李榮華,李笑梅，孫娟娟，游曉意,莊永燦,李紅杏，官飛鳳，李常興△

(1.福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院皮膚科,福建泉州 362000；2.廣東省東莞市第六人民醫(yī)院皮膚科 523008)

論著·臨床研究

對稱性肢端角化病超微結構變化及角蛋白1的表達研究

李榮華1,李笑梅2，孫娟娟2，游曉意1,莊永燦1,李紅杏2，官飛鳳2，李常興2△

(1.福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院皮膚科,福建泉州 362000；2.廣東省東莞市第六人民醫(yī)院皮膚科 523008)

目的探討對稱性肢端角化病(SAK)皮損超微結構變化及角蛋白(KRT)1的表達。方法選取福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院及東莞市第六人民醫(yī)院門診SAK患者13例為研究對象，組織病理標本取材于手腕部位，皮損組織取材前2個月內(nèi)均未外用維甲酸制劑或皮質(zhì)類固醇制劑或中藥制劑。健康對照皮膚為整形美容手術切除正常皮膚12例。采用透射電鏡觀察SAK患者皮損超微結構變化，免疫組化法檢測13例SAK患者皮損及12例健康者皮膚組織中KRT1的表達。結果SAK患者皮膚組織超微結構表現(xiàn)為角質(zhì)化包膜連續(xù)性中斷,角質(zhì)層、棘層上部和顆粒層細胞核周圍角蛋白絲顯著聚集。KRT1在SAK皮損及正常皮膚組織中棘層、顆粒層及角質(zhì)層均有表達，胞質(zhì)及胞膜染色多見；KRT1在SAK皮損組織中表達明顯高于正常皮膚(t=2.210,P=0.038)。結論SAK皮損超微結構特點為表皮角蛋白絲分化異常，可能與KRT1過表達有關。

角蛋白1；對稱性肢端角化??；超微結構

對稱性肢端角化病(SAK)是新報道的肢端角化病皮膚病，皮疹有明顯的季節(jié)性變化，患者皮損水分丟失明顯，皮脂缺乏，皮膚屏障功能障礙[1-6]。然而，SAK的發(fā)病機制尚未清楚，本研究探討SAK的超微結構特點及角蛋白(KRT)1在SAK患者皮損組織的表達，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院及東莞市第六人民醫(yī)院門診SAK患者13例為研究對象，其中女2例，男11例，年齡18～39歲。組織病理標本取材于手腕部位，皮損組織取材前2個月內(nèi)均未外用維甲酸制劑或皮質(zhì)類固醇制劑或中藥制劑。健康對照皮膚為整形美容手術切除正常皮膚12例，其中女2例，男10例，年齡16～40歲。13例SAK患者中取1例男性患者進行透射電鏡檢查。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑 KRT1抗體(UK，abcam，ab111471)；Envision，anti-rabbit/mouse-HRP(Denmark,DAKO),DAB染色液(Denmark，DAKO，K5007)。

1.2.2采用透射電鏡觀察SAK患者皮損超微結構變化 皮損組織：置于3%戊二醛溶液4 ℃前固定2～4 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗10 min，連續(xù)2次。后固定：1%鋨酸1.5～2.0 h，0.1 mol/L PBS漂洗5 min，連續(xù)2次。脫水：50%、70%乙醇逐級脫水，每級10 min，80%、90%、100%丙酮逐級脫水，每級10 min，連續(xù)2次。包埋：標本放入100%丙酮∶環(huán)氧樹脂Epon 812包埋劑(1∶1)混合40 min，環(huán)氧樹脂Epon 812包埋劑37 ℃浸透過夜，包埋60 ℃、48 h。修剪組織塊：顯微鏡下將組織塊修成正方形。鏡下定位：在AO超薄切片機下切1 μm的半薄切片，HE染色定位。超薄切片：在AO超薄切片機下切40～60 nm的超薄切片，銅網(wǎng)撈片。染色：70%乙醇配制的飽和醋酸鈾染色3 min，雙蒸水漂洗，鉛染液染3 min，雙蒸水漂洗。

1.2.3免疫組化法檢測皮膚組織中KRT1的表達 脫蠟和水化，二甲苯浸泡10 min×2次，無水乙醇梯度脫水，PBS清洗5 min×2次。切片置于室溫封閉5～10 min，PBS清洗2 min×3次，抗原修復，PBS洗5 min。滴加封閉液，室溫，10 min。滴加一抗KRT1抗體(工作液稀釋比例1∶300)，室溫1 h或者4 ℃過夜或者37 ℃ 1 h(4 ℃過夜后在37 ℃復溫45 min)，PBS清洗2 min×3次。滴加羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min,DAB顯色，蒸餾水洗，蘇木素復染45 s。50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脫水，每次2 min。置于100%二甲苯10 min，中性樹脂50 μL封片，室溫保存。

