張炯 王佳 陳麗朱 王芳 李貴森

·實驗研究·

蛇床子素對大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用

張炯 王佳 陳麗朱 王芳 李貴森

目的建立大鼠腎臟缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)模型，研究蛇床子素防治大鼠腎臟IRI的療效及機(jī)制。方法將50只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、蛇床子素(低，中，高)劑量組，每組10只。蛇床子素低、中、高劑量組術(shù)前45 min分別給予蛇床子素5、10、20 mg/kg腹腔注射，假手術(shù)組和模型組術(shù)前45 min給予等體積生理鹽水腹腔注射。模型組和蛇床子素(低，中，高)劑量組制備大鼠腎臟IRI模型，假手術(shù)組不夾閉左側(cè)腎蒂。用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血肌酐、尿素氮、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6；蘇木素伊紅染色檢測腎組織病理形態(tài)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測mRNA水平；硫代巴比妥酸比色法檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)。結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組腎臟病理改變以及血肌酐、尿素氮、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和丙二醛表達(dá)水平明顯增加，而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性明顯降低。與模型組相比，蛇床子素低、中、高劑量組腎臟病理改變以及血肌酐、尿素氮、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和丙二醛表達(dá)水平呈濃度依賴性明顯降低，而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性呈劑量依賴性明顯增高。結(jié)論蛇床子素對大鼠腎臟IRI有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)。

蛇床子素；腎臟缺血-再灌注損傷；氧化應(yīng)激；炎癥

腎臟缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是指高灌注器官腎臟血供中斷，重新恢復(fù)腎臟血流灌注導(dǎo)致腎臟損傷反而加重的臨床危像，好發(fā)于冠脈支架植入術(shù)后、腎移植、溶栓等臨床危重癥[1-2]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究顯示炎癥和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腎臟IRI的重要致病機(jī)制，因此抑制炎癥和氧化應(yīng)激是減輕腎臟IRI的重要途徑[3]。蛇床子素是具有多重生物學(xué)活性且無明顯毒副作用的香豆素類物質(zhì)，廣泛存在于歐前胡、蛇床等植物，具有抗炎、抗感染、抗腫瘤、抗氧化、清除氧自由基和抗病毒等活性[4-6]。腎臟IRI是由炎癥和氧化應(yīng)激參與調(diào)控的復(fù)雜病理過程[3]。因此本研究擬通過建立大鼠腎臟IRI模型，研究蛇床子素對腎臟IRI的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.實驗試劑 蛇床子素(Sigma公司,美國)，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factors α,TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)，酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒均購于武漢博士得；TNF-α、IL-6和MCP-1引物擎科生物，丙二醛(malonaldehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GPx)均購自于南京建成生物。

2.實驗動物 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量220～250 g(北京華?？倒咎峁?。動物飼養(yǎng)于四川省人民醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物房, 溫度為20～25 ℃, 濕度為40%～70%, 光照明暗各12 h, 換氣次數(shù)為10～20次/h。飼料為SPF級鼠滅菌飼料, 購自四川省醫(yī)學(xué)實驗動物中心, 符合GB-15921.2-2014 標(biāo)準(zhǔn)。飲水為經(jīng)121 ℃ (1.0 kg·cm-2)、30 min 滅菌自來水, 由動物經(jīng)飲水瓶自由攝取。

二、分組及模型構(gòu)建

將50只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和蛇床子素低、中、高劑量組,每組10只。蛇床子素低、中、高劑量組術(shù)前45 min分別給予蛇床子素5、10、20 mg/kg腹腔注射，假手術(shù)組和模型組術(shù)前45 min給予等量的生理鹽水腹腔注射。模型組和蛇床子素低、中、高劑量組制備大鼠腎臟IRI模型，假手術(shù)組操作同上，但不夾閉左側(cè)腎蒂。具體腎臟IRI模型制備方法參考文獻(xiàn)[7]：大鼠采用1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰位固定，用無創(chuàng)血管夾夾閉大鼠左側(cè)腎蒂,夾閉45 min后松開無創(chuàng)血管夾恢復(fù)灌注，腎臟由暗紅色恢復(fù)紅潤表明再灌注成功，同時去除右腎，然后逐層縫合切口。

