曾星若 方珣 劉昌璇 婁美玉 陳文莉

·論著·

狼瘡腎炎中NGAL/NGALR的表達及臨床意義

曾星若 方珣 劉昌璇 婁美玉 陳文莉

目的探討中性粒細胞明膠酶相關(guān)性載脂蛋白(neutrophi gelatinase-associated lipocalin，NGAL)及其膜受體(neutrophi gelatinase-associated lipocalin receptor，NGALR)在狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)中的表達及其臨床意義。方法選擇84例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者分為LN組和非LN組，另外組織標本對照選取同期武漢市中心醫(yī)院泌尿外科腎癌切除術(shù)中癌旁正常組織。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測LN患者及非LN患者血清及尿液中NGAL/NGALR的表達水平，免疫組化法檢測LN患者與正常對照腎組織中NGAL/NGALR的表達，系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性指數(shù)評分采用1985年建立的SLEDAI-2000評分系統(tǒng)。采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用t檢驗、多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析用Spearman等級相關(guān)分析法。結(jié)果LN患者血液及尿液中NGAL/NGALR的表達顯著高于非LN患者，差異具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)；尿液中NGAL/NGALR的表達水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性指數(shù)評分呈正相關(guān)(Plt;0.01)；LN患者腎組織中NGAL/NGALR的表達較正常腎組織增高，差異具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)。結(jié)論NGAL/NGALR在LN患者血液、尿液及腎組織中的異常表達及其與疾病活動程度的相關(guān)，提示NGAL/NGALR可能參與LN的發(fā)生發(fā)展，可輔助LN的臨床診斷，同時為進一步研究NGAL/NGALR在LN的發(fā)病機制提供理論依據(jù)，為LN的研究提供新視點。

狼瘡腎炎； NGAL； NGALR

狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的腎臟損害，是SLE最常見和最重要的內(nèi)臟并發(fā)癥[1]，由此導致的腎衰竭已成為SLE患者主要的死亡原因之一[1]。LN的早期診斷與治療對改善預后、延長患者生存期有重要意義，因此尋找新的無創(chuàng)、早期、與腎損傷關(guān)聯(lián)性好的生物學指標非常重要。中性粒細胞明膠酶相關(guān)性載脂蛋白(neutrophi gelatinase-associated lipocalin，NGAL)是缺血性腎損傷及腎毒性損傷時最早被誘導出的基因所表達的蛋白；中性粒細胞明膠酶載脂蛋白受體(neutrophi gelatinase-associated lipocalin receptor，NGALR)作為NGAL特異性受體在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。本文通過研究LN患者血液、尿液及腎組織中NGAL/NGALR的表達情況及表達相關(guān)性分析，為LN的早期診斷及風險預測提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

選擇2015年5月至2017年4月期間在武漢中心醫(yī)院住院的SLE患者84例，其中男16例，女68例，年齡16～65歲，平均年齡(27.2±7.3)歲。納入標準：患者應(yīng)符合1997年美國風濕病學會關(guān)于SLE的分類診斷標準[2]。所有患者簽署知情同意書，且本研究通過武漢市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的倫理審查并批準。

二、方法

1.分組 LN診斷標準：已確診SLE患者合并出現(xiàn)尿常規(guī)提示血尿、蛋白尿，排除了其他自身免疫性疾病、原發(fā)性腎小球疾病、原發(fā)性高血壓、糖尿病、藥物性腎損害及泌尿系感染等伴隨疾病。根據(jù)LN診斷標準將入選患者分為LN組和非LN組。LN組42例，其中男10例，女32例，年齡16～63歲，平均年齡(28.1±6.8)歲；非LN組42例，其中男6例，女36例，年齡18～65歲，年齡(30.6±7.2)歲。2組患者在發(fā)病時間、誘因、病程、基礎(chǔ)治療等方面無統(tǒng)計學差異。

