吳嵐 包麗萍 李菊霜 吳小燕

·實(shí)驗(yàn)研究·

冬凌草甲素通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和脂代謝減輕糖尿病大鼠腎損傷

吳嵐 包麗萍 李菊霜 吳小燕

目的研究冬凌草甲素對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用。方法將24只SD大鼠隨機(jī)分正常對(duì)照組(NC)、糖尿病組(DM)、冬凌草甲素組(DO)，DM組和DO組大鼠用腹腔注射鏈脲佐菌素制備糖尿病模型。DO組大鼠給以冬凌草甲素10 mg/kg灌胃，NC組和DM組大鼠均給予等量的生理鹽水灌胃。3組大鼠干預(yù)給藥8周后，檢測(cè)24 h尿蛋白、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL)；PAS染色觀察腎組織病理學(xué)改變；試劑盒檢測(cè)腎組織勻漿中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性及丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)含量；用免疫印跡試驗(yàn)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)SOD蛋白和mRNA表達(dá)情況。結(jié)果糖尿病大鼠24 h尿蛋白、SCr、BUN、TC、TG、LDL水平升高(Plt;0.05)，HDL降低，腎組織病理腎小球肥大，腎組織SOD和GSH-Px活力下降(Plt;0.05)，SOD蛋白和mRNA表達(dá)下降，MDA含量升高(Plt;0.05)。冬凌草甲素處理后可部分逆轉(zhuǎn)腎功能，減輕腎組織損傷；提高SOD、GSH-Px活力，并增加SOD蛋白和mRNA表達(dá)，降低MDA含量,即調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激；冬凌草甲素處理降低TC、TG、LDL水平，HDL升高，即改善脂代謝(Plt;0.05)。結(jié)論冬凌草甲素能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和改善脂代謝減輕糖尿病大鼠腎損傷。

冬凌草甲素；氧化；脂代謝；糖尿病腎病

糖尿病腎病(diabetic nephropathr,DN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因[1]。DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全清楚。氧化應(yīng)激通過(guò)多種途徑引起腎小球內(nèi)高壓、高灌注、高濾過(guò)，損傷腎組織[2]?？寡趸委熞恢北徽J(rèn)為是DN治療有效策略。DN常伴有脂代謝紊亂，高血糖及血糖波動(dòng)異常均可導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過(guò)度堆積、去脂質(zhì)作用減弱。脂代謝紊亂也會(huì)促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展，但目前相關(guān)研究尚不多見[3-4]。冬凌草甲素是傳統(tǒng)中藥冬凌草的主要藥理作用成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[5-9]。本研究觀察冬凌草甲素對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激和脂代謝的影響，為DN的治療提供新的選擇。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)試劑 冬凌草甲素(純度≥98%)購(gòu)自西安昊軒生物科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；尿蛋白、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)及丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；SOD、3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPD)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Trizol試劑、PCR所用引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠24只(湖北省疾病預(yù)防控制中心提供)，體質(zhì)量180～200 g，中南醫(yī)院動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度18 ℃～22 ℃，濕度50%～60% ，明暗各12 h交替一次。

二、動(dòng)物分組與模型制備

將24只健康雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱NC組)、糖尿病組(簡(jiǎn)稱DM組)和冬凌草甲素組(簡(jiǎn)稱DO組)，每組各8只。DM組及DO組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)21 d后，禁食16 h，然后按35 mg/kg單次腹腔注射鏈脲佐菌素(使用時(shí)溶于pH 4.0的0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中)；72 h后，大鼠尾靜脈采血測(cè)定血糖值，以血糖gt;16.7 mmoL/L作為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。NC組以普通飼料喂養(yǎng)，單次腹腔注射0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，注射量為6 ml/kg。

三、干預(yù)方法

從糖尿病大鼠成模第2天開始，DO組大鼠每日9∶00～10∶00給以冬凌草甲素10 mg/kg灌胃，NC組和DM組大鼠均給予等量的生理鹽水灌胃。所有大鼠均自由采食，飲水。

