范 甜，史校東，張曉曉，劉 洋，姚 軍,3

(1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.石家莊市第23中學(xué)，河北石家莊 050000；3.河北省藥用分子化學(xué)重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，河北石家莊 050018)

奧貝膽酸有關(guān)物質(zhì)的分析及合成

范 甜1，史校東1，張曉曉1，劉 洋2，姚 軍1,3

(1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.石家莊市第23中學(xué)，河北石家莊 050000；3.河北省藥用分子化學(xué)重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，河北石家莊 050018)

為了控制奧貝膽酸藥品的質(zhì)量，從奧貝膽酸原料藥中分離并鑒定了3種有關(guān)物質(zhì)：3α-羥基-6-乙基-7-酮-5β-膽烷-24-酸(A)，3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸(B)和3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-?；趸?-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸(C)。分析了這些物質(zhì)產(chǎn)生的原因并進行了設(shè)計合成，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過核磁共振氫譜得以確認。研究表明，3個有關(guān)物質(zhì)與奧貝膽酸粗品中的主要有關(guān)物質(zhì)的相對保留時間完全一致，合成的有關(guān)物質(zhì)與分離得到的有關(guān)物質(zhì)的核磁共振氫譜圖相符合，可以判定奧貝膽酸產(chǎn)品中的主要有關(guān)物質(zhì)就是合成得到的有關(guān)物質(zhì)A、有關(guān)物質(zhì)B、有關(guān)物質(zhì)C。解決了有關(guān)物質(zhì)研究所需對照品的問題，提高了原料藥的質(zhì)量，為奧貝膽酸的質(zhì)量研究和有關(guān)物質(zhì)的控制提供了一定的幫助。

中藥化學(xué)；奧貝膽酸；結(jié)構(gòu)鑒定；有關(guān)物質(zhì)；合成；質(zhì)量控制

奧貝膽酸，又名obeticholic acid，商品名Ocaliva，化學(xué)名6α-乙基-3α,7α-二羥基-5β-去氧膽酸-24-酸，是由美國 Intercept 制藥公司研發(fā)的用于治療原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的新型藥物[1-3]，2016-05-27獲得FDA加速批準[4]，目前該藥在中國國內(nèi)并未上市。奧貝膽酸是一種半合成初級膽汁酸鵝去氧膽酸的類似物，為口服藥，可附著于患者體內(nèi)的法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)，能夠選擇性地激活膽汁酸核受體，是法尼醇受體X的強效激動劑[5]。FXR受體存在于人體肝臟和腸道細胞的細胞核內(nèi)，在膽酸代謝調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性的作用。奧貝膽酸不僅可以促進肝臟內(nèi)膽汁的流動，還可抑制肝臟產(chǎn)生膽汁，降低膽汁在肝臟內(nèi)的過多潴留，避免肝臟膽酸水平過高[6-8]。

目前公開報道的文獻中關(guān)于奧貝膽酸的合成途徑主要有2種[9-11]。本研究參照這2種合成方法對合成路線加以優(yōu)化，對奧貝膽酸粗品中的主要有關(guān)物質(zhì)進行了分離，推測其結(jié)構(gòu)，通過有效的方法進行合成，最終確定了有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。通過合成與分離對照品有關(guān)物質(zhì)、色譜峰的保留時間、1H NMR等方法，確定了奧貝膽酸原料藥中的主要有關(guān)物質(zhì)的歸屬問題[12]。

1 有關(guān)物質(zhì)的來源分析及其合成路線

本研究以奧貝膽酸的重要中間體E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮-5β-膽烷-24-酸甲酯(化合物2)為起始原料，經(jīng)過酯基水解、加氫還原、羰基還原3步反應(yīng)，得到結(jié)晶奧貝膽酸C型(化合物5)，再經(jīng)晶型轉(zhuǎn)化得到奧貝膽酸1型(化合物1)。合成路線見圖 1。

圖1 奧貝膽酸的合成路線Fig.1 Synthesis route of obeticholic acid

在對奧貝膽酸粗品進行HPLC分析時，發(fā)現(xiàn)存在A，B，C 共3個主要有關(guān)物質(zhì)，其出峰保留時間(tR)分別為15.023，18.494和88.669 min。奧貝膽酸的保留時間為27.131 min，如圖2所示。為了確證3個有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，富集了3 種有關(guān)物質(zhì)的純品，質(zhì)譜分析其相對分子質(zhì)量分別為418.31，418.31和822.64。1H NMR分析顯示，與奧貝膽酸氫譜相比，有關(guān)物質(zhì)A缺少了7位上的氫及28位上的羥基氫，有關(guān)物質(zhì)B缺少了6位乙基上的氫，而有關(guān)物質(zhì)C缺少了29位羧基上的氫，多出了將近2倍的氫。綜合考慮有關(guān)物質(zhì)的相對分子質(zhì)量信息，推測3個有關(guān)物質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)如圖3所示，分析了3個有關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生的可能原因并進行合成[13-15]。