2.血清、尿液指標檢測 采集2組患者的空腹靜脈外周血3 ml，靜置凝血后離心，取上清得到血清標本；同時留取2組患者24 h尿液。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測血清及尿液中NGAL/NGALR的含量，試劑盒分別為聯(lián)科生物公司(貨號：70-EK0011)及Abnova公司(貨號：HZ-0444R)產(chǎn)品。

3. 腎穿活檢術(shù) 嚴格掌握腎穿刺適應(yīng)癥及禁忌癥，在征得患者同意情況下，應(yīng)用半自動腎穿刺活檢針，在彩超引導下行經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)。術(shù)前行凝血三項、血常規(guī)、血型、血生化及尿常規(guī)等常規(guī)檢查。對照的組織標本選取同期我院泌尿外科腎癌切除術(shù)中癌旁正常組織。

4. 免疫組化檢測 標本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，3～5 μm厚連續(xù)切片，使用特異性的抗NGAL及抗NGALR抗體進行免疫組化染色。蛋白的表達水平通過使用Image-Pro+6.0版(媒體控制論)分析計算每個染色腎組織區(qū)域的光密度值進而分析每張圖像的MOD值。

5.相關(guān)評價標準 系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性指數(shù)(systemic lupus erythomatosus disease activity index，SLEDAI)采用1985年建立的SLEDAI-2000評分系統(tǒng)[2]。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，2組間血液、尿液及腎組織NGAL/NGALR表達采用t檢驗，尿液NGAL/NGAL值與SLEDAI評分的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、血清和尿液中NGAL/NGALR含量

ELISA方法測定發(fā)現(xiàn)LN組患者外周血及尿液中NGAL/NGALR的表達均顯著高于非LN組(Plt;0.01)。(圖1)

二、NGAL/NGALR與SLEDAI評分的關(guān)系

根據(jù)SLEDAI評分標準將LN組患者進行評分分級，采用Spearman相關(guān)分析法進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示LN患者尿液中NGAL/NGALR表達與SLEDAI評分呈正相關(guān)(Plt;0.01)。(圖2)

三、LN腎組織中NGAL/NGALR的表達

在LN腎組織中NGAL陽性表達呈棕褐色，呈彌漫分布，在正常腎組織中弱表達。在LN腎組織中NGALR陽性表達呈棕褐色，主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)，呈彌漫分布，在正常腎組織中弱表達(圖3～4)。

圖1 患者血清及尿液中NGAL/NGALR含量

圖2 LN患者尿液中NGAL/NGALR表達與SLEDAI評分的相關(guān)性

討 論

SLE既是我國最常見的自身免疫性疾病，也是最常見的繼發(fā)性腎臟病[1]。該疾病多見于育齡婦女，其特點表現(xiàn)為體內(nèi)產(chǎn)生大量自身抗體和多器官臟器受累。LN是SLE常見且嚴重的并發(fā)癥，60%～80%的SLE患者出現(xiàn)腎臟受累臨床表現(xiàn)，表現(xiàn)為蛋白尿、血尿及腎衰竭[2]。根據(jù)腎臟病理檢查，結(jié)合免疫病理和電鏡檢查發(fā)現(xiàn)幾乎所有的患者均可出現(xiàn)腎臟受累[2-3]。腎衰竭是SLE死亡的主要原因之一。因此，LN是影響SLE預后的重要因素，LN的診治亦成為風濕科和腎病科醫(yī)生研究的重點。

多年來對LN研究工作不斷的深入進行，腎活檢術(shù)檢查對LN診斷及病情活動的判定有著重要意義，被認為是指導臨床診治的標準[4]。然而隨著SLE者腎活檢開展，亦發(fā)現(xiàn)腎活檢實施的可行性及對疾病診斷的有效性存在一定的局限。首先，因腎活檢術(shù)為有創(chuàng)性操作，臨床實施有所受限，且可重復性差，二次穿刺率低，對疾病的診斷及疾病追蹤觀察有局限性。另一方面，由于LN的病理改變復雜多變，臨床上很難找尋準確可靠的病理分類系統(tǒng)。因此，根據(jù)LN首次腎活檢的病理類型判斷LN病情在臨床應(yīng)用中存在不足。雖然腎活檢在LN診治中有著重要意義，但又因其局限性使得腎活檢在LN診斷、療效觀察及預后分析中的應(yīng)用受到影響。

