高杰，周建，蘇丕雄，劉巖，顧松，張希濤，安向光

臨床研究

永久性心房顫動患者左心房差異基因表達譜的建立與分析

高杰，周建，蘇丕雄，劉巖，顧松，張希濤，安向光

目的：探討與永久性心房顫動（pAF）發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因和信號通路，為研究pAF發(fā)生的分子機制提供基礎(chǔ)。

方法：用Agilent 4x44K 基因芯片分析pAF患者（n=7例）與竇性心律健康者（n=4例）的左心房組織mRNA，尋找差異表達的基因。以Gene Ontology（GO）和KEGG、Biocarta數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，分析差異表達基因參與的功能和信號通路。選取差異顯著的部分基因應(yīng)用實時定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）在5例pAF患者與5例竇性心律健康者標(biāo)本進行驗證。

結(jié)果：表達譜結(jié)果顯示，共有987個差異表達基因，其中567個基因表達下調(diào)，420個基因表達上調(diào)。選取9個差異顯著的基因在新一組的病例標(biāo)本上應(yīng)用qRT-PCR驗證，結(jié)果顯示均有統(tǒng)計學(xué)差異，且改變與芯片結(jié)果一致。這些基因通過參與左心房組織纖維化、電重構(gòu)、炎癥、細胞應(yīng)激、代謝調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等與pAF的發(fā)生密切相關(guān)。GO和Pathway分析表明下調(diào)的基因主要參與調(diào)節(jié)代謝，表達上調(diào)的基因影響細胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、血小板活化等過程。

結(jié)論：通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)與pAF發(fā)生相關(guān)的重要基因，通過影響細胞代謝、炎癥、免疫應(yīng)答、血栓形成等參與左心房的結(jié)構(gòu)、功能重構(gòu)。

心房顫動；基因表達譜

我國成人心房顫動（AF）患病率為0.64%，其中70歲以上人群高達0.89%[1]。AF增加腦卒中及其他血栓栓塞事件的發(fā)生率，約15%的腦卒中由AF引發(fā)[2]，還可導(dǎo)致室性心律失常和心功能不全。目前治療AF的手段也不理想[1]。AF的發(fā)病機制是研究的熱點和難點，尤其永久性心房顫動（pAF)，具有高異質(zhì)性和自我延續(xù)性的特點，其發(fā)病機制與心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)、神經(jīng)體液及分子表達異常等有關(guān)[3，4]?；蛐酒治隹梢酝ㄟ^高通量途徑研究差異性表達的基因，為pAF的發(fā)生、維持提供分子依據(jù)。本研究旨在應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析pAF患者與竇性心律健康者的左心房組織全基因表達譜，尋找與pAF發(fā)生和維持相關(guān)的基因，通過Gene Ontology（GO）和Pathway分析方法，分析與pAF發(fā)生相關(guān)的生物學(xué)過程和信號通路。

1 資料與方法

標(biāo)本采集及臨床資料：所有組織標(biāo)本均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心臟外科確診的7例pAF患者，4例竇性心律（SR）健康者為對照，pAF患者患病時間（47.7±25.0）個月，左心房組織取自AF射頻消融+左心耳切除術(shù)中，樣本大小約5 mm×10 mm×2 mm，為盡量減小樣本間差異，選取的心房組織均取自右肺靜脈入左心房口處。 4例竇性心律健康者的樣本組織取自心臟移植術(shù)的竇性心律的心臟供體。受試者的臨床資料見表1。獲取的樣本組織立即置于液氮罐中，由北京朝陽醫(yī)院倫理中心批準(zhǔn)，并與患者簽署知情協(xié)議書。

