盧慧芳，方義杰，李玥，黃涌泉，羅禮云，林岫芳

基礎與實驗研究

利拉魯肽對急性心肌梗死大鼠血管新生和心肌保護的影響及機制研究

盧慧芳，方義杰，李玥，黃涌泉，羅禮云，林岫芳

目的：觀察利拉魯肽對急性心肌梗死大鼠心肌血管新生的影響及其心肌保護作用。

方法：冠狀動脈結(jié)扎法建立大鼠急性心肌梗死模型，成功建模的大鼠隨機分為三組（每組6只）：對照組、利拉魯肽低劑量組（LS組）和利拉魯肽高劑量組（HS組），另外取6只大鼠僅穿線，不結(jié)扎，作為假手術(shù)組。LS組和HS組建模后分別腹腔皮下注射利拉魯肽70 μg/（kg·d）和140 μg/（kg·d），假手術(shù)組和對照組均注射相應生理鹽水，每天1次，共2周。4周后，超聲心動圖評估大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能，HE染色觀察心肌組織形態(tài)學變化，Masson染色計算膠原容積分數(shù)（CVF），免疫組織化學法檢測大鼠心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度（MVD）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白表達，蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測VEGF蛋白含量。

結(jié)果：4周后，對照組較假手術(shù)組左心室射血分數(shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）均明顯減低，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）及CVF明顯增加（P均＜0.01），而MVD及VEGF蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，LS組和HS組LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.01），LVEDd、LVESd降低（P＜0.05），CVF明顯下降（P＜0.01），MVD及VEGF蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；HS組較LS組LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.01），LVEDd、LVESd和CVF下降（P＜0.05），MVD及VEGF蛋白水平增加（P＜0.01或P＜0.05）。

結(jié)論：利拉魯肽可促進急性心肌梗死大鼠血管新生，可能與增加VEGF蛋白表達有關(guān)，并可減少膠原沉積，從而改善左心室收縮功能，發(fā)揮心肌保護作用，且與劑量有一定關(guān)系。

心肌梗死；血管新生；利拉魯肽

心血管疾?。╟ardiac vascular disease, CVD）是威脅人類健康的重大疾病之一，中國心血管病報告2015顯示，每5例死亡者中就有2例死于心血管病，并且數(shù)量在逐年增加[1]。而糖尿病亦是世界重大公共衛(wèi)生問題之一，糖尿病患者CVD的死亡率增加了2 倍多[2]，超過一半的冠心病患者合并糖尿病[3，4]。因此，大多數(shù)冠心病患者需要接受降糖藥等多種藥物綜合治療，而傳統(tǒng)降糖藥物在合并CVD時應用受限，因此既能控制血糖又有心血管益處的降糖藥物備受青睞。目前，胰高糖素樣多肽-l（glucagon-like peptide-1, GLP-1）受體激動劑廣泛的藥理學作用頗受關(guān)注，GLP-1及其類似物在降血糖的同時，對心肌、血管、腎臟等有一定的保護作用[5，6]。利拉魯肽是常用的GLP-1受體激動劑，在糖尿病合并心血管疾病中的應用是目前的研究熱點，具有獨立于降血糖之外的心血管益處[7]，但其對心肌梗死后血管新生的影響卻鮮有報道。本研究將通過動物實驗對相關(guān)機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

SPF級雄性SD(Sprague—Dawley)大鼠，體重220～250 g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。戊巴比妥鈉購自上海西唐科技有限公司。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購于美國Abcam公司，CD31抗體購自武漢博士德公司。

1.2 大鼠急性心肌梗死模型的建立及分組干預

參照文獻[8]，所有實驗大鼠術(shù)前禁食、禁飲12 h，稱重后用l%戊巴比妥鈉(30～45 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，經(jīng)口氣管插管后連接小動物呼吸機(呼吸機參數(shù)：呼吸比2：1，潮氣量30 ml/kg，呼吸頻率65～80次/min)，無菌操作下于左胸前區(qū)第三、四肋間行胸廓切開術(shù)，暴露心臟，撕開心包，于左心耳下緣2～3 mm處用6-O縫合線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，進針深度約2 mm，做兩次外科手術(shù)結(jié)扎打結(jié)。結(jié)扎后肉眼可見結(jié)扎局部下方和左心室前壁呈灰白至紫紺，室壁運動減弱，且心電圖Ⅱ?qū)?lián)R波增高伴明顯切跡（ST段抬高）并持續(xù)15 min以上即為心肌梗死模型結(jié)扎成功標志。抽吸胸腔后負壓關(guān)胸，逐層縫合胸腔，逐漸撤停呼吸機，待大鼠呼吸穩(wěn)定，清醒后拔出氣管插管，放入籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)4周（室內(nèi)溫度24℃～26℃）。