三、方法

1.標(biāo)本收集和檢測 恢復(fù)大鼠腎臟血液再灌注24 h后, 給予腹腔注射麻醉藥品，然后行腹主動脈穿刺取全血以及收取腎臟組織。全血在室溫下以3 000 r/min速度離心10 min，取上清液，用酶聯(lián)合疫吸附試驗檢測血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、MCP-1、TNF-α和 IL-6的表達(dá)水平。將收集的腎臟組織標(biāo)本三分之一置于多聚甲醛做石蠟切片,其余腎組織凍于-80 ℃冰箱。

2.腎臟病理檢查 將多聚甲醛中固定的腎臟標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋處理、冷卻后制成厚度為4 μm的石蠟組織切片，烘干后進(jìn)行常規(guī)蘇木素伊紅染色(HE)染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)改變，并進(jìn)行Paller氏評分：每個視野下隨機(jī)選擇10個腎小管計分，腎管明顯擴(kuò)張記1分，細(xì)胞扁平或腫脹記2分，刷狀緣損傷記1分，脫落記2分，管形記2分，腎小管管腔內(nèi)有脫落，壞死(未形成管形或細(xì)胞碎屑記1分，腎小管正常記0分，量化腎組織損害程度。

3.檢測mRNA表達(dá) 稱取適量腎臟組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板，進(jìn)行QPCR為反應(yīng)，擴(kuò)增靶基因和內(nèi)參，目的基因為TNF-α、MCP-1和IL- 6，β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測。具體擴(kuò)增條件95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸1 min。共40個循環(huán)，得到每個樣本的CT(threshold cycle)值法，用得到的各樣本的CT值按公式2-ΔΔCT計算相對表達(dá)量，每組重復(fù)3次。(表1)

表1 本實驗所用基因的引物序列

4.氧化應(yīng)激指標(biāo)測定 利用硫代巴比妥酸比色法檢測腎組織MDA的含量，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD、CAT和GPx的活性，具體步驟參見相關(guān)說明書。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，資料采用單因素方差分析，多個樣本之間的兩兩比較采用T檢驗，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義

結(jié) 果

一、蛇床子素對SCr和BUN的影響

與假手術(shù)組相比，模型組SCr和BUN均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。與模型組比較，蛇床子素低、中、高劑量組SCr和BUN均呈濃度依賴性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)果提示蛇床子素可呈濃度依賴性減輕腎臟IRI。(表2)

表2 蛇床子素對SCr和BUN的影響

注：與假手術(shù)組比較，aPlt;0.01；與模型組比較，bPlt;0.05

二、蛇床子素可明顯減輕腎臟病理改變

假手術(shù)組未見明顯的腎臟病理形態(tài)學(xué)改變，模型組腎小管明顯擴(kuò)張，可見細(xì)胞核碎裂、壞死、脫落、腎小管明顯管腔阻塞、有大量蛋白管型、腎間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，蛇床子素低、中、高劑量組腎小管擴(kuò)張，異常形態(tài)細(xì)胞、細(xì)胞壞死、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤均呈濃度依賴性明顯減少。結(jié)果提示蛇床子素可呈濃度依賴性減少腎臟病理形態(tài)改

變。(圖1)

三、蛇床子素對TNF-α、MCP-1和IL-6 mRNA表達(dá)影響

與假手術(shù)組比較，模型組腎臟TNF-α、MCP-1和 IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)；與模型組相比，蛇床子素低、中、高劑量組腎臟TNF-α、MCP-1和 IL-6 mRNA表達(dá)水平呈濃度依賴性明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。結(jié)果提示蛇床子素可減輕腎臟促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、MCP-1和IL- 6的mRNA表達(dá)水平。(表3)

