采集完血液室溫靜置30 min后放入4 ℃冰箱靜置冷藏過夜，隨后室溫下3000 r/min離心15 min，將上層血清轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管內(nèi)，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.血清總RNA提?。喊凑誖NAiso Plus試劑盒的說明操作。

4.去除基因組DNA：將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明操作。

5.lincRNA-p21熒光定量檢測：按照TaKaRa Ex Taq HS試劑盒說明操作。分三步法擴(kuò)增反應(yīng)，預(yù)變性：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用比較閾值法，目的基因的量=2-ΔΔCt計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組lincRNA-p21的表達(dá)差異。

六、大鼠神經(jīng)行為評分

根據(jù)Loeffler的五分制評分法[7]對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分：當(dāng)抓大鼠背部能正常運(yùn)動且在5 s內(nèi)翻身，評分5分；5 s內(nèi)能翻身，但是自主運(yùn)動減少，評分4分；3分為>5 s翻身；2分為不能翻身；1分無自主運(yùn)動。因SAH模型完成后的2 h內(nèi)大多數(shù)大鼠麻醉未清醒，故0～2 h時(shí)間段未進(jìn)行神經(jīng)行為評分。

七、腦含水量的檢測

按照實(shí)驗(yàn)安排的不同時(shí)間段，術(shù)后深度麻醉后迅速開顱取腦，取其中一半腦組織用電子分析天平稱取濕重，然后置于60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)，烘烤至恒重(兩次重量差≤0.2 mg)，稱取干重。腦組織含水量按以下公式計(jì)算：腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、腦組織大體標(biāo)本

假手術(shù)組腦大體形態(tài)未見異常(圖1B)，SAH大鼠模型取材后可見腦組織均有不同程度的水腫，腦底Willis環(huán)附近有明顯的出血灶(圖1A)。

二、各組大鼠lincRNA-p21 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果、神經(jīng)行為學(xué)評分和腦組織含水量的比較

結(jié)果顯示相對正常對照組，lincRNA-p21的表達(dá)0～2 h無變化，從2 h開始下降持續(xù)至18 h，從18 h后表達(dá)急劇升更高，隨后逐漸下降，在48 h趨于正常對照組水平持續(xù)到72 h，而假手術(shù)組的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 SAH模型組(A)和假手術(shù)組(B)大鼠腦大體標(biāo)本形態(tài)
Fig 1 General morphological changes of the brain after SAH in SAH group and sham group
A:Brain general specimen in SAH group; B:Brain general specimen in sham group.

圖2 實(shí)時(shí)PCR法檢測在不同時(shí)間點(diǎn)lincRNA-p21的相對表達(dá)量與正常對照組比較
Fig 2 Comparison of the relative expression of lincRNA-p21 at different time points between experimental group and sham group detected by RT-PCR
aP<0.05,vssham group.

檢驗(yàn)各組正態(tài)性和方差齊性顯示lincRNA-p21ΔCt值、神經(jīng)行為學(xué)評分和腦組織含水量比較均符合正態(tài)性和方差齊性(P=0.515、0.392和0.282)。LSD-t檢驗(yàn)說明相對于正常對照組，2～6、6～18、18～24和24～48 h時(shí)間段ΔCt值表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，假手術(shù)組和正常對照組之間無顯著差異(P>0.05，表2)；SAH模型組的動物在建模后均出現(xiàn)不同程度的嗜睡、意識模糊、活動飲食減少等癥狀，神經(jīng)行為學(xué)評分顯示從2 h開始到72 h的評分相對于正常對照組均有顯著下降(P<0.05)；各組腦組織含水量的比較發(fā)現(xiàn)6～12、12～18、18～24、24～48、48～72 h時(shí)間段含水量相對正常對照組均顯著升高(P<0.05)，且腦組織含水量在24～48 h時(shí)間段的表達(dá)最高(圖2)。對神經(jīng)行為學(xué)和腦組織含水量與lincRNA-p21ΔCt值之間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示神經(jīng)行為學(xué)(r=0.15,P=0.924)和腦組織含水量(r=0.31,P=0.224)與lincRNA-p21ΔCt值之間均無直接關(guān)系。

GroupsΔCtvalueNeurologicalscoresBWC(%) 0～2h7．52±0．70—78．19±0．75 2～6h10．17±0．70a2．88±0．07a78．32±0．84 6～12h11．02±0．94a2．80±0．22a79．64±0．38a 12～18h10．37±1．30a2．81±0．23a80．74±0．91a 18～24h4．90±1．16a2．45±0．37a81．33±0．89a 24～48h5．14±0．26a2．74±0．18a83．45±1．02a 48～72h7．03±0．833．43±0．06a80．81±0．55a Sham7．61±0．884．95±0．1277．60±0．63 Normal7．66±0．584．97±0．0977．56±0．24

aP<0.05,vssham group and normal control group.

