毛崇丹 甄恩迪 劉陽(yáng)陽(yáng) 張海峰 郝廣志 董玉書(shū)

(1錦州醫(yī)科大學(xué)沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121001; 2沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

·論著·

褪黑激素抑制NLRP3炎性小體減輕小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷

毛崇丹1甄恩迪1劉陽(yáng)陽(yáng)1張海峰2郝廣志2董玉書(shū)2*

(1錦州醫(yī)科大學(xué)沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121001;2沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

目的探討褪黑素通過(guò)調(diào)節(jié)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥復(fù)合體(NLRP3)對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷(EBI)的保護(hù)作用和機(jī)制。方法建立小鼠頸動(dòng)脈線穿法SAH模型，分為假手術(shù)組、假手術(shù)+溶劑組、SAH+溶劑組和SAH+褪黑素組四組，進(jìn)行SAH出血量評(píng)級(jí)和小鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，腦組織水含量測(cè)定腦水腫，伊文思藍(lán)法測(cè)定血腦屏障(BBB)通透性，檢測(cè)腦丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平，神經(jīng)核抗原(NeuN)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)檢測(cè)神經(jīng)元存活和死亡率，Western Blot檢測(cè)腦凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥復(fù)合體 (NLRP3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl2)、前凋亡因子(Bim)和活化的caspase-1蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)腦中細(xì)胞因子白介素-1β (IL-1β)和白介素-6 (IL-6)水平。結(jié)果槲皮素可以提高SAH小鼠生存率，降低神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，減少腦神經(jīng)元凋亡，提高腦谷胱甘肽(GSH)水平，降低丙二醛(MDA)水平，減輕腦水腫和BBB通透性損害。槲皮素可以降低NLRP3以及細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)的表達(dá)，抑制IL-1β、IL-6的分泌和活化的caspase-1的蛋白表達(dá)，并可以增高抗凋亡因子Bcl2的表達(dá)，降低凋亡前體因子Bim的表達(dá)。結(jié)論槲皮素通過(guò)抑制NLRP3炎性相關(guān)的凋亡來(lái)減輕SAH后的EBI。

褪黑素; 蛛網(wǎng)膜下腔出血; 早期腦損傷; 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥復(fù)合體

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后早期腦損傷(early brain injury, EBI)對(duì)預(yù)后關(guān)鍵，而炎性反應(yīng)介導(dǎo)的凋亡是其中的重要機(jī)制[1]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥復(fù)合體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3, NLRP3)是一種炎性相關(guān)分子，促進(jìn)白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和白介素-18(interleukin-18, IL-18)的分泌以及凋亡進(jìn)程，與心血管、神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病相關(guān)[2]。褪黑素是松果體分泌的內(nèi)源性最強(qiáng)效抗炎抗氧化物質(zhì)，在SAH中也顯示出腦保護(hù)作用[3]。然而，在SAH的EBI中，褪黑色素是否通過(guò)NLRP3來(lái)抑制炎癥和凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用并不清楚，本研究就此問(wèn)題在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)做一探索。

材料與方法

一、對(duì)象和材料

清潔級(jí)體重為26～30 g雄性C57BL/6J小鼠(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)；槲皮素、NLRP3(Sigma-Aldrich)；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated specklike, ASC)、白介素-1β(interleukin-1, IL-1β)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl2)、前凋亡因子(pro-apoptotic Bc1-2, Bim)，活化的caspase-1抗體(Santa Cruz)；神經(jīng)原核原(neuronal nuclear antigen, NeuN)抗體(Millipore)。

二、分組及給藥

將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、假手術(shù)+溶劑組、SAH+溶劑組和SAH+褪黑素組四組，每組8只。槲皮素溶液以150 mg/kg劑量配制，在小鼠SAH模型建立后的2 h，實(shí)驗(yàn)組以5 mL/kg的劑量腹腔注射槲皮素，對(duì)照組以相同劑量的槲皮素溶劑注射。

