王淑為 張劍寧 劉爽 趙虎林

(海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100048)

·小兒神經(jīng)外科疾病的診斷與治療·

CDC6在顱咽管瘤中表達(dá)及靶向CDC6 RNAi抑制腫瘤細(xì)胞增殖的研究

王淑為 張劍寧 劉爽 趙虎林*

(海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100048)

目的研究真核細(xì)胞中細(xì)胞分裂周期蛋6(CDC6)與顱咽管瘤(CP)的相關(guān)性，探討其對CP細(xì)胞的生物學(xué)作用。方法免疫組化法檢測CP標(biāo)本中CDC6的表達(dá)情況，并合成CDC6小的干涉核糖核酸 (siRNA)片段，轉(zhuǎn)染CP細(xì)胞。用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測干擾CDC6表達(dá)后CP細(xì)胞生長水平，繪制細(xì)胞生長曲線。同時應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞周期。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示在正常腦組織與CP組織中CDC6表達(dá)存在明顯差異，而生長曲線顯示下調(diào)CDC6的表達(dá)之后，CP細(xì)胞增殖變慢，曲線變緩，與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比細(xì)胞生長被明顯抑制。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的脫氧核糖核酸合成后期(G2)明顯縮短，提前進(jìn)入合成(M)期。結(jié)論CDC6在CP細(xì)胞中表達(dá)量較正常細(xì)胞高，而且參與了CP細(xì)胞的增殖調(diào)控。

CDC6; CP; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞周期

顱咽管瘤(craniopharyngioma, CP)是一種生長緩慢的先天性表皮源性腫瘤，常位于鞍區(qū)。是顱內(nèi)最常見的腫瘤之一，在兒童鞍區(qū)腫瘤中，CP約占60%以上。其臨床表現(xiàn)出侵襲性生長的生物學(xué)行為，治療效果不佳，并發(fā)癥多，容易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量和存活時間[1]。在過去的150多年來，眾多學(xué)者對CP進(jìn)行了廣泛的研究，但主要集中在治療方面，而基礎(chǔ)研究極少，使人們對CP分子水平和生物學(xué)特點(diǎn)方面知之甚少。本課題將研究細(xì)胞分裂周期蛋白6 (cell division cycle 6, CDC6)在顱咽管瘤中的表達(dá)及臨床意義以及靶向下調(diào)CDC6的表達(dá)對CP細(xì)胞增殖作用的影響，從而為CP提供新的臨床治療方法以及闡述其基因水平發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、病歷資料

本研究所使用標(biāo)本來自中國人民解放軍海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科選擇者的腫瘤組織。其中有20例正常腦組織石蠟標(biāo)本，20例CP組織石蠟標(biāo)本(10例釉質(zhì)上皮型和10例鱗狀乳頭型)，以及5例新鮮CP手術(shù)切除組織切塊。所有納入標(biāo)本的患者臨床病理資料均完整，首選治療均為手術(shù)治療，術(shù)前無放、化療史。所有標(biāo)本均經(jīng)兩位病理專家復(fù)核確認(rèn)，取材、使用均經(jīng)本院倫理委員會討論同意，并簽署患者知情同意書。設(shè)立實驗組和對照組，后采用免疫組織化學(xué)親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(avidin-biotin-peroxidase complex, ABC)法進(jìn)行染色。

二、主要試劑

常規(guī)培養(yǎng)液為添加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Hyclone, 美國)的改良Eagle基本培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle Medium, DMEM)(Gibco, 美國)。含有乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)的胰酶及淋巴細(xì)胞分離液購自泰格美公司，細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自美國Gibco公司，CDC6單克隆抗體(mouse anti-CDC6 molyclonal antibody)購自Santa-Cruze公司，小干擾核糖核酸片段(small interfering RNA, siRNA)。

三、方法

1.免疫組化染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水、按免疫組化ABC法試劑盒說明書進(jìn)行操作。染色的切片隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)100個細(xì)胞,按照陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比評分：陽性細(xì)胞數(shù)<25%為0分，25%～50%為1分，50%～75%為2分，>75%為3分；再按染色強(qiáng)度評分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕黃色。兩項得分相乘，綜合結(jié)果進(jìn)行評分，兩項相乘≥4者記為陽性。采用χ2檢驗、Fisher's確切概率法及Spearman相關(guān)分析，α=0.05(雙側(cè))，比較實驗組和對照組CDC6的表達(dá)差異，以及不同病理類型間CDC6的表達(dá)不同，得出結(jié)論。

