高杰,周建,蘇丕雄,劉巖,顧松,張希濤,安向光
臨床研究
永久性心房顫動患者左心房差異基因表達(dá)譜的建立與分析
高杰,周建,蘇丕雄,劉巖,顧松,張希濤,安向光
目的:探討與永久性心房顫動(pAF)發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因和信號通路,為研究pAF發(fā)生的分子機制提供基礎(chǔ)。
方法:用Agilent 4x44K 基因芯片分析pAF患者(n=7例)與竇性心律健康者(n=4例)的左心房組織mRNA,尋找差異表達(dá)的基因。以Gene Ontology(GO)和KEGG、Biocarta數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ),分析差異表達(dá)基因參與的功能和信號通路。選取差異顯著的部分基因應(yīng)用實時定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)在5例pAF患者與5例竇性心律健康者標(biāo)本進(jìn)行驗證。
結(jié)果:表達(dá)譜結(jié)果顯示,共有987個差異表達(dá)基因,其中567個基因表達(dá)下調(diào),420個基因表達(dá)上調(diào)。選取9個差異顯著的基因在新一組的病例標(biāo)本上應(yīng)用qRT-PCR驗證,結(jié)果顯示均有統(tǒng)計學(xué)差異,且改變與芯片結(jié)果一致。這些基因通過參與左心房組織纖維化、電重構(gòu)、炎癥、細(xì)胞應(yīng)激、代謝調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等與pAF的發(fā)生密切相關(guān)。GO和Pathway分析表明下調(diào)的基因主要參與調(diào)節(jié)代謝,表達(dá)上調(diào)的基因影響細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、血小板活化等過程。
結(jié)論:通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)與pAF發(fā)生相關(guān)的重要基因,通過影響細(xì)胞代謝、炎癥、免疫應(yīng)答、血栓形成等參與左心房的結(jié)構(gòu)、功能重構(gòu)。
心房顫動;基因表達(dá)譜
我國成人心房顫動(AF)患病率為0.64%,其中70歲以上人群高達(dá)0.89%[1]。AF增加腦卒中及其他血栓栓塞事件的發(fā)生率,約15%的腦卒中由AF引發(fā)[2],還可導(dǎo)致室性心律失常和心功能不全。目前治療AF的手段也不理想[1]。AF的發(fā)病機制是研究的熱點和難點,尤其永久性心房顫動(pAF),具有高異質(zhì)性和自我延續(xù)性的特點,其發(fā)病機制與心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)、神經(jīng)體液及分子表達(dá)異常等有關(guān)[3,4]?;蛐酒治隹梢酝ㄟ^高通量途徑研究差異性表達(dá)的基因,為pAF的發(fā)生、維持提供分子依據(jù)。本研究旨在應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析pAF患者與竇性心律健康者的左心房組織全基因表達(dá)譜,尋找與pAF發(fā)生和維持相關(guān)的基因,通過Gene Ontology(GO)和Pathway分析方法,分析與pAF發(fā)生相關(guān)的生物學(xué)過程和信號通路。
標(biāo)本采集及臨床資料:所有組織標(biāo)本均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心臟外科確診的7例pAF患者,4例竇性心律(SR)健康者為對照,pAF患者患病時間(47.7±25.0)個月,左心房組織取自AF射頻消融+左心耳切除術(shù)中,樣本大小約5 mm×10 mm×2 mm,為盡量減小樣本間差異,選取的心房組織均取自右肺靜脈入左心房口處。 4例竇性心律健康者的樣本組織取自心臟移植術(shù)的竇性心律的心臟供體。受試者的臨床資料見表1。獲取的樣本組織立即置于液氮罐中,由北京朝陽醫(yī)院倫理中心批準(zhǔn),并與患者簽署知情協(xié)議書。
表1 7例永久性心房顫動患者和4例竇性心律健康者臨床資料
cRNA制備、標(biāo)記、芯片雜交:每例樣本取100 mg組織,BioPulverizerTM冰凍粉碎組織,加1 ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen公司),Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。瓊脂糖變性凝膠電泳對樣品總RNA進(jìn)行完整性檢測,NanoDrop ND-1000分光光度法定量總RNA并評估純度。RNA標(biāo)記和芯片雜交按照Agilent單色芯片基因表達(dá)分析方法進(jìn)行。cRNA合成并標(biāo)記:取1 μg總RNA轉(zhuǎn)錄合成cRNA,同時用Cy3-CTP 熒光染料標(biāo)記。使用QIAGEN RNeasy?Mini kit純化cRNA,用NanoDrop測得cRNA濃度。cRNA樣品片段化和芯片雜交:按以下配液 Cy3 cRNA 1.65g、10×Blocking Agent 11 μl、25×Fragmentation Buffer 2.2 μl、無核酸酶水補至總體積55 μl,在60℃溫浴30 min進(jìn)行片段化。加入55 μl 2×GEx 雜交緩沖液稀釋cRNA。取100 μl上芯片,與Agilent人全基因組(4x44K)v2 芯片 (>27 000探針)雜交,65℃,17 h,10 rpm滾動雜交,芯片洗滌后,Agilent掃描儀中掃描,掃描儀自動以100%和10%的光電耦合裝置各掃描一次,兩次結(jié)果Agilent軟件可自動合并。由上海康成生物公司提供技術(shù)幫助。
數(shù)據(jù)收集、分析:基因篩選:應(yīng)用10.7.3.1版Agilent萃取軟件,分析得到的陣列圖像,GeneSpring GX v11.5.1(Agilent)。完成篩選及后續(xù)數(shù)據(jù)分析,應(yīng)用聚類分析和火山圖法分析,找到差異表達(dá)的mRNA(倍數(shù)變化>2)。