三、建立模型

雄性C57BL6/J小鼠用4.6%異氟烷混合氣體麻醉。頸部中線切開(kāi)，暴露右頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，將5-0尼龍線插入頸總動(dòng)脈，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈至Willis環(huán)處，有阻力感后再插入3 mm穿破血管致SAH，迅速將尼龍線拔出，縫合皮膚。

四、檢測(cè)指標(biāo)

1.SAH分級(jí)評(píng)估：根據(jù)基底池六個(gè)層面SAH量[4]，分為0、1、2、3分，0分為未見(jiàn)SAH，1分為少量的SAH，2分為基底池血塊但尚可見(jiàn)到血管，3分為血塊多覆蓋血管，總的評(píng)分為0～18分。

2.神經(jīng)功能評(píng)分：根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道[4]，評(píng)價(jià)神經(jīng)功能，包括四肢運(yùn)動(dòng)，上肢、伸展性、攀爬能力、側(cè)面攀附能力和觸覺(jué)能力6個(gè)方面的測(cè)試。

3.腦組織水含量檢測(cè)：先測(cè)腦組織的濕重，置于105 ℃干燥環(huán)境中48 h，直到重量不再變化，每個(gè)腦的水含量測(cè)試如下：(濕重-干重)/濕重 × 100%。

4.BBB通透性分析：手術(shù)后48 h按4 mL/kg腹腔注射伊文思藍(lán)，取腦，以15 000 r/min離心30 min后將0.5 mL上清液加入等體積50%三氯乙酸，隔夜孵育后再次離心30 min，取上清液，用分光光度計(jì)測(cè)定620 nm處吸光度值。

5.各組腦組織丙二醛(malondialdehyde, MDA)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)水平檢測(cè)：150 mM的KCl溶液勻漿腦樣品用來(lái)測(cè)定MDA和GSH水平，用試劑盒測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)的MDA，以及測(cè)定GSH水平。

6.NeuN和TUNEL檢測(cè)：在IR模型48 h 后深麻小鼠取腦，石蠟包埋，5 μm冠狀切片，取背側(cè)海馬區(qū)域，用兔抗NeuN抗體(1∶100)在4 ℃過(guò)夜孵育，在室溫下與結(jié)合Alexa 488的山羊抗兔抗體(1∶200)處理2 h，TUNEL染色按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，細(xì)胞存活指數(shù)和凋亡指數(shù)為藍(lán)染細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比率×100%。

7.Western Blot蛋白檢測(cè)：在SAH模型48 h 后斷頭處死小鼠，取腦皮層，提取總蛋白和核蛋白，蛋白定量，轉(zhuǎn)膜，脫脂，加入一抗ASC、IL-1β(1∶500)，NLRP3、Bcl2、Bim、活化的caspase-1和β-actin(1∶1000)在4 ℃過(guò)夜，次日TBST洗脫，加入相應(yīng)二抗IgG(1∶5000)，孵育1 h 后，TBST 洗脫，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在Tanon凝膠圖像處理系統(tǒng)顯影。

8.細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)：IL-1β和IL-6用ELISA試劑盒檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各吸光度值，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

五、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、SAH出血量分級(jí)評(píng)估及神經(jīng)功能評(píng)分變化

SAH+溶劑組的評(píng)估分為13(12～15)分，SAH+褪黑素的評(píng)估分為13(11～15)分，兩組無(wú)顯著性差別(P>0.05)(圖1A)，說(shuō)明褪黑素治療并不能改變SAH的出血量分級(jí)。假手術(shù)組和假手術(shù)+溶劑組的神經(jīng)功能評(píng)分相似，但比SAH+溶劑組顯著增高(P<0.05)，SAH+褪黑素組的神經(jīng)功能評(píng)分比SAH+溶劑組要高(P<0.05)(圖1B)，說(shuō)明褪黑素可以減輕SAH導(dǎo)致的神經(jīng)功能損害。

二、各組腦水腫和BBB通透性變化

SAH+溶劑組的腦組織水含量升高(P<0.05)，SAH +褪黑素組比SAH+溶劑組低(P<0.05)(圖2A)，說(shuō)明褪黑素有減輕SAH后腦水腫的作用。SAH+溶劑組伊文思藍(lán)含量升高(P<0.05)，SAH+褪黑素組比SAH+溶劑組低(P<0.05)(圖2B)，說(shuō)明褪黑素有降低SAH后BBB通透性破壞的作用。

