吳嵐 包麗萍 李菊霜 吳小燕

·實驗研究·

冬凌草甲素通過調(diào)節(jié)氧化應激和脂代謝減輕糖尿病大鼠腎損傷

吳嵐 包麗萍 李菊霜 吳小燕

目的研究冬凌草甲素對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。方法將24只SD大鼠隨機分正常對照組(NC)、糖尿病組(DM)、冬凌草甲素組(DO)，DM組和DO組大鼠用腹腔注射鏈脲佐菌素制備糖尿病模型。DO組大鼠給以冬凌草甲素10 mg/kg灌胃，NC組和DM組大鼠均給予等量的生理鹽水灌胃。3組大鼠干預給藥8周后，檢測24 h尿蛋白、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL)；PAS染色觀察腎組織病理學改變；試劑盒檢測腎組織勻漿中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性及丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)含量；用免疫印跡試驗和逆轉錄聚合酶鏈反應檢測SOD蛋白和mRNA表達情況。結果糖尿病大鼠24 h尿蛋白、SCr、BUN、TC、TG、LDL水平升高(Plt;0.05)，HDL降低，腎組織病理腎小球肥大，腎組織SOD和GSH-Px活力下降(Plt;0.05)，SOD蛋白和mRNA表達下降，MDA含量升高(Plt;0.05)。冬凌草甲素處理后可部分逆轉腎功能，減輕腎組織損傷；提高SOD、GSH-Px活力，并增加SOD蛋白和mRNA表達，降低MDA含量,即調(diào)節(jié)氧化應激；冬凌草甲素處理降低TC、TG、LDL水平，HDL升高，即改善脂代謝(Plt;0.05)。結論冬凌草甲素能通過抑制氧化應激和改善脂代謝減輕糖尿病大鼠腎損傷。

冬凌草甲素；氧化；脂代謝；糖尿病腎病

糖尿病腎病(diabetic nephropathr,DN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，是導致終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的主要原因[1]。DN的發(fā)病機制復雜，迄今尚未完全清楚。氧化應激通過多種途徑引起腎小球內(nèi)高壓、高灌注、高濾過，損傷腎組織[2]?？寡趸委熞恢北徽J為是DN治療有效策略。DN常伴有脂代謝紊亂，高血糖及血糖波動異常均可導致機體脂質(zhì)過度堆積、去脂質(zhì)作用減弱。脂代謝紊亂也會促進DN的發(fā)生發(fā)展，但目前相關研究尚不多見[3-4]。冬凌草甲素是傳統(tǒng)中藥冬凌草的主要藥理作用成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、增強機體免疫力等功效[5-9]。本研究觀察冬凌草甲素對糖尿病大鼠氧化應激和脂代謝的影響，為DN的治療提供新的選擇。

材料與方法

一、材料

1.實驗試劑 冬凌草甲素(純度≥98%)購自西安昊軒生物科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自美國Sigma公司；尿蛋白、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)及丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；SOD、3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPD)抗體購自美國Abcam公司；Trizol試劑、PCR所用引物由美國Invitrogen公司合成。

2. 實驗動物 SPF級8周齡雄性SD大鼠24只(湖北省疾病預防控制中心提供)，體質(zhì)量180～200 g，中南醫(yī)院動物房飼養(yǎng)，溫度18 ℃～22 ℃，濕度50%～60% ，明暗各12 h交替一次。

二、動物分組與模型制備

將24只健康雄性SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組(簡稱NC組)、糖尿病組(簡稱DM組)和冬凌草甲素組(簡稱DO組)，每組各8只。DM組及DO組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)21 d后，禁食16 h，然后按35 mg/kg單次腹腔注射鏈脲佐菌素(使用時溶于pH 4.0的0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中)；72 h后，大鼠尾靜脈采血測定血糖值，以血糖gt;16.7 mmoL/L作為糖尿病大鼠成模標準。NC組以普通飼料喂養(yǎng)，單次腹腔注射0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，注射量為6 ml/kg。