表1 7例永久性心房顫動患者和4例竇性心律健康者臨床資料

cRNA制備、標(biāo)記、芯片雜交：每例樣本取100 mg組織，BioPulverizerTM冰凍粉碎組織，加1 ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen公司），Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。瓊脂糖變性凝膠電泳對樣品總RNA進行完整性檢測，NanoDrop ND-1000分光光度法定量總RNA并評估純度。RNA標(biāo)記和芯片雜交按照Agilent單色芯片基因表達分析方法進行。cRNA合成并標(biāo)記：取1 μg總RNA轉(zhuǎn)錄合成cRNA，同時用Cy3-CTP 熒光染料標(biāo)記。使用QIAGEN RNeasy?Mini kit純化cRNA，用NanoDrop測得cRNA濃度。cRNA樣品片段化和芯片雜交：按以下配液 Cy3 cRNA 1.65g、10×Blocking Agent 11 μl、25×Fragmentation Buffer 2.2 μl、無核酸酶水補至總體積55 μl，在60℃溫浴30 min進行片段化。加入55 μl 2×GEx 雜交緩沖液稀釋cRNA。取100 μl上芯片，與Agilent人全基因組（4x44K）v2 芯片 （＞27 000探針）雜交，65℃，17 h，10 rpm滾動雜交，芯片洗滌后，Agilent掃描儀中掃描，掃描儀自動以100%和10%的光電耦合裝置各掃描一次，兩次結(jié)果Agilent軟件可自動合并。由上海康成生物公司提供技術(shù)幫助。

數(shù)據(jù)收集、分析：基因篩選：應(yīng)用10.7.3.1版Agilent萃取軟件，分析得到的陣列圖像，GeneSpring GX v11.5.1(Agilent)。完成篩選及后續(xù)數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用聚類分析和火山圖法分析，找到差異表達的mRNA（倍數(shù)變化＞2）。

GO和Pathway分析：按照GO將差異表達的基因分類，并依據(jù)KEGG和Biocarta數(shù)據(jù)庫進行Pathway分析，應(yīng)用Agilent GeneSpring GX 軟件的聚類分析法找出有意義的GO和Pathway。

實時定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）驗證：收集新一組的左心房組織標(biāo)本，其中pAF患者5例，SR健康者5例，臨床資料見表2。qRT- PCR驗證篩選的9個差異表達的基因，樣本用RNeasy mini kit試劑盒提取總RNA，取2μg RNA進行反轉(zhuǎn)錄。SYBR Green（Thermo Fisher Scientific）法進行qRTPCR驗證。引物設(shè)計如表3，采用18S作為內(nèi)參，結(jié)果是3次獨立實驗的平均值。

表2 5例永久性心房顫動患者和5例竇性心律健康者臨床資料

表3 引物設(shè)計

2 結(jié)果

2.1 pAF患者和SR健康者的左心房組織的差異表達基因

全基因組表達譜芯片結(jié)果顯示，共有987個差異表達基因，其中420個基因表達上調(diào)，567個基因表達下調(diào)（圖1），與pAF相關(guān)的表達發(fā)生顯著改變前10個上調(diào)和下調(diào)基因見表4。其中，表達升高最明顯的是B型腦利鈉肽前體蛋白（NPPB），比竇性心律健康者升高30倍。

2.2 差異表達基因的功能和代謝通路分析

為系統(tǒng)認識pAF差異表達基因的生物學(xué)功能，以GO、KEGG和Biocarta數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行分析。GO分析顯示下調(diào)基因的功能中有明確參與物質(zhì)代謝（圖2A），通過升高長鏈脂酰CoA合成酶3（ACSL3）、長鏈脂酰CoA脫氫酶（ACADL）下調(diào)脂肪酸、丙酸鹽代謝（圖2C）[5]，通過下調(diào)乙酰輔酶A羧化酶β（ACCβ）、脂肪酸合成酶（FASN）使脂肪酸的合成減少。Pathway分析也顯示下調(diào)的信號通路有脂肪酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、酪氨酸代謝，甘油酯類代謝、丙酸鹽代謝（圖2B）。

GO分析顯示上調(diào)基因的生物過程是細胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、血小板活化等，參與房顫的發(fā)生和維持機制（圖3A），例如白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、血小板4因子(PF4)等。其中，最重要的生物過程是免疫反應(yīng)和血小板激活（圖3C）。Pathway分析顯示上調(diào)的信號通路有細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路、細胞外基質(zhì)受體作用通路、補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)（圖3B），顯示出炎癥因子、免疫反應(yīng)、心房纖維化在pAF發(fā)生和維持中的作用。同時，病毒性心肌炎和肥厚性心肌病也是參與AF病理生理的因素之一。