圖1 各組SAH出血量分級(jí)評(píng)估及神經(jīng)功能評(píng)分變化
Fig 1 Changes of SAH grades and neurological scores in different groups
A:SAH grade assay; B:The effect of melatonin on neurological scores.
aP<0.05,vsSham group;bP<0.05,vsSham+vehicle group,cP<0.05,vsSAH+vehicle group.

圖2 各組腦水腫和BBB通透性變化
Fig 2 Changes of brain edema and BBB permeability in different groups
A:The brain water content assay; B:The Evans blue extravasation assay.
aP<0.05,vsSham group;bP<0.05,vsSham+vehicle group;cP<0.05,vsSAH+vehicle group.

圖3 各組腦GSH和MDA水平變化
Fig 3 Changes of brain GSH and MDA levels in different groups
A:The brain GSH level; B:The brain MDA level.
aP<0.05,vsSham group;bP<0.05,vsSham + vehicle group;cP<0.05,vsSAH + vehicle group.

三、各組腦GSH和MDA水平變化

SAH+溶劑組的GSH水平顯著降低(P<0.05)，SAH+褪黑素組的GSH水平比SAH+溶劑組要高(P<0.05)(圖3A)。SAH+溶劑組的MDA水平升高(P<0.05)，SAH+褪黑素組MDA水平比SAH+溶劑組低(P<0.05)(圖3B)。

四、各組腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡和存活率變化

TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率在SAH+溶劑組升高(P<0.05)，SAH+褪黑素組比SAH+溶劑組低(P<0.05，圖4A、4B)，說(shuō)明褪黑素可降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡損害。NeuN陽(yáng)性細(xì)胞率在SAH+溶劑組下降(P<0.05)，SAH+褪黑素組比SAH+溶劑組要高(P<0.05，圖4C、4D)，說(shuō)明褪黑素可以提高神經(jīng)細(xì)胞存活能力。

五、各組腦NLRP3及凋亡相關(guān)分子的蛋白表達(dá)變化

NLRP3及其下游分子表達(dá)在SAH+溶劑組增高(P<0.05)，但在SAH+褪黑素組下降(P<0.05)(圖5A～E)，說(shuō)明褪黑素可抑制NLRP3炎性小體等分子表達(dá)。

抑制凋亡分子Bcl2蛋白表達(dá)在SAH +溶劑組下降(P<0.05)，但SAH+褪黑素組，比SAH+溶劑組升高(P<0.05)，促進(jìn)凋亡的分子Bim和caspase-3表達(dá)在SAH+溶劑組升高(P<0.05)，但在SAH+褪黑素組，比SAH+溶劑組降低(P<0.05)(圖5F～I(xiàn))。

六、各組腦細(xì)胞因子IL-1β和IL-6水平變化

與假手術(shù)組和假手術(shù)+溶劑組相比，SAH+溶劑組的IL-1β和IL-6水平升高(P<0.05)，SAH+褪黑素組的IL-1β和IL-6水平比SAH+溶劑組低(P<0.05，圖6)，說(shuō)明褪黑素可以抑制炎癥相關(guān)細(xì)胞因子分泌。

圖4 各組腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡和存活率變化
Fig 4 Changes of cerebral neuron apoptotic and survival ratio in different groups
A, B:The cerebral neuron apoptotic ratio; C, D:The cerebral neuron survival ratio.
aP<0.05,vsSham group;bP<0.05,vsSham+vehicle group;cP<0.05,vsSAH+vehicle group.
Scale bar=100 μm.

圖5 各組腦NLRP3及凋亡相關(guān)分子的蛋白表達(dá)變化
Fig 5 Changes of cerebral NLRP3 and apoptotic molecules protein expression in different groups
A～E:The cerebral NLRP3, ASC, cleaved caspase-1, and IL-1β protein expression; F～I(xiàn):The cerebral Bcl2, Bim, and caspase-3 protein expression.
aP<0.05,vsSham group;bP<0.05,vsSham+vehicle group;cP<0.05,vsSAH+vehicle group.