討 論

蛛網(wǎng)膜下腔出血后病理生理過程為血腦屏障破壞、血管痙攣、微血栓形成和血管自動調(diào)節(jié)受損等表現(xiàn)[8]。本項(xiàng)研究是首次發(fā)現(xiàn)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血清中能夠檢測到lincRNA-p21的表達(dá)，并且lincRNA-p21表達(dá)的變化與SAH后不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)，但是與大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分和腦組織含水量并無直接的關(guān)系，表明血清lincRNA-p21可能作為急性SAH潛在的生物學(xué)診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)，但與病情的嚴(yán)重程度并不相關(guān)。

lincRNA-p21最早是在2010年被發(fā)現(xiàn)的，作為轉(zhuǎn)錄因子p53下游的一個(gè)靶基因，其轉(zhuǎn)錄受到p53的正性調(diào)控。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，lincRNA-p21的1-778nt區(qū)域可直接結(jié)合于核內(nèi)不均一核糖核蛋白成員hn RNP-K，進(jìn)而作為p53的輔助因子調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[9]。也有研究報(bào)道了lincRNA-p21可以與下游靶基因的mRNA結(jié)合以調(diào)控轉(zhuǎn)錄[10]。之前對lincRNA-p21在血管系統(tǒng)疾病的研究主要集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，可以在體內(nèi)外抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[11]，與心血管系統(tǒng)有著密切的關(guān)系[12]。當(dāng)發(fā)生腦缺血后[13]，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的的lncRNA表達(dá)譜出現(xiàn)不同程度的上調(diào)或下調(diào)，腦出血后腦組織的lncRNA表達(dá)譜出現(xiàn)也出現(xiàn)改變。Yan等[3]的研究結(jié)果顯示，在大鼠SAH后24 h，海馬的小血管內(nèi)皮細(xì)胞中p53表達(dá)顯著增加，DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)染色發(fā)現(xiàn)有大量內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)伴隨有嚴(yán)重的血腦屏障損傷和腦水腫；當(dāng)抑制p53的表達(dá)后內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡明顯減輕，腦水腫緩解。Cahill等[4]研究表明在大鼠SAH后，皮質(zhì)及海馬內(nèi)神經(jīng)元的p53被活化且參與了神經(jīng)元的凋亡，這可能與以后神經(jīng)后遺癥相關(guān)，而抑制p53活性可使腦內(nèi)神經(jīng)元的凋亡顯著減少、死亡率的下降和神經(jīng)學(xué)評分的好轉(zhuǎn)。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示lincRNA-p21的表達(dá)與SAH相關(guān)，說明lincRNA-p21可能也參與了SAH疾病發(fā)生發(fā)展過程，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測結(jié)果顯示正常情況下大鼠的血清中有一定lincRNA-p21的表達(dá)，并且它的表達(dá)量相對穩(wěn)定。隨著SAH發(fā)生后時(shí)間的推移，lincRNA-p21的表達(dá)出現(xiàn)先下降后上升最后恢復(fù)至正常對照組的水平，可以看出隨著出血時(shí)間的變化，lincRNA-p21的表達(dá)也相應(yīng)出現(xiàn)顯著改變。據(jù)此，我們可以認(rèn)為lincRNA-p21在急性蛛網(wǎng)膜下腔出血后的2～48 h內(nèi)可以作為潛在診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)，并且可以根據(jù)lincRNA-p21表達(dá)量初步判斷出血的時(shí)間，但是并不能作為病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)，為臨床治療提供一定的證據(jù)，做到早發(fā)現(xiàn)早治療，改善疾病的預(yù)后，提高患者生存質(zhì)量，減輕家庭及社會負(fù)擔(dān)。

總而言之，本項(xiàng)研究的結(jié)果表明lincRNA-p21可以在急性蛛網(wǎng)膜下腔出血后的2～48 h內(nèi)作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志，并有機(jī)會成為潛在的治療靶點(diǎn)。但是我們對于lncRNA的認(rèn)識還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，機(jī)制方面也不夠明確，但是我們相信lncRNA會在未來的醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要的作用，lncRNA作為疾病的生物學(xué)標(biāo)志和治療靶點(diǎn)有望應(yīng)用于臨床。

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ChangesofserumlevelsoflincRNA-p21inratsaftersubarachnoidhemorrhage

GUODan1,SONGJinning1,YINQianwen2

1DepartmentofNeurosurgery;2DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospital,MedicalSchoolofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710061, China

ObjectiveDynamic monitoring of the correlation between the expression of serum long intergenic non-coding RNA-p21 (lincRNA-p21) and acute subarachnoid hemorrhage (SAH) was performed to provide a reliable laboratory basis for early clinical diagnosis of SAH.MethodsTotally 105 adult male SD rats were randomly divided into SAH group (63 cases), sham group (21 cases) and normal control group (21 cases). SAH was induced via intracranial endovascular perforation, and the levels of lincRNA-p21 in serum were measured by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The neurological assessment and wet weight of brain tissue were measured in each group for a predetermined period of time.ResultsCompared with normal control group, the expression of lincRNA-p21 in SAH group was decreased at 2～18 h (P<0.05), and showed a trend of rising sharply at 18 h and then it returned to normal level at 48 h (P<0.05). But there was no significant difference between 0～2 h, 48～72 h, sham group and normal control group (P>0.05). The correlation between neurobiological behavior, brain tissue water content and lincRNA-p21 expression showed no correlation between neurobehavioral (P=0.924) and brain tissue water content (P=0.224).ConclusionThe expression level of serum lincRNA-p21 can be used as a potential biomarker and therapeutic target for acute subarachnoid hemorrhage, but can not be used as a severity index.

Subarachnoid hemorrhage; Long intergenic non-coding RNA-p21; Serum

1671-2897(2017)16-412-05

R 651

A

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30471774)；陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2003C1-16)

郭丹，碩士研究生，E-mail:danguo525@126.com

*通訊作者： 宋錦寧，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail:jinningsong@126.com

2017-06-02；

2017-07-18)