2.CP細(xì)胞培養(yǎng)：新鮮CP手術(shù)切除組織切塊來源于海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科住院患者共5例，術(shù)后病理證實均為牙釉質(zhì)上皮型。在新鮮腫瘤組織邊緣，無囊變、壞死、鈣化及電凝的部位無菌取材后，將組織置于含有2 mL 0.25% EDTA-胰酶的30 mm培養(yǎng)皿中，用剪刀將組織剪碎，37 ℃消化20 min。用3 mL添加10% FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化。無菌濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，1000 r/min離心5 min。棄上清，DMEM洗3次，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液混懸沉淀，以1×103個細(xì)胞/3 mL接種于六孔板，每兩天換液一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長。選取生長情況最佳的細(xì)胞作為后續(xù)研究所用細(xì)胞。

3.靶向CDC6 RNAi體外抑制CP細(xì)胞的增殖研究：①有效干擾片段篩選：設(shè)計合成三條CDC6 siRNA(上海吉瑪)，代號分別為304、793、1146。CP細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至 80%～90%融合時，傾去培養(yǎng)液，用 2 mL無血清DMEM 液洗滌細(xì)胞兩次。加入1 mL EDTA-胰酶溶液混勻后，37 ℃放置1 min。小心吸去胰酶溶液，在加入2 mL含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。血球計數(shù)板計數(shù)，按1×105細(xì)胞/孔的濃度接種 6孔板，混勻后37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。1OD siRNA干粉用120 μL焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate, DEPC)水溶解，終濃度約為20 μM。在1.5 mL離心管(Eppendorf, EP)中加入250 μL DMEM，再加入10 μL siRNA，取另一1.5 mL EP管，加入250 μL DMEM，加入5 μL lipofectamin 2000，混勻，室溫放置5 min后將兩管混合，室溫放置20 min。吸去6孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入 500 μL無血清的 DMEM 培養(yǎng)液。將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入 6 孔板中，混勻后，在培養(yǎng)箱中溫育6 h。吸棄轉(zhuǎn)染液，加入2 mL含10% FBS的D/F12培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)至24 h、48 h，分別收樣，進(jìn)行實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)及免疫印跡法(Western Blot)法檢測，篩選有效干擾片段并確定最佳干擾時間。②MTT法檢測CP細(xì)胞增殖活力：將生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染CDC6 siRNA的CP細(xì)胞和對照組未轉(zhuǎn)染CP細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋成1×104/mL，分別接種于24孔板(1 mL/孔)，每組設(shè)6個平行孔，同時設(shè)空白對照(僅添加培養(yǎng)基)。置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。分別培養(yǎng)0、24、48和72 h，向各組孔內(nèi)加入100 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，向各孔中加入甲瓚裂解液1 mL，繼續(xù)置CO2培養(yǎng)箱中孵育至甲瓚全部溶解，于微量振蕩器上輕輕震蕩混勻15 min，吸出裂解液，酶標(biāo)儀上490 nm測定各孔吸光度值(optical density, OD)，取各孔吸光度的平均值，以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制增殖曲線。③流式細(xì)胞儀(flow cytometer, FCM)分析：CP細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24、48 h后用常規(guī)胰酶消化，洗2次，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×106/mL。加入 1 mL預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)重懸細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，吸凈上清。加入500 μL PBS，輕輕重懸細(xì)胞，使細(xì)胞分離為單個，逐滴加入預(yù)冷的100%乙醇(-20 ℃)1.5 mL，使其終濃度為75%，4 ℃，放置過夜固定。取出固定的樣品，1000 r/min×5 min，棄上清。加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，1000 r/min×5 min，離心收細(xì)胞。重復(fù)1次，以除去乙醇，用300目濾網(wǎng)過濾，樣品濃度調(diào)至1×105/mL。加入150 μL RNA酶(250 g/mL)重懸細(xì)胞，37 ℃消化30 min。加入100 L碘化丙啶(propidium iodide, PI)工作液，4 ℃避光染色30 min。轉(zhuǎn)至流式檢測管，上機(jī)檢測，PI用488 nm 氬離子激光器激發(fā)，由630帶通濾光片接收，通過散點(diǎn)圖收集細(xì)胞，采用設(shè)門技術(shù)排除粘連細(xì)胞和在碎片，分析PI熒光直方圖上細(xì)胞各周期的百分率。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