1.2.4結果判讀 光鏡下觀察角質(zhì)形成細胞內(nèi)KRT1陽性細胞,陽性切片隨機選取5個200倍視野攝片。

1.2.5半定量分析 采用ImagePro plus(IPP)軟件進行觀察分析結果。

2 結 果

2.1典型病例 患者臨床表現(xiàn)為雙手腕，雙指背、雙掌背、雙足背見棕褐色斑丘疹，見圖1。組織病理學表現(xiàn)為表皮呈明顯網(wǎng)籃狀角化過度，棘層肥厚；真皮淺層毛細血管擴張，管周可見少量淋巴細胞浸潤，見圖2。基底層黑素顆粒增多。棘層上部和顆粒層細胞核周圍角蛋白張力微絲聚集形成不連續(xù)性環(huán)狀；顆粒層可見角蛋白絲、張力絲在核周凝集；橋粒連接結構正常；角質(zhì)層明顯增厚，排列松散，角質(zhì)化包膜連續(xù)性中斷，角蛋白絲顯著凝集，見圖3。

圖1 典型病例

2.2免疫組化法 KRT1蛋白在健康人皮膚組織角質(zhì)形成細胞中角質(zhì)層、顆粒層和棘層均有中高強度的表達，主要位于胞質(zhì)和包膜位置。KRT1蛋白在SAK患者皮損組織中角質(zhì)層、顆粒層及棘層有較高強度的表達，主要位于胞質(zhì)和包膜位置。KRT1在SAK皮損及正常皮膚組織陽性染色PU值分別為0.217 6±0.024 4和0.199 5±0.016 1，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.210,P=0.038)。見圖4。

圖2 組織病例學表現(xiàn)(HE×100)

圖3 超微結構(×8 000)

A：正常皮膚組織；B：皮損組織

圖4 KRT1在皮損和正常皮膚組織中的表達(DAB×100)

3 討 論

SAK臨床特征為棕褐色或棕黑色斑疹、斑丘疹，角化過度，界限清楚，皮膚干燥，皮膚屏障功能受損，常伴發(fā)尋常型魚鱗病[1,3]。典型的組織病理學特點為表皮網(wǎng)籃狀角化過度，棘層增厚，表皮突向下延伸，真皮淺層少量淋巴細胞浸潤，汗腺豐富?；颊叩牟±硇螒B(tài)學表現(xiàn)為表皮網(wǎng)籃角化過度，棘層增厚，真皮淺層少量淋巴細胞浸潤[2,5]，提示病變主要在表皮，特別是角質(zhì)層和棘層。皮損超微結構的特點為角質(zhì)層增厚，角蛋白絲紊亂，角質(zhì)層和棘層更加明顯，符合SAK超微結構典型表現(xiàn)[6-7]。本研究結果顯示，患者皮損組織超微結構變化符合組織病理學形態(tài)學變化。SAK的臨床表現(xiàn)、組織病理學和超微結構變化提示角蛋白分化異?？赡軈⑴cSAK的發(fā)病。

皮膚正常的角化過程是從基底層角質(zhì)形成細胞開始，逐步分化成棘層細胞、顆粒層細胞、角質(zhì)層細胞?；讓蛹毎谠鲋尺^程中不斷地向表面移動。KRT在皮膚角化過程中起重要作用，它是上皮細胞生長、分化及成熟的特征性標志物,保證細胞完整的理化性質(zhì)和代謝過程順利進行。KRT在表皮各層的表達有差異，基底層表達KRT5/KRT14,顆粒層表達KRT2e,而KRT1表達表皮絕大部分的棘層和角質(zhì)層，因而，KRT1常被作為表皮正常分化的標志物[8-11]。根據(jù)病理學特點和超微結構特征，筆者推測KRT1可能參與了SAK的發(fā)病過程。免疫組化結果顯示，KRT1蛋白在正常皮膚組織角質(zhì)形成細胞中角質(zhì)層、顆粒層和棘層均有中高強度的表達，主要位于胞質(zhì)和包膜位置，KRT1蛋白在SAK患者皮損組織中角質(zhì)層、顆粒層及棘層有較高強度的表達，主要位于胞質(zhì)和包膜位置，表達強度較正常皮膚明顯增強，特別是角質(zhì)層和棘層。這些研究結果符合組織病理學和超微結構的變化，提示KRT1表達分化異?？赡軈⑴c了SAK的發(fā)病。

[1]李常興,韓春雷.對稱性肢端角化病62例臨床分析[J].中華皮膚科雜志,2013,46(7):505-506.