圖6 各組腦細(xì)胞因子IL-1β和IL-6水平變化
Fig 6 Changes of brain cytokine IL-1 βand IL-6 level in different groups
aP<0.05,vsSham group;bP<0.05,vsSham+vehicle group;cP<0.05,vsSAH+vehicle group.

討 論

褪黑素除了調(diào)節(jié)生理節(jié)律，還有強(qiáng)大的抗炎抗凋亡作用，并且褪黑素具有易吸收性，可以輕松通過(guò)BBB、胎盤(pán)等各種形態(tài)生理屏障，以及低毒性的特點(diǎn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)抑制炎癥和細(xì)胞凋亡，發(fā)揮了腦保護(hù)作用[5]，研究也顯示褪黑激素通過(guò)抗炎抗氧化機(jī)制減輕SAH后腦損害[6]。本研究顯示褪黑激素可以提高小鼠SAH后的生存率和神經(jīng)細(xì)胞的存活率，增加腦GSH水平，減少腦神經(jīng)元凋亡，降低MDA水平，減輕腦水腫和BBB通透性損害，發(fā)揮了腦保護(hù)作用。

本研究對(duì)褪黑素在SAH后發(fā)揮腦保護(hù)作用的具體分子機(jī)制做了進(jìn)一步探索。NLRP3炎癥小體可以促進(jìn)IL-1β和IL-18的分泌，其激活參與腦膜炎，帕金森病和谷氨酸相關(guān)性腦損傷的神經(jīng)疾病的進(jìn)展[7]，尤其在缺血和出血的腦血管病中，NLRP3炎癥小體的激活與腦損傷明顯相關(guān)，抑制其表達(dá)則可以起到神經(jīng)保護(hù)作用。在大腦中動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)的局灶缺血模型中，下調(diào)NLRP3的表達(dá)，可以抑制IL-1β的自分泌/旁分泌，減輕腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)毒性，從而減少腦梗死體積和BBB通透性損傷[8]。在腦出血模型中，NLRP3炎癥小體通過(guò)促進(jìn)IL-1β分泌和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)引發(fā)炎癥反應(yīng)，其受抑制或下調(diào)后神經(jīng)功能障礙得到改善[9]。本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)褪黑素通過(guò)抑制NLRP3的激活，下調(diào)細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。

細(xì)胞凋亡是生物體多細(xì)胞發(fā)生程序性死亡的過(guò)程，具有胞體起泡、皺縮、核碎裂、染色質(zhì)聚集、DNA斷裂和mRNA降解的特征性改變，有研究表明，腦出血后血腫周圍組織中細(xì)胞凋亡率明顯增高[10]?？辜?xì)胞凋亡是褪黑激素神經(jīng)保護(hù)作用的另一重要方面。在本研究中，褪黑激素也顯示出抗SAH后神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用，其機(jī)制涉及促凋亡分子Bim的抑制和抑凋亡分子Bcl2的激活，在SAH中，NLRP3活化和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致EBI發(fā)生，但褪黑激素可以阻止腦損害進(jìn)展。然而，NLRP3是否介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，它與促凋亡分子Bim和抑凋亡分子Bcl2之間的平衡，仍需進(jìn)一步研究。

1LUCKE-WOLD B P, LOGSDON A F, MANORANJAN B, et al. Aneurysmal subarachnoid hemorrhage and neuroinflammation:a comprehensive review [J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(4):497.

2FANN D Y, SANTRO T, MANZANERO S, et al. Intermittent fasting attenuates inflammasome activity in ischemic stroke [J]. Exp Neurol, 2014, 257:114-119.

3ZHANG H M, ZHANG Y. Melatonin:a well-documented antioxidant with conditional pro-oxidant actions [J]. J Pineal Res, 2014, 57(2):131-146.