四、蛇床子素對TNF-α、MCP-1和IL- 6分泌影響

與假手術(shù)組比較，模型組血清中TNF-α、MCP-1和 IL-6表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)；與模型組相比，蛇床子素低、中、高劑量組血清中TNF-α、MCP-1和 IL-6表達(dá)水平呈濃度依賴性明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。結(jié)果提示蛇床子素可減少促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、MCP-1和IL-6的分泌。(表4)

五、蛇床子素對腎臟促氧化應(yīng)激酶的影響

假手術(shù)組MDA含量為(3.05±0.25) nmol/mg, 模型組MDA含量為(13.18±3.92) nmol/mg, 較假手術(shù)組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。蛇床子素低、中、高劑量組MDA含量分別為(9.02±2.18)nmol/mg、(6.78±1.74)nmol/mg、(4.12±1.02)nmol/mg,與模型組相比，腎組織MDA的含量呈濃度依賴性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。這提示蛇床子素可呈濃度依賴性減少M(fèi)DA的表達(dá)。

六、蛇床子素對腎臟抗氧化應(yīng)激酶活性的影響

黃嘌呤氧化酶法檢測結(jié)果顯示：模型組與假手術(shù)組相比，CAT、GPx和SOD活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。蛇床子素低、中、高劑量組與模型組相比，CAT、GPx和SOD的活性呈濃度依賴性明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。這提示蛇床子素可增加腎臟抗氧化應(yīng)激酶CAT、GPx和SOD活性。(表5)

注：與假手術(shù)組比較，aPlt;0．01；與模型組比較，bPlt;0．05圖1 蛇床子素對腎臟病理形態(tài)的影響

表3 蛇床子素對腎臟促炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響

注：與假手術(shù)組比較，aPlt;0.01；與模型組比較，bPlt;0.05

表4 蛇床子素對血清中促炎癥細(xì)胞因子

注：與假手術(shù)組比較，aPlt;0.01；與模型組比較，bPlt;0.05

討 論

IRI是一個復(fù)雜的病理生理過程，自60年代心臟IRI提出以來，在臨床相繼發(fā)現(xiàn)在器官移植、心肺復(fù)蘇和休克治療等均可發(fā)生IRI[8-9]。作為血流高灌注器官之一的腎臟，腎臟IRI容易引發(fā)腎臟葉間動脈受損，導(dǎo)致腎臟微血管損傷，引發(fā)腎小管代謝紊亂乃至壞死，進(jìn)而影響腎臟血流，引起腎臟細(xì)胞凋亡、壞死、乃至腎功衰竭，是目前引起急性腎衰最常見的原因之一。但目前治療措施有限，因此尋找新的干預(yù)治療措施減輕腎臟IRI具有重要的臨床現(xiàn)實意義[10-11]。目前在大鼠誘導(dǎo)腎臟IRI模型常規(guī)有兩種方式，一種是夾閉大鼠雙側(cè)腎蒂，另外一種是夾閉大鼠單側(cè)腎蒂。因夾閉大鼠單側(cè)腎蒂更能模擬臨床，因此本實驗通過夾閉大鼠左側(cè)腎蒂，并去除右腎的方法誘導(dǎo)腎臟IRI[8-10]。在本研究中，腎臟IRI可導(dǎo)致腎小管明顯擴(kuò)張，細(xì)胞核碎裂、壞死、脫落、腎小管明顯管腔阻塞、大量蛋白管型、腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤以及SCr和BUN明顯升高，提示腎臟IRI可導(dǎo)致腎臟病理結(jié)構(gòu)改變和腎功受損，這與既往研究相一致。而蛇床子預(yù)處理可呈濃度依賴性減少腎臟病理結(jié)構(gòu)的改變和血清SCr和BUN的下降，提示蛇床子素對腎臟IRI具有保護(hù)作用，而且在5～20 mg/kg范圍內(nèi)，呈濃度依賴性。但具體機(jī)制不明。