為了能早期、準確、快捷診斷LN，研究者們試圖從檢測血、尿液中各項標志物以找到一種診斷途徑，尿液是一種易獲得、易保存的無創(chuàng)性檢測物，因此，檢測尿液中標記物以反映LN的活動性、腎臟病變程度成為研究熱點。目前，研究發(fā)現(xiàn)尿液標記物如轉(zhuǎn)化生長因子-β1、白細胞介素17，巨噬細胞炎性蛋白-1α、單核細胞趨化蛋白1等對LN的診斷、分級有重要意義[5-8]。

NGAL又稱Lcn-2，屬于lipocalin超家族的小分子分泌蛋白[9]。人類NGAL基因定位于第9號染色體長臂(9q34)，全長5 869 bp，包括1 695 bp的5'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)、178 bp的3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)及由7個外顯子和6個內(nèi)含子構(gòu)成的3 696 bp的原初轉(zhuǎn)錄區(qū)，其相對分子質(zhì)量為25 000[9]。

隨著對NGAL深入研究發(fā)現(xiàn)，其具有以下幾種生物學作用：①參與炎癥趨化和免疫應(yīng)答。NGAL可以結(jié)合細菌的含鐵細胞，通過隔斷鐵發(fā)揮抗菌效應(yīng)，故NGAL為一種新的抗微生物劑。NGAL還是細菌來源的趨化劑N-甲基蛋異亮苯丙肽的受體之一，可誘導白細胞內(nèi)顆粒如趨化因子、白介素等的釋放，以消滅病原微生物，據(jù)此推測NGAL與趨化現(xiàn)象和免疫應(yīng)答有關(guān)[10]。NGAL蛋白大量存在于一些與防御微生物有關(guān)的細胞，如小腸的潘氏細胞中，這種細胞能分泌多種抗微生物的多肽，表明NGAL與先天性宿主防御功能有關(guān)。②參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。乳腺癌患者體內(nèi)NGAL通過與MMP-9形成MMP-9/NGAL復合物而保護MMP-9不被降解，增加細胞外基質(zhì)再塑酶的活性，促進血管發(fā)生和腫瘤生長[10]；同時在86．36% 的乳腺癌患者尿液中檢測到MMP-9/NGAL細胞的復合物，而在健康人和同性別人中檢測不到，推測NGAL可能在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。③參與腎小管上皮的形成與修復。NGAL還可以運輸疏水性的小分子，參與鐵的轉(zhuǎn)運。NGAL結(jié)合鐵，形成NGAL-含鐵細胞-Fe復合物促進鐵轉(zhuǎn)運入細胞，參與哺乳動物近端腎單位發(fā)育過程中的間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換過程。同時NGAL-含鐵細胞-Fe復合物還可促進原始細胞分化為腎小管上皮細胞，保護成人腎小管上皮細胞或在損傷后促進腎小管上皮細胞修復[9，11]。

圖3 NGAL在腎組織中的表達

圖4 NGALR在腎組織中的表達

NGALR是一種已經(jīng)得到證實的細胞受體，它首次分離成功是從小鼠FL5.12細胞上，它可能參與NGAL的內(nèi)化和細胞的轉(zhuǎn)運功能[12]。今年來逐漸發(fā)現(xiàn)NGALR可能是一種原癌基因，參與到癌癥的發(fā)生和進展中[13-14]。NGALR在腎炎中的研究發(fā)現(xiàn)：NGALR主要分布在狼瘡腎炎的血管系膜細胞上，少量分布于毛細血管叢，而在正常腎組織和微小病變時幾乎沒有表達。另外，在鮑曼氏囊的壁層上皮細胞及遠曲小管上皮細胞上也有部分陽性表達[12,15]。