4ALTAY O, SUZUKI H, HASEGAWA Y, et al. Isoflurane attenuates blood-brain barrier disruption in ipsilateral hemisphere after subarachnoid hemorrhage in mice [J]. Stroke, 2012, 43(9):2513-2516.

5YANG Y, JIANG S, DONG Y, et al. Melatonin prevents cell death and mitochondrial dysfunction via a SIRT1-dependent mechanism during ischemic-stroke in mice [J]. J Pineal Res, 2015, 58(1):61-70.

6丁可, 李桃, 文立利, 等. 褪黑素抑制腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2015, 14 (6):501-504.

7LU M, SUN X L, QIAO C, et al. Uncoupling protein 2 deficiency aggravates astrocytic endoplasmic reticulum stress and nod-like receptor protein 3 inflammasome activation [J]. Neurobiol Aging, 2014, 35(2):421-430.

8YANG F, WANG Z, WEI X, et al. NLRP3 deficiency ameliorates neurovascular damage in experimental ischemic stroke [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2014, 34(4):660-667.

9YANG Z, ZHONG L, XIAN R, et al. MicroRNA-223 regulates inflammation and brain injury via feedback to NLRP3 inflammasome after intracerebral hemorrhage [J]. Mol Immunol, 2015, 65(2):267-276.

10韓玉梁, 鮑剛, 郭世文, 等. 人腦出血后proNGF、sortilin的表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2015, 14 (6):501-504.

MelatoninrelievedearlybraininjurybyNLRP3pathwayinthemousemodelofsubarachnoidhemorrhage

MAOChongdan1,ZHENEndi1,LIUYangyang1,ZHANGHaifeng2,HAOGuangzhi2,DONGYushu2

1DepartmentofNeurosurgery,GraduateTrainingBaseoftheGeneralHospitalofShenyangMilitaryAreaCommand,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001;2DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang110016, China

ObjectiveThe protective effects of melatonin against early brain injury (EBI) induced by subarachnoid hemorrhage (SAH) was explored and the potential mechanisms via regulating nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome was elucidated.MethodsMice subjected to SAH model were divided into four groups:Sham group, Sham+vehicle group, SAH+vehicle group and SAH+melatonin group. SAH grade and neurological function scores were assayed. The degree of cerebral edema was evaluated by the water content of brain tissue. The permeability of blood brain barrier was determined by Evas-blue staining method. Malondialdehyde and glutathione were measured. The ratio of surviving and apoptotic neurons were detected by neuronal nuclear antigen (NeuN) and TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay. The protein expression of apoptosis-associated speck-like protein containing apoptosis-associated specklike protein (ASC), interleukin-1β (IL-1β), NLRP3, B-cell lymphoma-2 (Bcl2), pro-apoptotic Bc1-2 proteins (Bim) and active caspase-1 was detected by Western Blot. Cytokines IL-1β and interleukin-6 (IL-6) was measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsMelatonin increased survival rate, as well as elevated neurological score, greater survival of neurons, preserved brain glutathione levels and reduced brain edema, malondialdehyde concentrations, apoptotic ratio, and blood brain barrier (BBB) disruption. Melatonin also attenuated the expressions of NLRP3, ASC, cleaved caspase-1, IL-1β, and IL-6; these changes were also associated with an increase in the anti-apoptotic factor (Bcl2) and reduction in the pro-apoptotic factor (Bim).ConclusionMelatonin treatment attenuates the EBI following SAH by inhibiting NLRP3 inflammasome-associated apoptosis.

Melatonin; Subarachnoid hemorrhage; Early brain injury; Nucleotide binding and oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3

1671-2897(2017)16-417-05

R 743.35; R 651.1

A

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助項(xiàng)目(81671313, 81671174)；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目一等資助項(xiàng)目(2016M592951)；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃面上項(xiàng)目資助項(xiàng)目(2015020438)

毛崇丹，碩士研究生，E-mail:1248980726@qq.com

*通訊作者： 董玉書(shū)，副教授、副主任醫(yī)師，博士后，碩士生導(dǎo)師，E-mail:156258128@qq.com

2017-01-10；

2017-03-20)