既往研究顯示腎臟IRI的發(fā)病機(jī)制涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、中性粒細(xì)胞聚集、鈣超載、凋亡等[12-13]。氧化應(yīng)激與腎臟IRI密切相關(guān)，腎缺血可使氧自由基生成增多，并可通過膜脂質(zhì)過氧化加劇腎臟損傷。MDA 是氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，MDA的表達(dá)水平可反映機(jī)體受自由基損傷程度[14]。CAT、GPx和SOD是體內(nèi)活性較強(qiáng)的氧自由基清除酶類，其表達(dá)量的高低可間接反映機(jī)體受氧自由基損傷程度[15]。研究結(jié)果顯示，腎臟IRI可增加MDA的表達(dá)量，減少CAT、GPx和SOD的活性，而蛇床子素可呈濃度依賴性減少M(fèi)DA的含量，提高CAT、GPx和SOD活性，提示蛇床子素可通過提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力而減輕對腎臟IRI，這可能與蛇床子素具有抗氧化應(yīng)激能力相關(guān)。有研究提示，炎癥可加劇腎臟IRI的進(jìn)程并影響腎功的恢復(fù)及預(yù)后[3]。腎臟IRI可導(dǎo)致促炎炎癥細(xì)胞因子生成增加，從而進(jìn)一步加重腎臟損傷。TNF-α、MCP-1和IL- 6是熟知的致炎細(xì)胞因子，可加劇炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡、壞死以及腎功的受損[2-3]。本研究結(jié)果顯示，蛇床子素可呈濃度依賴性減少TNF-α、MCP-1和IL- 6的表達(dá)，表明蛇床子素對腎臟IRI的保護(hù)作用可能與其抗炎作用相關(guān)。

表5 蛇床子素對腎臟氧化應(yīng)激酶活性的影響

注：與假手術(shù)組比較，aPlt;0.01；與模型組比較，bPlt;0.05

綜上所述，蛇床子素對腎臟IRI具有保護(hù)作用，該作用機(jī)制可能與蛇床子素具有抑制炎癥和提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力相關(guān)。

[1] Francis A, Baynosa R. Ischaemia-reperfusion injury and hyperbaric oxygen pathways: a review of cellular mechanisms[J]. Diving Hyperb Med, 2017, 47(2): 110-117.

[2] de Haan JE, Hoorn EJ, de Geus HRH. Acute kidney injury after liver transplantation: Recent insights and future perspectives[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2017, 31(2): 161-169.

[3] Yang T, Zhang XM, Tarnawski L, et al. Dietary nitrate attenuates renal ischemia-reperfusion injuries by modulation of immune responses and reduction of oxidative stress[J]. Redox Biol, 2017, 13: 320-330.

[4] Li YM, Jia M, Li HQ, et al.Cnidium monnieri: A Review of Traditional Uses, Phytochemical and Ethnopharmacological Properties[J]. Am J Chin Med, 2015, 43(5): 835-877.

[5] Costa CR, Amorim BR, de Magalh?es P, et al. Effects of Plants on Osteogenic Differentiation and Mineralization of Periodontal Ligament Cells: A Systematic Review[J]. Phytother Res, 2016, 30(4): 519-531.

[6] An J, Yang H, Zhang Q, et al. Natural products for treatment of osteoporosis: The effects and mechanisms on promoting osteoblast-mediated bone formation[J]. Life Sci, 2016, 147: 46-58.

[7] Zhang Z, Pan C, Wang HZ, et al. Protective effects of osthole on intestinal ischemia-reperfusion injury in mice[J]. Exp Clin Transplant, 2014, 12(3): 246-252.