大量的臨床樣本研究揭示患者發(fā)生急性腎損傷后幾小時內(nèi)血液和尿液中NGAL水平就會大幅升高[16]。目前NGAL以其快速、準確、靈敏的生物學特點作為新一代的生物學標記物開始應(yīng)用于臨床，以便臨床醫(yī)生及時準確的觀測腎臟功能損傷的情況[17]。還有報道顯示狼瘡小鼠和LN患者尿NGAL高于正常[6,8]。本研究中通過檢測狼瘡患者血液、尿液及腎組織中NGAL的表達，發(fā)現(xiàn)LN患者血液、尿液及腎組織中NGAL的表達高于非LN患者，相關(guān)性分析得到狼瘡患者尿液中NGAL的表達與SLEDAI成正相關(guān)。這些結(jié)果再次證明，NGAL是LN的有價值的生物標記物。在肯定NGAL在SLE腎損傷中的價值同時，NGALR是否也協(xié)同參與了LN的病理改變引起了我們的關(guān)注。

本研究中通過檢測SLE患者血液、尿液及腎組織中NGAL/NGALR的表達，發(fā)現(xiàn)LN患者血液、尿液及腎組織中NGALR的表達顯著高于非LN患者，相關(guān)性分析表明尿液中NGALR的表達與SLEDAI呈正相關(guān)，本研究提示NGAL/NGALR有可能成為一種新的反映LN活動性的可靠標志物，有望成為準確、快捷診斷LN生物標記物。同時研究結(jié)果表明NGAL/NGALR在LN與非LN的差異表達，提示NGAL/NGALR可能參與LN的發(fā)病機制。LN中NGALR是否通過結(jié)合NGAL而啟動了細胞內(nèi)部的信號轉(zhuǎn)導機制，從而參與細胞的異常增殖或表型轉(zhuǎn)化，目前尚無研究報道。本研究為進一步深入研究NGAL/NGALR在LN中表達調(diào)控的分子機制以探尋其作為LN基因治療的潛在靶點提供理論依據(jù)。

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ExpressionandclinicalsignificanceofNGAL/NGALRinlupusnephritis

ZENGXing-ruo,FANGXun,LIUChang-xuan,LOUMei-yu,CHENWen-li.

DepartmentofRheumatologyandNephrology,theCentralHospitalofWuhan,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014,China

CHENWen-li,E-mail:whwenli@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of NGAL/NGALR in lupus nephritis (LN).MethodsEighty-four patients with systemic lupus erythematosus (SLE) were selected in this study, and divided into LN group and non-LN group. The normal tissues adjacent to carcinoma of kidney were chosen as controls, resected during the operation in Department of Urology, the Central Hospital of Wuhan. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the NGAL/NGALR expression level in serum and urine of the patients with or without lupus nephritis. Immunohistochemical method was used to detect the expression differences of NGAL/NGALR in lupus nephritis tissue and normal renal tissue. SLEDAI score was recorded by the SLEDAI-2000 scoring system (version 1985). SPSS 19.0 software was applied for data analysis, t test for two-group comparison, variance analysis for multi-group comparison, and spearman rank correlation analysis for correlation analysis.ResultsThe expression levels of NGAL/NGALR in lupus nephritis patients were significantly higher than in those without lupus nephritis in both serum and urine. The expression levels of NGAL/NGALR increased significantly in lupus nephritis tissues.ConclusionsNGAL and NGALR may be closely related to the occurrence/development and the activity of lupus nephritis, which can assist the clinical diagnosis, and may be expected to become the new targets for therapy of lupus nephritis.

Lupus nephritis; NGAL; NGALR

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.11.003

武漢市衛(wèi)計委臨床醫(yī)學科研項目(No.WX13C08)

430014 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院腎病與風濕免疫科

陳文莉，E-mail:whwenli@163.com

2017-09-11

2017-10-27)