[2]李常興,韓春雷.對稱性肢端角化病臨床病理分析[J].中華病理學雜志,2013,42(8):549-550.

[3]Li CX,Han CL,Zeng K,et al.Clinical,demographic and histopathological features of symmetrical acral keratoderma[J].Br J Dermatol,2014，170(10):948-951.

[4]李常興,李紅杏,官飛鳳,等.對稱性肢端角化病皮膚屏障功能評價及意義[J].廣東醫(yī)學,2015,36(21):3340-3341.

[5]田歆,周欣,張三泉,等.季節(jié)性對稱性肢端角化癥29例臨床分析[J].中國麻風皮膚病雜志,2009,25(9):668-669.

[6]田歆,劉玉梅,張三泉,等.16例季節(jié)性對稱性肢端角化癥臨床及病理超微結構分析[J].皮膚性病診療學雜志,2014,21(2):108-111.

[7]Li CX,Wen J,Zeng K,et al.Ultrastructural study of symmetrical acral keratoderma[J].Ultrastruct Pathol,2014,38(6):420-424.

[8]Chen L,Wang Y,Zhao L,et al.Hsp74,a potential bladder cancer marker,has direct interaction with keratin 1[J].J Immunol Res,2014,2014:492849.

[9]劉瑋.皮膚屏障功能解析[J].中國皮膚性病學雜志,2008,22(12):758-761.

[10]Moravcová M,Libra A,Dvoáková J,et al.Modulation of keratin 1,10 and involucrin expression as part of the complex response of the human keratinocyte cell line HaCaT to ultraviolet radiation[J].Interdiscip Toxicol,2013,6(4):203-208.

[11]李常興,李雪梅,張錫寶,等.尋常型魚鱗病患者中間絲聚合蛋白及其基因的改變[J].中華皮膚科雜志,2014,47(4):19-22.

Studyonultramicrostructurechangeandkeratin1expressioninpatientswithsymmetricalacralkeratoderma*

LiRonghua1,LiXiaomei2,SunJuanjuan2,YouXiaoyi1,ZhuangYongcan1,LiHongxing2,GuanFeifeng2,LiChangxing2△

(1.DepartmentofDermatology,FirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Quanzhou,Fujian362000,China;2.DepartmentofDermatology,DongguanMunicipalSixthPeople′sHospital,Dongguan,Guangdong523008,China)

ObjectiveTo study the ultramicrostructure change and keartin(KRT1) expression in skin lesion of symmetrical acral keratoderma(SAK).MethodsThirteen cases of SAK in the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University and the outpatient department of the Dongguan Municipal Sixth People′s Hospital were selected as the study subjects.The histopathological samples were taken from the wrist site.The retinoic acid preparation or corticosteroid preparation or Chinese medicine preparation were not externally used within 2 months before taking skin lesion sample.The healthy control skin samples were the normal skin in 12 cases by plastic surgical resection.The ultramicrostructural change were observed by the transmission electron microscopy.The KRT1 expression in skin lesion of 13 cases of SAK and healthy skin tissue of 12 cases were measured by immunohistochemistry method.ResultsThe SAK ultramicrostructures manifested by the interruption of keratinizing envelope continuity in horny layer,and remarkable aggregation of keratin filament in upper stratum spinosum and surrounding nucleus of granular layer.KRT1 was expressed in the cells of SAK skin lesion and basal layer,spinous layer,granular layer and horny layer.The cytoplasm and cytomembrane staining was common.The KRT1 expression in skin lesion was significantly higher than that in normal skin(t=2.210,P=0.038).ConclusionThe ultramicrostructure features of SAK skin lesion are abnormal differentiation of epidermis keratin filaments,which might be related with overexpression of KRT1.

keartin-1；symmetrical acral keratoderma;ultramicrostructure

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.008

廣東省醫(yī)學科學技術研究基金資助項目(A2016025)；東莞市社會科技發(fā)展資助項目(2014108101008)；泉州市科技計劃資助項目(2015Z39)。

李榮華(1976-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事皮膚病的研究?！?/p>

,E-mail:lilichangxing@163.com。

Q954.539

A

1671-8348(2017)33-4630-03

2017-05-17

2017-07-21)