四、標(biāo)本采集

3組大鼠干預(yù)給藥8周后，將大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液，測(cè)24h尿蛋白；隨后腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟采血測(cè)SCr、BUN、TC、TG、HDL、LDL；然后處死大鼠，取腎臟組織，放置于-80 ℃冰箱中，檢測(cè)SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量以及SOD蛋白和mRNA表達(dá)。部分大鼠腎臟固定于4%多聚甲醛，包埋后切片行PAS染色。

五、血糖測(cè)定及試劑盒檢測(cè)

采用拜安捷血糖儀測(cè)定血糖，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定24 h尿蛋白，苦味酸法檢測(cè)肌酐，脲酶法檢測(cè)尿素氮，比色法測(cè)定腎組織SOD、MDA，羥胺法測(cè)定腎組織GSH-Px。尿蛋白、SCr、BUN、SOD、GSH-Px、MDA檢測(cè)均按試劑盒說(shuō)明書操作。

六、腎臟病理觀察

大鼠腎臟經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，厚度3 μm，行PAS染色。每張片子分別取20個(gè)完整的腎小球，拍照，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定腎小球面積。

七、免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)SOD蛋白表達(dá)

提取腎組織蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，變性后取20 μg蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)入PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加SOD(1∶1000)和GAPDH(1∶1 000)一抗，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜3次后，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。以GAPDH(1：1000)為內(nèi)參照，通過(guò)計(jì)算目標(biāo)蛋白與GAPDH蛋白的灰度比值進(jìn)行半定量分析。

八、檢測(cè)腎組織中SOD mRNA

取出液氮中的腎組織樣本，取50 mg采用Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度并定量。PCR反應(yīng)體系中SOD正義鏈：5’-CCGAGGAGAAGTACCACGAG-3’，反義鏈：5’-GCTTGATAGCCTCCAGCAAC-3’;GAPDH正義鏈：5’-AACGACCCCTTCATTGAC-3’,反義鏈：5’-TCCACGACATACTCAGCAC-3’。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作合成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，SYBR Green為熒光標(biāo)記物實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SOD的相對(duì)表達(dá)量。按下列反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min后 結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)．取5 μl PCR產(chǎn)物與2 μl上樣緩沖液混合，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 1.5 h，電泳結(jié)束后凝膠成像儀分析。每個(gè)樣品的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)重復(fù)3次。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用t檢驗(yàn)，Plt;0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、生化指標(biāo)的變化

與NC組相比，DM組和DO組給予鏈脲佐菌素后血糖明顯升高(Plt;0.05)，而DM組和DO組間無(wú)差別(Pgt;0.05)；與NC組相比，DM組24 h尿蛋白、SCr、BUN升高(Plt;0.05)；與DM組比較，DO組24 h尿白蛋白、SCr、BUN下降。(表1)

表1 各組一般生化指標(biāo)的比較

注：與NC組比較，aPlt;0.05；與DM組比較，bPlt;0.05

二、脂代謝的變化

與NC組相比，DM組TG、TC、LDL明顯升高(Plt;0.05)，HDL降低(Plt;0.05)；與DM組比較，DO組TG、TC、LDL降低(Plt;0.05)，HDL升高(Plt;0.05)。(表2)

表2 各組脂代謝指標(biāo)的比較

注：與NC組比較，aPlt;0.05；與DM組比較，bPlt;0.05

三、糖尿病腎臟組織學(xué)的改變

與NC組相比，DM組大鼠腎小球面積增大，冬凌草甲素處理后，減輕糖尿病大鼠的腎小球肥大。(圖1)

注：與NC組比較，aPlt;0．01；與DM組比較，bPlt;0．01圖1 各組大鼠腎臟組織病理(PAS染色，×200)及腎小球面積

四、抗氧化物酶活性及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的變化

與NC組比較，DM組SOD和GSH-Px活性明顯下降(Plt;0.05)，而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加(Plt;0.05)。與DM組比較，冬凌草甲素處理提高抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，降低MDA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。(圖2)