圖1 永久性心房顫動患者和竇性心律健康者的左心房組織差異表達基因的熱圖（1A）和聚類分析圖（1B）

表4 表達譜芯片顯示永久性心房顫動患者表達顯著改變的前10個基因

圖2 差異表達下調(diào)基因的功能和通路分析

2.3 qRT- PCR驗證結(jié)果

為驗證芯片結(jié)果，收集新一組病例：pAF患者5例和SR健康者5例心房組織病例標(biāo)本進行qRT-PCR分析。選擇9個差異較大的感興趣目標(biāo)基因檢測，分別是碳酸酐 酶 14（CA14）， 細胞質(zhì)監(jiān)控基因；雷諾定受體 2（RyR2），肌漿網(wǎng)Ca2+通道受體；Delta like1同源物（DLK1），一種生長調(diào)節(jié)因子；肌球蛋白（MYH7）；結(jié)締組織生長因子（CTGF），左心房纖維化調(diào)節(jié)因子；IL-6，炎性因子；PF4，與凝血相關(guān)的細胞因子；熱休克蛋白70 kD蛋白-2 （HSPA2），細胞應(yīng)激反應(yīng)蛋白；NPPB。結(jié)果顯示均有顯著性變化，且改變與芯片結(jié)果一致（表5）。

圖3 差異表達上調(diào)基因的功能和通路分析

表5 差異表達基因的實時定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗證（結(jié)果是3次獨立實驗的均值）

3 討論

本研究通過生物芯片技術(shù)對pAF的差異表達基因進行初步篩選，發(fā)現(xiàn)差異表達基因987個，其中420個基因表達上調(diào)，567個基因表達下調(diào)。GO和Pathway分析顯示下調(diào)的基因主要參與細胞代謝如脂肪酸代謝，表達上調(diào)的基因影響細胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程。以下是本研究發(fā)現(xiàn)的AF相關(guān)基因和可能參與的AF發(fā)病機制。

左心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)：在致病因素刺激下，左心房為維持穩(wěn)態(tài)進行相應(yīng)的調(diào)整，形成新的表型，稱為結(jié)構(gòu)重構(gòu)。表現(xiàn)在心房肌細胞超微結(jié)構(gòu)的改變、心肌間質(zhì)膠原纖維重分布及纖維化等，結(jié)構(gòu)重構(gòu)可導(dǎo)致局部心肌電活動傳導(dǎo)異常，如使激動傳導(dǎo)速度減慢及傳導(dǎo)曲折復(fù)雜，從而易形成較多的微折返環(huán)，進而促進AF的發(fā)生發(fā)展[6，7]。 本研究發(fā)現(xiàn)左心房結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生改變，MYH7基因上調(diào)導(dǎo)致肌球蛋白由房性α-型向有收縮性質(zhì)的室性β-型轉(zhuǎn)變。心房纖維化也是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的基礎(chǔ)，本研究發(fā)現(xiàn)pAF患者CTGF顯著上調(diào)，說明心肌間質(zhì)纖維化增生。Pathway分析也顯示TGF-β信號通路、ECM-受體作用通路上調(diào)，提示心房纖維化結(jié)構(gòu)重構(gòu)在AF發(fā)生、進展中的重要作用[8]。

左心房的電重構(gòu)：Ca2+離子平衡失調(diào)在AF的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌RyR2在pAF患者表達顯著下調(diào)。正常心臟的Ca2+通過L型通道進入細胞并通過肌漿網(wǎng)上RyR2誘導(dǎo)Ca2+釋放，作為心肌細胞內(nèi)的鈣釋放通道，RyR2對心肌細胞內(nèi)游離鈣離子濃度有重要影響。本研究顯示pAF中RyR2表達顯著下降，RyR2降低使正常心肌細胞Ca2+泄漏促進心律失常發(fā)生。也有研究顯示在AF心肌細胞，RyR2有高磷酸化修飾，其靈敏度增加，誘發(fā)更多的Ca2+泄漏，導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+升高，Na+-Ca2+交換增加，提高舒張期Ca2+電壓，延遲心房去極化活動，誘導(dǎo)心律失常[9]。