三、干預方法

從糖尿病大鼠成模第2天開始，DO組大鼠每日9∶00～10∶00給以冬凌草甲素10 mg/kg灌胃，NC組和DM組大鼠均給予等量的生理鹽水灌胃。所有大鼠均自由采食，飲水。

四、標本采集

3組大鼠干預給藥8周后，將大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液，測24h尿蛋白；隨后腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟采血測SCr、BUN、TC、TG、HDL、LDL；然后處死大鼠，取腎臟組織，放置于-80 ℃冰箱中，檢測SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量以及SOD蛋白和mRNA表達。部分大鼠腎臟固定于4%多聚甲醛，包埋后切片行PAS染色。

五、血糖測定及試劑盒檢測

采用拜安捷血糖儀測定血糖，考馬斯亮藍法測定24 h尿蛋白，苦味酸法檢測肌酐，脲酶法檢測尿素氮，比色法測定腎組織SOD、MDA，羥胺法測定腎組織GSH-Px。尿蛋白、SCr、BUN、SOD、GSH-Px、MDA檢測均按試劑盒說明書操作。

六、腎臟病理觀察

大鼠腎臟經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，厚度3 μm，行PAS染色。每張片子分別取20個完整的腎小球，拍照，運用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定腎小球面積。

七、免疫印跡試驗檢測SOD蛋白表達

提取腎組織蛋白，BCA法測蛋白濃度，變性后取20 μg蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉入PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加SOD(1∶1000)和GAPDH(1∶1 000)一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜3次后，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光法曝光。以GAPDH(1：1000)為內(nèi)參照，通過計算目標蛋白與GAPDH蛋白的灰度比值進行半定量分析。

八、檢測腎組織中SOD mRNA

取出液氮中的腎組織樣本，取50 mg采用Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度計測定純度并定量。PCR反應體系中SOD正義鏈：5’-CCGAGGAGAAGTACCACGAG-3’，反義鏈：5’-GCTTGATAGCCTCCAGCAAC-3’;GAPDH正義鏈：5’-AACGACCCCTTCATTGAC-3’,反義鏈：5’-TCCACGACATACTCAGCAC-3’。按反轉錄試劑盒操作合成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，SYBR Green為熒光標記物實時定量PCR檢測SOD的相對表達量。按下列反應條件進行擴增：94 ℃ 5 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min后 結束擴增反應．取5 μl PCR產(chǎn)物與2 μl上樣緩沖液混合，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V 1.5 h，電泳結束后凝膠成像儀分析。每個樣品的逆轉錄-聚合酶鏈反應重復3次。

九、統(tǒng)計學處理

采用Graphpad 5.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，結果以均數(shù)±標準差表示，2組間統(tǒng)計學分析用t檢驗，Plt;0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、生化指標的變化

與NC組相比，DM組和DO組給予鏈脲佐菌素后血糖明顯升高(Plt;0.05)，而DM組和DO組間無差別(Pgt;0.05)；與NC組相比，DM組24 h尿蛋白、SCr、BUN升高(Plt;0.05)；與DM組比較，DO組24 h尿白蛋白、SCr、BUN下降。(表1)

表1 各組一般生化指標的比較

注：與NC組比較，aPlt;0.05；與DM組比較，bPlt;0.05

二、脂代謝的變化

與NC組相比，DM組TG、TC、LDL明顯升高(Plt;0.05)，HDL降低(Plt;0.05)；與DM組比較，DO組TG、TC、LDL降低(Plt;0.05)，HDL升高(Plt;0.05)。(表2)

表2 各組脂代謝指標的比較

注：與NC組比較，aPlt;0.05；與DM組比較，bPlt;0.05

三、糖尿病腎臟組織學的改變

與NC組相比，DM組大鼠腎小球面積增大，冬凌草甲素處理后，減輕糖尿病大鼠的腎小球肥大。(圖1)

注：與NC組比較，aPlt;0．01；與DM組比較，bPlt;0．01圖1 各組大鼠腎臟組織病理(PAS染色，×200)及腎小球面積

四、抗氧化物酶活性及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的變化

與NC組比較，DM組SOD和GSH-Px活性明顯下降(Plt;0.05)，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加(Plt;0.05)。與DM組比較，冬凌草甲素處理提高抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，降低MDA含量，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。(圖2)