造模成功的18只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為三組（每組6只）：對照組、利拉魯肽低劑量組（LS組）和利拉魯肽高劑量組（HS組），另取6只作假手術(shù)組僅穿線，不結(jié)扎，余操作同建模過程。LS組和HS組分別腹腔皮下注射利拉魯肽70 μg/（kg·d）和140 μg/（kg·d），假手術(shù)組和對照組均注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)2周。

1.3 超聲心動圖評估心臟結(jié)構(gòu)及功能

建模前及建模后4周，大鼠在戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下行經(jīng)胸超聲心動圖（飛利浦IE33，12 MHz探頭）檢查，以胸骨旁短軸切面，測量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室短軸縮短率（LVFS）和左心室射血分數(shù)（LVEF）。心肌收縮力參數(shù)根據(jù)同一水平短軸切面獲取，每個切面記錄兩個圖像，每個參數(shù)參量記錄連續(xù)3個心臟搏動。

1.4 急性心肌梗死大鼠模型心臟標本采集

4周后，所有大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，迅速剪取心臟，4℃生理鹽水反復沖洗殘余血液，濾紙吸干，除去右心室、心房和大血管。在左心室長軸中點處垂直于長軸將左心室一分為二，心尖側(cè)的一半心肌組織經(jīng)4%甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制備厚度5 μm的組織切片。蘇木精-伊紅染色（HE染色）光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學變化，Masson染色觀察膠原沉積情況和免疫組織化學染色觀察血管新生的影響；另一半心肌組織置于液氮中保存，用于蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測。

1.5 心肌膠原容積分數(shù)（CVF）測定

Masson膠原染色，膠原纖維染呈藍色，肌肉呈紅色，200倍光鏡下在心肌梗死邊緣區(qū)隨機拍取5個視野。Image Pro Plus 6.0軟件計算膠原容積分數(shù)，即CVF=心肌膠原面積/所測同視野組織總面積×100%。

1.6 免疫組織化學法測定心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度（MVD）和VEGF蛋白表達水平

心肌組織切片常規(guī)脫蠟、水化及封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，按照羊超敏二步法免疫組化檢測試劑說明書，按 1∶100 稀釋，滴加一抗（CD31/VEGF），孵育過夜,依次滴加試劑 1(聚合物輔助劑)、試劑2(辣根酶標記抗山羊IgG多聚體)，DAB 顯色，CD31陽性細胞表達呈棕黃色顆粒，陰性對照以PBS代替一抗。顯微鏡下觀察左心室心肌梗死邊緣區(qū)CD31陽性細胞表達情況，400倍視野下計算單位面積內(nèi)CD31陽性微血管數(shù)目，在心肌梗死邊緣區(qū)隨機選取5個視野，取平均值，即MVD。CD31 陽性微血管計數(shù)標準：單個內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞簇、微小血管均予計數(shù)，帶有較厚肌層區(qū)域的血管均不計數(shù)。VEGF蛋白的表達以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性反應。采用彩色病理軟件進行圖像定量分析，每張切片在400倍光鏡下隨機選擇心梗邊緣區(qū)5個視野進行測量，計算出平均光密度（MOD）值，MOD值越高，蛋白表達量越多。

1.7 Western blot法檢測心肌梗死邊緣區(qū)VEGF蛋白的含量

提取心臟組織標本總蛋白做Western blot，采用10%聚丙烯酰胺凝膠分離目的蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后加入一抗 VEGF抗體(濃度1∶1000)，4℃孵育過夜。洗膜后，用辣根過氧化物酶標記的二抗進行雜交(濃度1：3000)，室溫下孵育2 h，TBST洗膜，電化學發(fā)光（ECL）法進行化學發(fā)光顯影，暗室曝光成像，用Image J分析目標條帶的MOD值。以GAPDH（使用濃度1∶3000）作為內(nèi)參照，比較不同處理后蛋白表達的差異。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（ ±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動圖對大鼠心功能的評估（表1）