圖2 各有關(guān)物質(zhì)的保留時間Fig.2 Retention time of the related substances

圖3 3個有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Structure of the three related substances

通過對奧貝膽酸(化合物1) 的合成路線進行分析[16-21]，推測有關(guān)物質(zhì) A產(chǎn)生的原因是化合物4的異構(gòu)體，化合物3中的碳碳雙鍵經(jīng)過加氫反應(yīng)生成有關(guān)物質(zhì)A；有關(guān)物質(zhì) B產(chǎn)生的原因是選擇性還原，化合物3中的羰基通過NaBH4的選擇性還原變成羥基，即為有關(guān)物質(zhì)B；有關(guān)物質(zhì)C則是產(chǎn)品奧貝膽酸的二聚物，2個分子的奧貝膽酸經(jīng)過酯化反應(yīng)生成有關(guān)物質(zhì)C。通過實驗可知，3個有關(guān)物質(zhì)的合成路線簡單便捷，條件溫和，污染小，成本低，收率比較高。

2 有關(guān)物質(zhì)的定向合成

2.1主要儀器及試劑

HPLC檢測采用的儀器為Waters2695-2487；1H NMR檢測采用AVⅡBRUKER 500型超導(dǎo)核磁共振譜儀。

化合物2采購于南京蓋特醫(yī)藥公司；化合物3、化合物4、化合物5按照圖1所示路線合成，實驗過程中所用到的試劑純度均為市場銷售的分析純。

2.2合成過程

2.2.1 3α-羥基-6-乙基-7-酮-5β-膽烷- 24-酸(有關(guān)物質(zhì)A)

有關(guān)物質(zhì)A的合成路線見圖4。

圖4 有關(guān)物質(zhì)A的合成路線Fig.4 Synthesis route for related substance A

將0.14 g的NaOH溶于10 mL (10 eq)水中，將1.00 g化合物3溶解于NaOH水溶液中，加入0.1 g的Pd/C(質(zhì)量分數(shù)為10%)，20 ℃抽真空，氮氣置換3次，氫氣置換3次，40 ℃氫氣氛圍下反應(yīng)10 h，TLC檢測(展開劑為二氯甲烷-甲醇-冰醋酸，三者體積比為2∶0.06∶0.02)，化合物3紫外消失。濾除Pd/C，加入8 mL乙酸乙酯，室溫下用4 mol/L鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH值約為5，靜置分相。在上層有機相加入5 mL乙酸丁酯，將有機相先用6 mL水洗滌，再用3 mL飽和食鹽水洗滌，于40 ℃濃縮有機相，析出大量固體，至幾乎無溶劑蒸出，再于室溫析晶2 h，5 ℃析晶2 h。抽濾，用2 mL乙酸丁酯洗滌濾餅，得到0.68 g有關(guān)物質(zhì)A，質(zhì)量收率為68%。1H NMR(DMSO，500 MHz)譜中，11.95(s，1H，—COOH)，4.46(s，1H，—OH)，3.31(s，1H，—CH)，2.56(m，1H，—CH)，2.17(m，2H，—CH2)，2.01(m，2H，—CH2)，1.91(m，2H，—CH2)，1.82(m，1H，—CH)，1.65(m，5H，—CH2，—CH2，—CH)，1.37(m，6H，—CH，—CH，—CH2，—CH2)，1.19(m，4H，—CH2，—CH, —CH)，1.07(m，4H，—CH2，—CH2)，0.88(m，6H，—CH3，—CH3)，0.74(m，3H，—CH3)，0.64(s，3H，—CH3)。

2.2.2 3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷- 24-酸(有關(guān)物質(zhì)B)

有關(guān)物質(zhì)B的合成路線見圖5。

圖5 有關(guān)物質(zhì)B的合成路線Fig.5 Synthesis route for related substance B

2.2.3 3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽烷- 24-?；趸?-7α-羥基- 6α-乙基-5β-膽烷- 24-酸(有關(guān)物質(zhì)C)