左心房的脂肪酸代謝、氨基酸代謝下降：離子運輸、心肌細胞收縮和左心房壁的高張力都可增加能源需求，pAF患者的左心房能量代謝處于高水平。雖然早期心肌細胞增殖的能量來源于糖酵解，成熟心肌細胞獲得能量的主要方式是脂肪酸β氧化。然而，在AF發(fā)生過程中，一些脂肪酸合成、分解代謝的關(guān)鍵酶發(fā)生明顯改變，如ACSL3、ACADL表達升高，而ACCβ、FASN表達減少，脂肪酸的合成、氧化分解都被下調(diào)[10]。另外，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、酪氨酸代謝，甘油酯類代謝、丙酸鹽代謝也下調(diào)。Mayr等[11]發(fā)現(xiàn)心臟術(shù)后超過80%的患者如心肌代謝不正常都會導(dǎo)致AF，因此，在pAF發(fā)生中代謝功能障礙可能起重要作用。作為補償，在AF早期，通過糖酵解增加能源，在冠狀動靜脈的乳酸增加和一些糖酵解轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)也證明了這一點。Mayr等[11]用核磁共振波譜法發(fā)現(xiàn)在pAF患者心房組織β-羥基丁酸、生酮氨基酸的水平上升。從脂肪酸到葡萄糖的代謝轉(zhuǎn)換和酮體負反饋調(diào)節(jié)中，反映出AF患者左心房的高代謝狀態(tài)。β受體阻滯劑可以改善心肌代謝、減少心肌葡萄糖吸收、減輕心肌收縮和冠狀動脈血流從而減少心肌氧耗和代謝，從而減輕AF的臨床癥狀。

炎癥：目前研究提示炎癥在AF的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6在AF的左心房組織中表達超過正常2倍，作為多效性細胞因子，IL-6可能來源于免疫相關(guān)細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞，可以刺激纖維蛋白原和C反應(yīng)蛋白的合成，促進內(nèi)皮細胞的活化和損傷[12,13]。另有報道提示腫瘤壞死因子（TNF）的過表達可以下調(diào)Cx40，從而縮短有效不應(yīng)期并易產(chǎn)生房性心律失常[14]。另外，C反應(yīng)蛋白可能和AF有密切聯(lián)系，如Avikes等[15]在大規(guī)模前瞻性的隊列研究中發(fā)現(xiàn)C反應(yīng)蛋白 升高可以作為預(yù)測AF發(fā)生的獨立因素。同時，GO分析顯示細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路也上調(diào)，提示炎癥因子活化與AF發(fā)生密切相關(guān)。

本研究篩選出了一些與心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)密切相關(guān)的基因，為進一步探索pAF發(fā)病的分子機制及相關(guān)信號通路提供了線索。

[1] Magnani JW, Rienstra M, Lin H, et al. Atrial fibrillation: current knowledge and future directions in epidemiology and genomics.Circulation, 2011, 124:1982-1993.

[2] Wijffels MC, Kirchhof CJ, Dorland R, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation: A study in awake chronically instrumented goats.Circulation, 1995, 92: 1954-1968.

[3] Thijssen VL, Ausma J, Borgers M. Structural remodeling during chronic atrial fibrillation: act of programmed cell survival. Cardiovasc Res, 2001, 52: 14-24.

[4] Hoit BD, Shao Y, Gabel M, et al. Left arterial mechanical and biochemical adaptation to pacing induced heart failure. Cardiovasc Res, 1995, 29: 469-474.

[5] Poppelreuther M, Rudolph B, Du C, et al. The N-terminal region of acyl-CoA synthetase 3 is essential for both the localization on lipid droplets and the function in fatty acid uptake. J Lipid Res, 2012, 53:888-900.

[6] Ohki R, Yamamoto K, Ueno S, et al. Gene expression profiling of human atrial myocardium with atrial fibrillation by DNA microarray analysis. Int J Cardiol, 2005, 102: 233-238.