[9] Zhang LX, Zhao HJ, Sun DL, et al. Niclosamide attenuates inflammatory cytokines via the autophagy pathway leading to improved outcomes in renal ischemia/reperfusion injury[J]. Mol Med Rep, 2017, 16(2): 1810-1816.

[10] Kusch A, Hoff U, Bubalo G, et al. Novel signalling mechanisms and targets in renal ischaemia and reperfusion injury[J]. Acta Physiol(Oxf), 2013, 208(1): 25-40.

[11] Kalyanaraman B. Teaching the basics of redox biology to medical and graduate students: Oxidants, antioxidants and disease mechanisms[J]. Redox biology, 2013, 1(1): 244-257.

[12] Haga Y, Ohtsubo T, Murakami N, et al. Disruption of xanthine oxidoreductase gene attenuates renal ischemia reperfusion injury in mice[J]. Life Sci, 2017, 182: 73-79.

[13] Hu B, Xu G, Zheng Y, et al. Chelerythrine Attenuates Renal Ischemia/Reperfusion-induced Myocardial Injury by Activating CSE/H2S via PKC/NF-κB Pathway in Diabetic Rats[J]. Kidney Blood Press Res, 2017, 42(2): 379-388.

[14] Nakamura T, Kuroda Y, Yamashita S, et al. Edaravone attenuates brain edema and urologic deficits in a rat model of acute intracerebral hemorrhage[J]. Stroke, 2008, 39(2): 463-469.

[15] Patil SL, Mallaiah SH, Patil RK. Antioxidative and radioprotective potential of rutin and quercetin in Swiss albino mice exposed to gamma radiation[J]. J Med Phys, 2013, 38(2): 87-92.

ProtectiveeffectsofOstholeonrenalischemiareperfusioninjury

ZHANGJiong,WANGJia,CHENLi-zhu,WANGFang,LIGui-sen.

DepartmentofNephrology,SichuanProvincialPeople'sHospital,Chengdu610072,China

LIGui-sen,E-mail:guisenli@163.com

ObjectiveTo establish a model of renal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rats and study the effect and mechanism of osthole on renal IRI in rats.MethodsA rat model of renal IRI was constructed by clamping the left renal pedicle of the rats for 45 min, removing the right kidney, and restoring the renal blood flow for 24 h. Fifty SD rats were randomly divided into sham operated group, renal IRI group, and osthole (low, middle, high) dose groups. 45 min before operation, osthole (5, 10, and 20 mg/kg) was given by intraperitoneal injection in osthole groups. In the sham operated group and renal IRI group, the same volume of normal saline was intraperitoneally injected 45 min before operation. RT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6). ELISA was used to detect serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), MCP-1, TNF-α and IL-6. Hematoxylin eosin staining (HE) was used to examine the pathological morphology of renal tissues. The thiobarbituric acid colorimetric method was used to measure malondialdehyde (MDA) content in renal tissues. The xanthine oxidase method was used to determine the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx).ResultsAs compared with sham operated group, renal pathological changes were aggravated, SCr, BUN, MCP-1, TNF-α, IL-6 and MDA levels were significantly increased, and SOD, CAT and GPx activity decreased significantly in IRI group. As compared with IRI group, the pathological changes of renal tissues were significantly alleviated, SCr, BUN, MCP-1, TNF-α, IL-6 and MDA were significantly decreased in a concentration-dependent manner, and SOD, CAT and GPx activity increased in a dose-dependent manner in osthole-treated groups.ConclusionsOsthole has protective effects on renal IRI in rats, which may be related to the inhibition of inflammation and oxidative stress.

Osthole; Ischemia-reperfusion injury; Inflammtion; Oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.11.011

國家自然科學(xué)基金(No.81401362, 81100575)；四川省科技支撐計劃(No.2015SZ0245)；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊發(fā)展項目(No.2015TD0013)

610072 成都，四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科(張炯，王芳，李貴森)，全科(王佳，陳麗朱)

李貴森，E-mail:guisenli@163.com

2016-07-23

2017-08-15)