五、SOD蛋白及mRNA表達的變化

與NC組比較，DM組SOD蛋白及mRNA表達明顯下降，冬凌草甲素處理提高了SOD蛋白及mRNA表達，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。(圖3)

討 論

近20年來，糖尿病發(fā)病率突飛猛進，成為21世紀威脅人類健康的最重要的慢性非傳染病之一。DN為糖尿病常見并發(fā)癥，是造成ESRD或患者死亡的主要原因之一。國際糖尿病聯(lián)盟預測到2025年其患病總人數(shù)將會增長到3.8億[10],DN防治形勢嚴峻。

注：與NC組比較，aPlt;0．01；與DM組比較，bPlt;0．05圖2 各組大鼠腎臟組織抗氧化物酶活性及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物

注：與NC組比較，aPlt;0．01；與DM組比較，bPlt;0．01圖3 各組大鼠腎臟組織SOD蛋白及mRNA表達

高糖條件下，機體清除氧自由基的酶的活性降低，同時體內(nèi)氧化應激作用增強，造成體內(nèi)大量活性氧自由基的積聚，因此氧化應激在DN發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。針對氧化應激的治療可有效保護腎功能，延緩DN的進展。動物實驗和臨床試驗已經(jīng)證明使用經(jīng)典抗氧化劑維生素E和維生素C抗氧化治療可有效保護腎功能[11-12]。近年來，傳統(tǒng)醫(yī)學尤其是中醫(yī)藥結合現(xiàn)代生物醫(yī)學技術方法在DN的研究和治療上具有非常獨特之處，研究表明中藥在控制血糖、尿白蛋白、SCr、BUN等方面具有明確的的療效[13]。冬凌草甲素是傳統(tǒng)中藥冬凌草的主要藥理作用成分，近來研究表明，冬凌草甲素具有較強的抗氧化活性，可以下調(diào)細胞內(nèi)氧自由基水平的作用[14]。然而在肝星狀細胞中，冬凌草甲素增強ROS水平，降低GSH水平[15]。在本研究中，糖尿病大鼠表現(xiàn)出24 h尿蛋白升高，腎功能下降，腎組織病理腎小球肥大，腎組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MAD水平升高，而抗氧化物酶SOD和GSH-Px活性下降，SOD蛋白和mRNA的表達水平下降。冬凌草甲素處理后，有效降低24h尿蛋白和MDA水平，改善腎功能和腎組織病理改變，提高抗氧化物酶SOD和GSH-Px活性，并增加SOD蛋白和mRNA的表達水平。本研究證明了冬凌草甲素對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠腎臟具有保護作用，其作用的發(fā)揮與冬凌草甲素的抗氧化應激作用有關。在角質(zhì)細胞中的研究表明冬凌草甲素可通過改變miRNA表達來介導對氧化應激的調(diào)節(jié)[16]。核因子NF-E2相關因子(mulear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)對維持細胞內(nèi)氧化還原平衡發(fā)揮重要作用，Nrf2激活后由細胞質(zhì)轉移到細胞核，編碼抗氧化物酶，包括醌還原酶、血紅素氧化酶(HO-1)等[17]。近來研究也表明，冬凌草甲素可激活Nrf2信號通路[17]，顯著提高細胞內(nèi)醌還原酶的mRNA和蛋白表達水平[18]，這提示冬凌草甲素可能通過激活Nrf2信號通路，增加抗氧化物酶，發(fā)揮抗氧化應激的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是細胞抵抗應激的自我保護重要。研究表明冬凌草甲素可活化RNA激活蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、活化轉錄因子6和抑制物阻抗性酯酶1，增加CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白表達，誘導細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[22]。然而目前冬凌草甲素對DN氧化應激的作用進一步的機制仍有待闡述。