將所得結(jié)果使用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。定量資料進(jìn)行單通道ANOVA單因素方差分析，方差不齊者采用秩和檢驗，樣本間的兩兩比較應(yīng)用t檢驗，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、免疫組化染色

CDC6主要表達(dá)于細(xì)胞漿及細(xì)胞核中，從免疫組化結(jié)果(圖1)可以看出，CP細(xì)胞中比CDC6表達(dá)量較正常細(xì)胞明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

二、CP細(xì)胞的培養(yǎng)

原代CP細(xì)胞呈小團(tuán)狀生長，有細(xì)胞擊落形成，散在分布。聚集的細(xì)胞大小不一，多為多邊形，密度低時可見單個長梭形細(xì)胞。細(xì)胞透亮，遮光性好，呈“鋪路石”樣排列，初次接種細(xì)胞增殖較慢，團(tuán)狀細(xì)胞可重疊生長，前2 d細(xì)胞生長較慢，第3～5天匯合率可達(dá)80%～90%[2]。

三、靶向CDC6 RNAi 體外抑制CP細(xì)胞的增殖研究

1.有效感染片段選擇：實驗設(shè)計的三條感染片段包裝病毒感染細(xì)胞后，real-time PCR結(jié)果顯示，編號為1146的片段在轉(zhuǎn)染CP細(xì)胞24 h后，CDC6表達(dá)量在三條片段中最低(圖2)Western Blot也顯示同樣的結(jié)果(圖3)。因此最終選定編號為1146的片段作為感染片段，且轉(zhuǎn)染后24 h為細(xì)胞周期檢測最佳時間。

2.MTT檢測細(xì)胞增殖能力：MTT檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了CDC6 siRNA片段的細(xì)胞增殖能力明顯低于正常細(xì)胞(圖4)，在轉(zhuǎn)染后24 h達(dá)到最低。且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.細(xì)胞周期檢測：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CDC6感染片段的細(xì)胞G1期明顯變長，而G2期明顯縮短(P<0.05)，這與CDC6調(diào)節(jié)有絲分裂的功能有關(guān)(圖5)。

圖1 免疫組化ABC法檢測標(biāo)本中CDC6表達(dá)(×200)
Fig 1 Expression of CDC6 detected by ABC staining (×200)
A:The immunohistochemical staining of craniopharyngioma cells showed the expression of CDC6 in craniopharyngioma cells was apparently higher than the normal cells; B:The immunohistochemical staining of the expression of CDC6 in normal cells.

圖2 Real-time PCR篩選有效干擾片段
Fig 2 Screening effective interfering fragments by real-time PCR
A:Relative gene expression of CDC6 using real-time PCR at 24 h after transfection. The data showed 1146 was the most effective interfering fragments; B:Relative gene expression of CDC6 using real-time PCR at 48 h after transfection. The data showed 24 h was the optimum time.

圖3 Western Blot篩選有效干擾片段
Fig 3 Screening effective interfering fragments by Western Blot
A:CDC6 protein expression using Western Blot at 24 h after transfection. The data showed 1146 was the most effective interfering fragments; B:CDC6 protein expression using Western Blot at 48 h after transfection. The data showed 24 h was the optimum time.