有關(guān)物質(zhì)C合成路線見圖6。

圖6 有關(guān)物質(zhì)C的合成路線Fig.6 Synthesis route for related substance C

稱取5.00 g化合物1放入反應(yīng)瓶中，加入50 mL丙酮，攪拌溶解。稱取1.64 g的K2CO3及2.22 g的溴化芐，加入上述反應(yīng)液中，加熱，回流反應(yīng)約5 h，取2滴反應(yīng)液加入6滴二氯甲烷進行稀釋，TLC檢測反應(yīng)完畢(展開劑為乙酸乙酯-正己烷，二者體積比為1∶1)。停止加熱，抽濾(除去K2CO3)，用5 mL丙酮洗滌濾餅，于4 ℃濃縮濾液至干。加入50 mL二氯甲烷，攪拌溶解，加入20 mL水，靜置分相。取下層有機相，加入30 mL飽和食鹽水，靜置分相。取下層有機相，加入適量的無水硫酸鈉，進行干燥，抽濾，除去無水硫酸鈉，于35 ℃減壓濃縮有機相至干，得到3.64 g芐酯。再經(jīng)柱層析芐酯，展開劑為乙酸乙酯-石油醚，二者體積比為1∶2。

稱取2.00 g的化合物1，放入反應(yīng)瓶中，加入20 mL無水四氫呋喃，攪拌溶解。稱取3.00 g三氟醋酸酐，于5 ℃左右滴加到上述反應(yīng)液中。滴加完畢后，于25 ℃反應(yīng)約2 h，取樣，TLC檢測反應(yīng)完畢(展開劑為石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸，三者體積比為2∶0.5∶0.02)，此時反應(yīng)液簡稱為混酐。稱取2.43 g芐酯，放入反應(yīng)瓶中，加入30 mL無水四氫呋喃，攪拌下溶解。5 ℃下，將混酐緩慢地滴加到芐酯中。滴加完畢后，于25 ℃過夜反應(yīng)，TLC檢測反應(yīng)完畢(展開劑為石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸，三者體積比為3∶1∶0.02)，于35 ℃濃縮反應(yīng)液至干。加入40 mL二氯甲烷，攪拌溶解，加入50 mL水，靜置分相。取下層有機相，加入50 mL飽和食鹽水，靜置分相。在下層有機相中加入適量的無水硫酸鈉，靜置干燥，過濾，于35 ℃濃縮濾液至干，得到約6.25 g產(chǎn)品，柱層析該產(chǎn)品，展開劑為乙酸乙酯-石油醚，二者體積比為1∶15，得到1.15 g純產(chǎn)品。

將1.00 g純產(chǎn)品放入反應(yīng)瓶中，加入50 mL四氫呋喃，攪拌溶解。0 ℃下，將濃氨水緩慢地滴加到上述反應(yīng)液中，滴加完畢后于25 ℃反應(yīng)4 h，TLC檢測反應(yīng)完畢(展開劑為石油醚-乙酸乙酯，二者體積比為3∶1∶0.02)，于35 ℃濃縮反應(yīng)液至干。加入40 mL二氯甲烷，攪拌溶解，加入30 mL水，靜置分相。取下層有機相，加入30 mL飽和食鹽水，靜置分相。在下層有機相中加入適量的無水硫酸鈉，靜置干燥，過濾，于35 ℃濃縮濾液至干，柱層析該化合物(展開劑為乙酸乙酯-石油醚，二者體積比為1∶5)，得到0.89 g有關(guān)物質(zhì)C。1H NMR(DMSO，500 MHz)譜中，11.94(s，1H，—COOH)，4.39(s，1H，—OH),4.29(s，1H， —CH)，4.11(d，J=5.0 Hz，1H，—OH)，4.03(d，J=5.0 Hz，1H，—OH)，3.49(m，2H，—CH，—CH)，3.33(s，1H，—CH)，1.89～3.13(m，16H，—CH2，—CH2，—CH，—CH，—CH2，—CH2，—CH2，—CH2，—CH，—CH)，1.17～1.69(m，34H，—CH2，—CH2，—CH2，—CH2，—CH，—CH，—CH，—CH，—CH，—CH，—CH2, —CH2，—CH2，—CH2，—CH2，—CH2, —CH，—CH, —CH, —CH, —CH2, —CH2),0.99～1.09(m,4H, —CH2, —CH2),0.83～0.86(m,18H, —CH3, —CH3,—CH3,—CH3,—CH3,—CH3),0.60(s,6H, —CH3,—CH3)。

3 結(jié)果與結(jié)論

對制備的有關(guān)物質(zhì)A、有關(guān)物質(zhì)B、有關(guān)物質(zhì)C與奧貝膽酸的粗品進行HPLC分析。色譜柱為Agilent HC-C18(50 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相中的A相：0.02%(體積分數(shù)，下同)的三氟乙酸(70%乙腈-30%水)；B相：0.02%三氟乙酸(30%乙腈-70%水)；柱溫：45 ℃；流速：0.7 mL/min；波長：195 nm。通過分析，發(fā)現(xiàn)3個有關(guān)物質(zhì)與奧貝膽酸粗品中的主要有關(guān)物質(zhì)的相對保留時間完全一致，并且合成的有關(guān)物質(zhì)與分離得到的有關(guān)物質(zhì)的核磁共振氫譜圖相符合，可以判定奧貝膽酸產(chǎn)品中的主要有關(guān)物質(zhì)就是合成得到的有關(guān)物質(zhì)A、有關(guān)物質(zhì)B和有關(guān)物質(zhì)C。