高血糖能夠誘導脂質(zhì)過氧化,降低脂蛋白脂肪酶，導致機體去脂質(zhì)作用減弱,脂質(zhì)過度堆積，TC、LDL等含量增加，同時脂代謝紊亂也能促進糖尿病腎病進展[3, 23]。研究表明升高的TG和降低的HDL是DN的重要危險因素[24]，可引發(fā)和加速腎小球硬化的進展，但發(fā)病機制不明。流行病學數(shù)據(jù)也表明：高脂血癥往往預示著DN的不良預后。隨著治療理念的不斷進步，在DN的預防與治療中，對血脂的干預已經(jīng)提升至血糖、血壓同等地位。在本研究中，冬凌草甲素無降低血糖的作用，糖尿病組大鼠TG、TC、LDL水平升高，HDL水平下降，冬凌草甲素處理后降低TG、TC、LDL水平，升高HDL水平。冬凌草甲素可改善糖尿病的脂代謝紊亂，且調(diào)節(jié)脂代謝的作用與血糖無關。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)是脂肪酸合成的限速酶,主要存在于肝臟、脂肪等組織中,其活性與體內(nèi)脂肪合成的能力相關。因此，F(xiàn)AS對機體的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)起著重要的作用。冬凌草甲素調(diào)節(jié)脂代謝有研究表明冬凌草甲素是的FAS抑制劑，冬凌草甲素可有效抑制人結腸直腸癌細胞中的FAS的mRNA和蛋白表達，降低細胞棕櫚酸酯和硬脂酸的水平[25]。這提示冬凌草甲素發(fā)揮調(diào)節(jié)脂代謝的作用可能與抑制FAS相關。

總之，冬凌草甲素可通過調(diào)節(jié)氧化應激和脂代謝減輕糖尿病大鼠腎損傷，冬凌草甲素是潛在的DN的輔助用藥，可能在以后的臨床實踐中推廣應用。

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Oridoninrelievesrenaldamageofdiabeticratsthroughmodulationofoxidativestressandlipidmetabolism

WULan,BAOLi-ping,LIJu-shuang,WUXiao-yan.

DepartmentofNephrology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China

WUXiao-yan,E-mail:wuxiaoyan2k6@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of oridonin on kidney of diabetic rats.MethodsSD rats were randomly divided into three groups (n=8 per group) as follows: normal group (NC), diabetic mellitus group (DM), diabetic mellitus treated with oridonin group (DO). The rat diabetic model was established by intraperitoneal injection of STZ once. Oridonin was administered by gavage to the rats of DO group at a dose of 10 mg/kg/day for 8 weeks. The rats in NC group and DM group were treated with equal volume of normal saline. The animals were sacrificed after 8 weeks of treatment with oridonin. The 24-h urinary protein, serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein (HDL), low-density lipoprotein (LDL), and the activity of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) and the content of malondialdehyde (MDA) in renal tissues were determined. Western blotting and RT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression of SOD. PAS staining was used to observe the pathological changes of renal tissues.ResultsAs compared with NC group, DM group had significantly increased proteinuria, SCr, BUN, TG, TC and LDL, and decreased HDL. The content of MDA was increased but the activity of SOD and GSH-Px were decreased in renal tissues in DM group (Plt;0.05). The protein and mRNA expression of SOD was decreased in renal tissues in DM group (Plt;0.05). Oridonin treatment could reverse the renal function and renal histopathological changes, decrease the content of MDA, and increase the activity of SOD and GSH-Px (Plt;0.05). The protein and mRNA expression of SOD was also up-regulated in renal tissues of rats treated with oridonin. And the levels of TG, TC and LDL were decreased, and the level of HDL was increased in plasma under the treatment of oridonin (Plt;0.05).ConclusionsOridonin relieves renal damage of diabetic rats through modulation of oxidative stress and lipid metabolism.

Oridonin; Oxidative stress; Lipid metabolism; Diabetic nephropathy

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.11.012

國家自然科學基金(No.81170679)

430071 武漢，武漢大學中南醫(yī)院腎內(nèi)科

吳小燕，E-mail：wuxiaoyan2k6@163.com

2017-09-11

2017-10-28)