在急性心肌梗死模型建立前，超聲心動圖測得LVEDd、LVESd、LVEF及LVFS在各組大鼠之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。建模后4周后對照組大鼠心室前壁運動減弱或消失，心室收縮功能的指標LVEF、LVFS較假手術(shù)組顯著降低，LVEDd及LVESd則顯著升高（P＜0.01）；與對照組相比，LS組和HS組LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.01），而LVEDd及LVESd有所下降（P＜0.05），且HS組較LS組改善更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 建模 4周后各組大鼠超聲心動圖結(jié)果（n=6,±s）

2.2 心肌組織病理改變

HE染色結(jié)果顯示（圖1），假手術(shù)組染色均勻，心肌排列整齊；對照組著色深淺不均勻，大量炎癥細胞浸潤，肌纖維排列紊亂，間隙增寬，部分肌溶灶；LS組著色深淺欠均勻，較多炎癥細胞浸潤，肌纖維排列不規(guī)則，少數(shù)肌溶灶；而HS組著色深淺略不均勻，較少炎癥細胞浸潤，肌纖維排列尚規(guī)則，極少肌溶灶。

2.3 心肌膠原改變

Masson染色顯示（圖1），假手術(shù)組心肌間質(zhì)少許藍色膠原沉積；對照組梗死區(qū)心肌結(jié)構(gòu)基本消失，代之大片染成藍色的膠原纖維，其間可見極少殘存心肌細胞；LS組梗死區(qū)膠原纖維較對照組減少；HS組梗死區(qū)減少更明顯，其間可見較多存活心肌。與假手術(shù)組比較，對照組梗死周邊區(qū)膠原容積分數(shù)明顯增加（P＜0.01）；與對照組比較，LS組和 HS組 CVF 均明顯下降 [（（34.78±4.33）%vs（41.72±4.86）%；（29.96±3.60）% vs（41.72±4.86）%；P均＜0.01]，且HS組下降更明顯[（29.96±3.60）% vs （34.78±4.33）% ，P＜0.05]。

2.4 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)MVD的水平

在400倍光鏡下計數(shù)新生血管內(nèi)皮細胞CD31陽性數(shù)目。與假手術(shù)組相比，對照組、LS組、HS組大鼠心肌梗死周邊區(qū)CD31陽性微血管明顯增多（P＜0.01）；與對照組和假手術(shù)組相比，LS組、HS組心肌組織MVD明顯增多（P＜0.01），且HS組較LS組更加明顯（P＜0.01，圖 2、表 2）。

2.5 各組大鼠心肌組織VEGF蛋白表達水平

免疫組化染色結(jié)果可見VEGF蛋白在心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞的胞漿均有表達，各組大鼠梗死周邊區(qū)均可見VEGF蛋白表達，對照組VEGF蛋白表達雖高于假手術(shù)組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而LS組和HS組VEGF蛋白表達水平均明顯高于假手術(shù)組和對照組（P＜0.01），且HS組VEGF蛋白表達高于 LS組（P＜0.01，圖 2、表 2）。

圖1 各組大鼠心肌HE染色（×200）和Masson染色（×200）結(jié)果

圖2 各組大鼠心肌免疫組化染色：CD31結(jié)果（×400）和VEGF結(jié)果（×400）

表2 各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)MVD及VEGF蛋白比較（n=6,±s）

Western blot結(jié)果進一步證實，假手術(shù)組和對照組心肌組織VEGF蛋白表達量無明顯差異（P＞0.05），與對照組相比，LS組和HS組VEGF蛋白表達量明顯增加（P＜0.01），與LS組相比，HS組VEGF蛋白表達增加（P＜0.05，圖 3）。

圖3 免疫蛋白印跡法檢測VEGF蛋白表達量

3 討論

糖尿病伴冠心病的患者常表現(xiàn)為無痛性心肌梗死，病情嚴重，不易被察覺，預后更差。因此，GLP-1及其類似物作為具有心血管益處的降糖藥受到廣泛關(guān)注。