圖4 細(xì)胞增殖能力檢測
Fig 4 The cell growth of CP cells and CDC6 siRNA CP cells for 72 h

圖5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化
Fig 5 Cell cycle detection by flow cytometry

討 論

細(xì)胞異常增殖是腫瘤發(fā)展的核心過程，細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，而細(xì)胞周期又受DNA復(fù)制起始蛋白的調(diào)控，真核細(xì)胞中CDC6是起始細(xì)胞DNA復(fù)制的必需蛋白，其主要功能是參與組裝完成“復(fù)制前復(fù)合體(pre-replication complexes, pre-RC)”[3]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，CDC6在調(diào)控細(xì)胞有絲分裂方面也具有重要作用[4]。CDC6介導(dǎo)基因組異常情況下蘇氨酸蛋白激酶通路信號的活化[5]，從而阻止有絲分裂的提前進(jìn)入。CDC6還可抑制有絲分裂期細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1, CDK1)的活性[6-7]，促進(jìn)有絲分裂滑脫[8]。因此，CDC6必然與細(xì)胞的惡性增殖及惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，抑制CDC6將會產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用。近年來已有CDC6在非小細(xì)胞性肺癌、甲狀腺癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的報道。

顱咽管瘤是上皮源性腫瘤，組織學(xué)上分為釉質(zhì)上皮型、鱗狀乳突型。CP雖然生長緩慢，但因位置特殊往往難于根治，反復(fù)復(fù)發(fā)后引起視神經(jīng)級垂體等結(jié)構(gòu)的進(jìn)行性損害[9]。我們在臨床中見證應(yīng)用CDC6抑制劑對CP患者進(jìn)行治療并取得良好的腫瘤控制，由此推測CDC6在CP的發(fā)生、發(fā)展的過程中起著重要作用。

我們首先研究了石蠟切片中正常腦組織及CP組織CDC6表達(dá)情況的差異，免疫組化染色結(jié)果顯示CP細(xì)胞中的CDC6表達(dá)量明顯高于正常腦組織細(xì)胞，這和其他實體腫瘤中的情況一致[10-12]。為了進(jìn)一步探討CDC6對CP細(xì)胞的生物學(xué)活性的影響，我們設(shè)計合成了CDC6 siRNA，篩選到有效片段之后，將其轉(zhuǎn)染CP細(xì)胞，然后對其生長情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，下調(diào)CDC6的表達(dá)后，CP細(xì)胞的增殖能力明顯降低。并且G2期顯著縮短，提示細(xì)胞提前進(jìn)入有絲分裂期(M期)。因此，我們認(rèn)為，CDC6不僅阻礙了CP細(xì)胞的增殖，而且對其細(xì)胞周期也有重要的影響。

以上的研究結(jié)果提示，CDC6可能在CP的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。因此我們認(rèn)為，深入研究CDC6在CP生物學(xué)特性中的作用，對于揭示CDC6的作用機(jī)制及其對CP的治療有重要的理論指導(dǎo)和臨床意義，有望為CP提供新的治療靶點(diǎn)。

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EffectsofCDC6onproliferationofcraniopharyngiomacellsinvitro

WANGShuwei,ZHANGJianning,LIUShuang,ZHAOHulin

DepartmentofNeurosurgery,NavyGeneralHospitalofPLA,Beijing100048, China

ObjectiveThe effect of CDC6 on proliferation of craniopharyngiom (CP) cells in vitro was explored.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expression of CDC6 in the specimens of craniopharyngioma, and CDC6 siRNA interference fragments were synthesized. MTT method was used to detect the growth of the tumor cells after interference, and the cell growth curve was drawn and the cell growth inhibition rate was calculated. The cell cycle was detected by flow cytometry.ResultsThe results of immunohistochemistry showed that the expression of CDC6 was significantly different between normal brain tissue and craniopharyngeal tumor tissue, and the growth curve showed that after down-regulation of CDC6 expression, craniopharyngioma tumor cell growth was slow, which indicated the cell growth was significantly inhibited compared with non-transfected cells. Cell cycle was detected by flow cytometry.ConclusionThe expression of CDC6 is higher in craniopharyngioma cells, and is involved in the regulation of proliferation of craniopharyngioma cells.

CDC6; Craniopharyngioma cells; Proliferation; Cell cycle

1671-2897(2017)16-389-04

R 739.41

A

王淑為，主管技師，碩士，E-mail:wangshuwei618@163.com

*通訊作者： 趙虎林，副主任醫(yī)師，博士，E-mail:zhaohulin_90@sohu.com

2017-01-04；

2017-04-05)