五、SOD蛋白及mRNA表達(dá)的變化

與NC組比較，DM組SOD蛋白及mRNA表達(dá)明顯下降，冬凌草甲素處理提高了SOD蛋白及mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。(圖3)

討 論

近20年來(lái)，糖尿病發(fā)病率突飛猛進(jìn)，成為21世紀(jì)威脅人類健康的最重要的慢性非傳染病之一。DN為糖尿病常見并發(fā)癥，是造成ESRD或患者死亡的主要原因之一。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟預(yù)測(cè)到2025年其患病總?cè)藬?shù)將會(huì)增長(zhǎng)到3.8億[10],DN防治形勢(shì)嚴(yán)峻。

注：與NC組比較，aPlt;0．01；與DM組比較，bPlt;0．05圖2 各組大鼠腎臟組織抗氧化物酶活性及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物

注：與NC組比較，aPlt;0．01；與DM組比較，bPlt;0．01圖3 各組大鼠腎臟組織SOD蛋白及mRNA表達(dá)

高糖條件下，機(jī)體清除氧自由基的酶的活性降低，同時(shí)體內(nèi)氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)，造成體內(nèi)大量活性氧自由基的積聚，因此氧化應(yīng)激在DN發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。針對(duì)氧化應(yīng)激的治療可有效保護(hù)腎功能，延緩DN的進(jìn)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明使用經(jīng)典抗氧化劑維生素E和維生素C抗氧化治療可有效保護(hù)腎功能[11-12]。近年來(lái)，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)尤其是中醫(yī)藥結(jié)合現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)方法在DN的研究和治療上具有非常獨(dú)特之處，研究表明中藥在控制血糖、尿白蛋白、SCr、BUN等方面具有明確的的療效[13]。冬凌草甲素是傳統(tǒng)中藥冬凌草的主要藥理作用成分，近來(lái)研究表明，冬凌草甲素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以下調(diào)細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平的作用[14]。然而在肝星狀細(xì)胞中，冬凌草甲素增強(qiáng)ROS水平，降低GSH水平[15]。在本研究中，糖尿病大鼠表現(xiàn)出24 h尿蛋白升高，腎功能下降，腎組織病理腎小球肥大，腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MAD水平升高，而抗氧化物酶SOD和GSH-Px活性下降，SOD蛋白和mRNA的表達(dá)水平下降。冬凌草甲素處理后，有效降低24h尿蛋白和MDA水平，改善腎功能和腎組織病理改變，提高抗氧化物酶SOD和GSH-Px活性，并增加SOD蛋白和mRNA的表達(dá)水平。本研究證明了冬凌草甲素對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用，其作用的發(fā)揮與冬凌草甲素的抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。在角質(zhì)細(xì)胞中的研究表明冬凌草甲素可通過(guò)改變miRNA表達(dá)來(lái)介導(dǎo)對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)[16]。核因子NF-E2相關(guān)因子(mulear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡發(fā)揮重要作用，Nrf2激活后由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，編碼抗氧化物酶，包括醌還原酶、血紅素氧化酶(HO-1)等[17]。近來(lái)研究也表明，冬凌草甲素可激活Nrf2信號(hào)通路[17]，顯著提高細(xì)胞內(nèi)醌還原酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平[18]，這提示冬凌草甲素可能通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，增加抗氧化物酶，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞抵抗應(yīng)激的自我保護(hù)重要。研究表明冬凌草甲素可活化RNA激活蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、活化轉(zhuǎn)錄因子6和抑制物阻抗性酯酶1，增加CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[22]。然而目前冬凌草甲素對(duì)DN氧化應(yīng)激的作用進(jìn)一步的機(jī)制仍有待闡述。