研究表明，GLP-1可增強自體干細胞修復缺血損傷的能力，可促進干細胞向心肌分化，減輕凋亡，促進心肌干細胞的旁分泌效應等來促進心肌梗死后的恢復，在旁分泌的生長因子中，VEGF不僅能夠促進干細胞向心肌分化，還能促進毛細血管網(wǎng)的形成，而且VEGF的濃度與GLP-1劑量呈正比[9]。本研究也證實，利拉魯肽可促進大鼠心肌梗死后VEGF蛋白表達及毛細血管新生，且與劑量呈一定關(guān)系。利拉魯肽作為GLP-1受體激動劑，可通過激活GLP-1R/PI3K/Akt等通路，改善缺氧復氧引起的心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷[10]。也可降低p53和Caspase-3凋亡蛋白的表達，并促進超氧化物歧化酶的表達，從而減輕心肌缺血再灌注損傷，減少心肌梗死面積[11]。糖尿病患者早期應用GLP-1類似物也可減少心血管疾病的風險因素，發(fā)揮心肌保護作用[12]，利拉魯肽心血管結(jié)局長期評估試驗（LEADER）系列研究顯示，其可顯著降低2型糖尿病患者的主要不良心血管事件發(fā)生率，大血管事件與微血管事件發(fā)生率以及死亡率均有降低[13,14]。但是，最新發(fā)表在JAMA上的臨床研究顯示，無論是否合并糖尿病，利拉魯肽不能降低心力衰竭患者的再住院率及死亡率[15]，可能與心室早已發(fā)生不可逆性重構(gòu)有關(guān)。而在心肌梗死患者經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）前即開始予利拉魯肽治療，可提高患者PCI后的LVEF[16]。本研究在大鼠急性心肌梗死后即予利拉魯肽干預，也證明可改善心功能。

本研究還顯示，對照組MVD及VEGF蛋白表達均高于假手術(shù)組，可能與心肌梗死后的缺血、缺氧環(huán)境能刺激VEGF合成增多，促進血管新生，重建心肌血流，但這種保護性應答通常不足以恢復生理水平的心肌灌注，而給予利拉魯肽干預后MVD及VEGF蛋白表達明顯增加，表明利拉魯肽可能通過增加VEGF蛋白表達，促進心肌血管新生，保護心臟。而且由HE和Masson染色可見，利拉魯肽還可能通過減少炎癥反應，減輕心肌纖維化，發(fā)揮心肌保護作用，且呈劑量依賴性。

[1] 陳偉偉, 高潤霖, 劉力生, 等.《中國心血管病報告2015》概要. 中國循環(huán)雜志, 2016，31: 624-632.

[2] Writing Group Members, Mozaffarian D, Benjamin EJ, et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation, 2016, 133: e38-360.

[3] Bartnik M, Ryden L, Ferrari R, el a1. The prevalence of abnormal glucose regulation in patients with coronary artery disease across Europe．The Euro Heart Survey on diabetes and the heart. Eur Heart J,2004, 25: 1880-1890．

[4] Hu DY, Pan CY, Yu JM. The relationship between coronary artery disease and abnormal glucose regulation in China: the China Heart survey. Eur Heart J, 2006, 27: 2573-2579.

[5] Marso SP, Daniels GH, Brown-Frandsen K, et al. Liraglutide and cardiovascular outcomes in type 2 diabetes. N Engl J Med, 2016, 375:311-322.

[6] Armstrong MJ, Gaunt P, Aithal GP, et al. Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study. Lancet, 2016, 387: 679-690.

[7] Giglio RV, Patti AM, Nikolic D, et al. The extra-glycemic effects of liraglutide: focus on cardiometabolic markers. G Ital Cardiol (Rome),2016, 17: 253-258.

[8] Dutta P, Courties G, Wei Y, et al. Myocardial infarction accelerates atherosclerosis. Nature, 2012, 487: 325-329.

[9] Xiaoyun X, Zhaohui M, Ke C, et al. Glucagon-like peptide-1, improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregolating VEGF generation. Med Sci Monit, 2011: BR35-41.

[10] Zhang Y, Zhou H, Wu W, et al. Liraglutide protects cardiac microvascular endothelial cells against hypoxia/reoxygenation injury through the suppression of the SR-Ca(2+)-XO-ROS axis via activation of the GLP-1R/PI3K/Akt/survivin pathways. Free Radic Biol Med,2016, 95: 278-292.