藥物的純度是相對的，絕對純凈的藥物是不存在的，藥物中的有關(guān)物質(zhì)也不可能完全除盡。在不影響藥物療效和使用安全的前提下，綜合考慮藥物生產(chǎn)的可行性和穩(wěn)定性，藥物中是可以存在一定量的有關(guān)物質(zhì)的。該實驗中各有關(guān)物質(zhì)的含量均控制在0.15%以下，符合《中華人民共和國藥典》的相關(guān)要求[22]。

本實驗對奧貝膽酸粗品中的主要有關(guān)物質(zhì)進行了分離，推測了其結(jié)構(gòu)，通過對已有方法的優(yōu)化進行合成，最終確定了有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。通過合成與分離對照品有關(guān)物質(zhì)、色譜峰的保留時間、1H NMR等方法，確定了奧貝膽酸原料藥中的主要有關(guān)物質(zhì)的歸屬問題。本實驗解決了有關(guān)物質(zhì)研究所需對照品的問題，提高了原料藥的質(zhì)量，為奧貝膽酸的質(zhì)量研究和有關(guān)物質(zhì)的控制提供了一定的幫助[23]。

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一方面，按照GHM模型，中國“以乳企為核心的縱向一體化”不符合資源配置的規(guī)律；另一方面，以合作社為核心的縱向一體化也不具備條件，并受到以乳企為核心的縱向一體化政策的限制，不能進入加工領(lǐng)域，出現(xiàn)被動的非合并的所有權(quán)結(jié)構(gòu)，無法實現(xiàn)資源配置的帕累托改進。在非合并狀態(tài)下，中國乳業(yè)政策導(dǎo)致的雙方“談判力”失衡，進一步扭曲激勵機制，造成中國奶產(chǎn)業(yè)鏈利益分配的進一步失衡，使養(yǎng)殖業(yè)者投資不足，中國奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展失速。

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Synthesis and analysis of the related substances of obeticholic acid

FAN Tian1， SHI Xiaodong1， ZHANG Xiaoxiao1， LIU Yang2，YAO Jun1,3

(1.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China; 2.Shijiazhuang City 23rd Middle School, Shijiazhuang, Hebei 050000, China; 3.State Key Laboratory Breeding Base-Key Laboratory of Molecular Chemistry for Drug of Hebei Province, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

In order to control the quality of obeticholic acid, three related substances are separated from the obeticholic acid,as 3α-hydroxy-6-ethyl-7-keto-5β-cholene-24-acid(A),3α,7α-dihydroxy-6-ethylidene-5β-cholene-24-acid(B) and 3α(3α,7α-dihydroxy-6α-ethyl-5β-cholyl-24-acyloxy)-7α-hydroxy-6α-ethyl-5β-cholene-24-acid (C). The cause of the substances existence is analyzed and the route for preparing the substances is designed, and the structure of the substances are determined by1H NMR. The study shows that the relative retention time of the three related substances is consistent with that of the main related substances in obeticholic acid crude products, and the nuclear magnetic resonance hydrogen spectra of the synthesized related substances is consistent with that of the separated related substances, so it is determined that the main related substances in obeticholic acid products are the related substance A, related substance B and related substance C. The study solves the problem of the reference substances needed for the study of the relative substances, improves the quality of the obeticholic acid, and provides some help for the quality research of obeticholic acid and control of the related substances.

Chinese medicine chemistry； obeticholic acid; structural identification; related substances; synthesis; control quality

1008-1534(2017)06-0434-06

R975

A

10.7535/hbgykj.2017yx06008

2017-08-25;

2017-09-26；責任編輯：張士瑩

河北省人力資源和社會保障廳擇優(yōu)資助項目(C201400317)

范 甜(1992—)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事藥物合成方面的研究。

姚 軍教授。E-mail：twobright@163.com

范 甜，史校東，張曉曉，等.奧貝膽酸有關(guān)物質(zhì)的分析及合成[J].河北工業(yè)科技,2017,34(6):434-439.

FAN Tian，SHI Xiaodong，ZHANG Xiaoxiao，et al.Synthesis and analysis of the related substances of obeticholic acid[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology,2017,34(6):434-439.