高血糖能夠誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化,降低脂蛋白脂肪酶，導(dǎo)致機(jī)體去脂質(zhì)作用減弱,脂質(zhì)過(guò)度堆積，TC、LDL等含量增加，同時(shí)脂代謝紊亂也能促進(jìn)糖尿病腎病進(jìn)展[3, 23]。研究表明升高的TG和降低的HDL是DN的重要危險(xiǎn)因素[24]，可引發(fā)和加速腎小球硬化的進(jìn)展，但發(fā)病機(jī)制不明。流行病學(xué)數(shù)據(jù)也表明：高脂血癥往往預(yù)示著DN的不良預(yù)后。隨著治療理念的不斷進(jìn)步，在DN的預(yù)防與治療中，對(duì)血脂的干預(yù)已經(jīng)提升至血糖、血壓同等地位。在本研究中，冬凌草甲素?zé)o降低血糖的作用，糖尿病組大鼠TG、TC、LDL水平升高，HDL水平下降，冬凌草甲素處理后降低TG、TC、LDL水平，升高HDL水平。冬凌草甲素可改善糖尿病的脂代謝紊亂，且調(diào)節(jié)脂代謝的作用與血糖無(wú)關(guān)。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)是脂肪酸合成的限速酶,主要存在于肝臟、脂肪等組織中,其活性與體內(nèi)脂肪合成的能力相關(guān)。因此，F(xiàn)AS對(duì)機(jī)體的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)起著重要的作用。冬凌草甲素調(diào)節(jié)脂代謝有研究表明冬凌草甲素是的FAS抑制劑，冬凌草甲素可有效抑制人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中的FAS的mRNA和蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞棕櫚酸酯和硬脂酸的水平[25]。這提示冬凌草甲素發(fā)揮調(diào)節(jié)脂代謝的作用可能與抑制FAS相關(guān)。

總之，冬凌草甲素可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和脂代謝減輕糖尿病大鼠腎損傷，冬凌草甲素是潛在的DN的輔助用藥，可能在以后的臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。

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Oridoninrelievesrenaldamageofdiabeticratsthroughmodulationofoxidativestressandlipidmetabolism

WULan,BAOLi-ping,LIJu-shuang,WUXiao-yan.

DepartmentofNephrology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China

WUXiao-yan,E-mail:wuxiaoyan2k6@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of oridonin on kidney of diabetic rats.MethodsSD rats were randomly divided into three groups (n=8 per group) as follows: normal group (NC), diabetic mellitus group (DM), diabetic mellitus treated with oridonin group (DO). The rat diabetic model was established by intraperitoneal injection of STZ once. Oridonin was administered by gavage to the rats of DO group at a dose of 10 mg/kg/day for 8 weeks. The rats in NC group and DM group were treated with equal volume of normal saline. The animals were sacrificed after 8 weeks of treatment with oridonin. The 24-h urinary protein, serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein (HDL), low-density lipoprotein (LDL), and the activity of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and the content of malondialdehyde (MDA) in renal tissues were determined. Western blotting and RT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression of SOD. PAS staining was used to observe the pathological changes of renal tissues.ResultsAs compared with NC group, DM group had significantly increased proteinuria, SCr, BUN, TG, TC and LDL, and decreased HDL. The content of MDA was increased but the activity of SOD and GSH-Px were decreased in renal tissues in DM group (Plt;0.05). The protein and mRNA expression of SOD was decreased in renal tissues in DM group (Plt;0.05). Oridonin treatment could reverse the renal function and renal histopathological changes, decrease the content of MDA, and increase the activity of SOD and GSH-Px (Plt;0.05). The protein and mRNA expression of SOD was also up-regulated in renal tissues of rats treated with oridonin. And the levels of TG, TC and LDL were decreased, and the level of HDL was increased in plasma under the treatment of oridonin (Plt;0.05).ConclusionsOridonin relieves renal damage of diabetic rats through modulation of oxidative stress and lipid metabolism.

Oridonin; Oxidative stress; Lipid metabolism; Diabetic nephropathy

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.11.012

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81170679)

430071 武漢，武漢大學(xué)中南醫(yī)院腎內(nèi)科

吳小燕，E-mail：wuxiaoyan2k6@163.com

2017-09-11

2017-10-28)