[11] 程向娟, 王雄, 滕曉煥. 利拉魯肽可對抗大鼠心肌缺血再灌注損傷. 中華心血管病雜志, 2015, 43: 259-263.

[12] Smilowitz NR, Donnino R, Schwartzbard A．Glucagon like peptide-l receptor agonists for diabetes mellitus: a role in cardiovascular disease. Circulation, 2014, 129: 2305-2312．

[13] Petrie JR, Marso SP, Bain SC, et al. LEADER-4: blood pressure control in patients with type 2 diabetes and high cardiovascular risk:baseline data from the LEADER randomized trial. J Hypertens, 2016,34: 1140-1150.

[14] Masmiquel L, Leiter LA, Vidal J, et al. LEADER 5: prevalence and cardiometabolic impact of obesity in cardiovascular high-risk patients with type 2 diabetes mellitus: baseline global data from the LEADER trial. Cardiovasc Diabetol, 2016, 15: 1-15.

[15] Margulies KB, Hernandez AF, Redfield MM, et al. Effects of liraglutide on clinical stability among patients with advanced heart failure and reduced ejection fraction: a randomized clinical trial. JAMA, 2016,316: 500-508.

[16] Chen WR, Hu SY, Chen YD, et al. Effects of liraglutide on left ventricular function in patients with ST-segment elevation myocardial infarction undergoing primary percutaneous coronary intervention. Am Heart J, 2015, 170: 845-854.

2017-03-14）

（編輯：許菁）

Effects of Liraglutide on Angiogenesis and Myocardium Protection in Acute Myocardial Infarction Rats With its Mechanisms

LU Hui-fang, FANG Yi-jie, LI Yue, HUANG Yong-quan, LUO Li-yun, LIN Xiu-fang.

Department of Cardiology, the Fifth Aff i liated Hospital of Sun Yat-Sen University, Zhuhai (519000), Guangdong, China

LIN Xiu-fang, Email: linxiufang_126@126.com

Objective: To observe the effects of liraglutide on angiogenesis and myocardium protection in acute myocardial infarction (AMI) rats with its mechanisms.

Methods: Rat’s AMI model was established by left anterior descending of coronary ligation. AMI rats were randomly divided into 3 groups: Control group, the rats received subcutaneous injection of normal saline, Low dose (LS) group and High dose (HS) group, rats received subcutaneous injection of liraglutide 70μg/(kg?d) and 140μg/(kg?d) respectively; in addition, Sham operation group, rats received normal saline. n=6 in each group, all animals were treated for 2 weeks. 4 weeks later, cardiac structure and function were assessed by echocardiography, morphological changes of myocardium were observed by HE staining, collagen volume fraction (CVF) was calculated by Masson staining, myocardial microvessel density(MVD) and protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in marginal zone of infracted region were detected by immunohistochemistry, VEGF protein level was examined by Western blot analysis.

Results: Compared with Sham operation group, Control group showed decreased LVEF, LVFS and increased LVEDd,LVESd, CVF, all P＜0.01; while MVD and VEGF protein level were similar between 2 groups, P＞0.05. Compared with Control group, LS group and HS group had obviously increased LVEF, LVFS, P＜0.01 and decreased LVEDd, LVESd, P＜0.05,obviously decreased CVF, P＜0.01; obviously elevated MVD and VEGF protein level, P＜0.01. Compared with LS group, HS group presented obviously increased LVEF, LVFS, P＜0.01 and decreased LVEDd, LVESd, CVF, P＜0.05; elevated MVD and VEGF protein level, P＜0.01 or P＜0.05.

Conclusion: Liraglutide could improve angiogenesis in AMI rats which might be related to increased VEGF expression and reduced collagen deposition; therefore improve left ventricular systolic function for cardiac protection. The effect had certain relationship to liraglutide dosage.

Myocardial infarction; Angiogenesis; Liraglutide

519000 廣東省珠海市，中山大學附屬第五醫(yī)院 心血管內(nèi)科（盧慧芳、李玥、羅禮云、林岫芳），放射科（方義杰），超聲科（黃涌泉）

盧慧芳 碩士研究生 主要從事心血管疾病的臨床與基礎研究 Email: luhf99168@163.com 通訊作者：林岫芳 Email：linxiufang_126@126.com

R54

A

1000-3614（2017）11-1117-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.018

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1117.)