[7] Kim NH, Ahn Y, Oh SK, et al. Altered pattems of gene expression in response to chronic artial fibrillation. Int Heart J, 2005, 46: 383-395.

[8] Gu J, Liu X, Wang QX, et al. Angiotensin II increase CTGF expression via MAPKs/TGF-beta1/TRAF6 pathway in atrial fibroblasts. Exp Cell Res, 2012, 318: 2105-2115.

[9] Voigt N, Li N, Wang Q, et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+leak and invreased Na+-Ca2+exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.Circulation, 2012, 125: 2059-2070.

[10] Poppelreuther M, Rudolph B, Du C, et al. The N-terminal region of acyl-CoA synthetase 3 is essential for both the localization on lipid droplets and the function in fatty acid uptake. J Lipid Res, 2012, 53:888-900.

[11] Mayr M, Yusuf S, Weir G, et al. Combined metabolomic and proteomic analysis of human atrial fibrillation. J Am Coll Cardiol, 2008, 51: 585-594.

[12] Kaski JC, Arrebola-Moreno AL. Inflammation and thrombosis in atrial fibrillation. Rev Esp Cardiol, 2011, 65: 551-553.

[13] Marcus GM, Whooley MA, Glidden DV, et al. Interleukin-6 and atrial fibrillation in patients with coronary artery disease: data from the Heart and Soul Study. Am Heart J, 2008, 155: 303-309.

[14] Guo Y, Lip GY, Apostolakis S. Inflammation in atrial fibrillation. J Am Coll Cardiol, 2012, 60: 2263-2270.

[15] Avikes RJ, Martin DO, Apperson-Hansen C, et al. Inflammation as a risk factor for atrial fibrillation. Circulation, 2003, 108: 3006-3010.

2017-03-21）

（編輯：許菁）

Establishment and Analysis for Differential Gene Expression Profile of Left Atrium in Permanent Atrial Fibrillation Patients

GAO Jie, ZHOU Jian, SU Pi-xiong, LIU Yan, GU Song, ZHANG Xi-tao, AN Xiang-guang.

Department of Cardiac Surgery, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing (100020), China

AN Xiang-guang, Email: anxiangguang@sina.com

Objective: To explore the relevant gene, signaling pathway for permanent atrial fi brillation (pAF) occurrence in order to provide the molecular basis of the pathogenesis of pAF.

Methods: Our research included in 2 groups: pAF group, n=7 patients and Control group, n=4 healthy subjects with sinus rhythm. Agilent 4x44K microarray was used to analyze the mRNA in left atrium for differential gene expression prof i le.Based on Gene Ontology, KEGG and Biocarta databases, differentially expressed genes were studied for their relevant function and signaling pathway. Furthermore, the genes with signif i cant differences were verif i ed by quantitative real time PCR (qRT-PCR) in pathological specimen from 5 pAF patients and 5 normal heart donors.

Results: The expression prof i le identif i ed 987 abnormally expressed genes, 567 of them were down-regulated and 420 were up-regulated. 9 genes with signif i cant differences were verif i ed by qRT-PCR in pathological specimen and the changes were similar to microarray; those genes were closely related to pAF by involving left atrium fi brosis, electrical remodeling,inflammation, cellular stress response, metabolism and transcription regulation. GO and Pathway analysis indicated that down-regulated genes were mainly involved in metabolic processes; up-regulated genes had the effects on cellular stress response, immune response and platelet activation.

Conclusion: Microarray technology identif i ed some important genes related to pAF occurrence; such genes involved in left atrial structural and functional remodeling via affecting cellular metabolism, inflammation, immune response and thrombogenesis in relevant patients.

Atrial fi brillation; Gene expression prof i le

北京市教委科技面上項目（SQKM201410025018）

100020 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 心外科

高杰 副主任醫(yī)師 博士 主要從事心律失常學(xué)研究 Email：gaojie19750824@163.com 通訊作者：安向光 Email：anxiangguang@sina.com

R54

A

1000-3614（2017）11-1085-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.010

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1085.)