GO和Pathway分析:按照GO將差異表達(dá)的基因分類,并依據(jù)KEGG和Biocarta數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Pathway分析,應(yīng)用Agilent GeneSpring GX 軟件的聚類分析法找出有意義的GO和Pathway。
實時定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)驗證:收集新一組的左心房組織標(biāo)本,其中pAF患者5例,SR健康者5例,臨床資料見表2。qRT- PCR驗證篩選的9個差異表達(dá)的基因,樣本用RNeasy mini kit試劑盒提取總RNA,取2μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。SYBR Green(Thermo Fisher Scientific)法進(jìn)行qRTPCR驗證。引物設(shè)計如表3,采用18S作為內(nèi)參,結(jié)果是3次獨立實驗的平均值。
表2 5例永久性心房顫動患者和5例竇性心律健康者臨床資料
表3 引物設(shè)計
全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,共有987個差異表達(dá)基因,其中420個基因表達(dá)上調(diào),567個基因表達(dá)下調(diào)(圖1),與pAF相關(guān)的表達(dá)發(fā)生顯著改變前10個上調(diào)和下調(diào)基因見表4。其中,表達(dá)升高最明顯的是B型腦利鈉肽前體蛋白(NPPB),比竇性心律健康者升高30倍。
為系統(tǒng)認(rèn)識pAF差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能,以GO、KEGG和Biocarta數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。GO分析顯示下調(diào)基因的功能中有明確參與物質(zhì)代謝(圖2A),通過升高長鏈脂酰CoA合成酶3(ACSL3)、長鏈脂酰CoA脫氫酶(ACADL)下調(diào)脂肪酸、丙酸鹽代謝(圖2C)[5],通過下調(diào)乙酰輔酶A羧化酶β(ACCβ)、脂肪酸合成酶(FASN)使脂肪酸的合成減少。Pathway分析也顯示下調(diào)的信號通路有脂肪酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、酪氨酸代謝,甘油酯類代謝、丙酸鹽代謝(圖2B)。
GO分析顯示上調(diào)基因的生物過程是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、血小板活化等,參與房顫的發(fā)生和維持機制(圖3A),例如白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、血小板4因子(PF4)等。其中,最重要的生物過程是免疫反應(yīng)和血小板激活(圖3C)。Pathway分析顯示上調(diào)的信號通路有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體作用通路、補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)(圖3B),顯示出炎癥因子、免疫反應(yīng)、心房纖維化在pAF發(fā)生和維持中的作用。同時,病毒性心肌炎和肥厚性心肌病也是參與AF病理生理的因素之一。
圖1 永久性心房顫動患者和竇性心律健康者的左心房組織差異表達(dá)基因的熱圖(1A)和聚類分析圖(1B)
表4 表達(dá)譜芯片顯示永久性心房顫動患者表達(dá)顯著改變的前10個基因
圖2 差異表達(dá)下調(diào)基因的功能和通路分析
為驗證芯片結(jié)果,收集新一組病例:pAF患者5例和SR健康者5例心房組織病例標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR分析。選擇9個差異較大的感興趣目標(biāo)基因檢測,分別是碳酸酐 酶 14(CA14), 細(xì)胞質(zhì)監(jiān)控基因;雷諾定受體 2(RyR2),肌漿網(wǎng)Ca2+通道受體;Delta like1同源物(DLK1),一種生長調(diào)節(jié)因子;肌球蛋白(MYH7);結(jié)締組織生長因子(CTGF),左心房纖維化調(diào)節(jié)因子;IL-6,炎性因子;PF4,與凝血相關(guān)的細(xì)胞因子;熱休克蛋白70 kD蛋白-2 (HSPA2),細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)蛋白;NPPB。結(jié)果顯示均有顯著性變化,且改變與芯片結(jié)果一致(表5)。
圖3 差異表達(dá)上調(diào)基因的功能和通路分析
表5 差異表達(dá)基因的實時定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗證(結(jié)果是3次獨立實驗的均值)
本研究通過生物芯片技術(shù)對pAF的差異表達(dá)基因進(jìn)行初步篩選,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因987個,其中420個基因表達(dá)上調(diào),567個基因表達(dá)下調(diào)。GO和Pathway分析顯示下調(diào)的基因主要參與細(xì)胞代謝如脂肪酸代謝,表達(dá)上調(diào)的基因影響細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程。以下是本研究發(fā)現(xiàn)的AF相關(guān)基因和可能參與的AF發(fā)病機制。
左心房結(jié)構(gòu)重構(gòu):在致病因素刺激下,左心房為維持穩(wěn)態(tài)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整,形成新的表型,稱為結(jié)構(gòu)重構(gòu)。表現(xiàn)在心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變、心肌間質(zhì)膠原纖維重分布及纖維化等,結(jié)構(gòu)重構(gòu)可導(dǎo)致局部心肌電活動傳導(dǎo)異常,如使激動傳導(dǎo)速度減慢及傳導(dǎo)曲折復(fù)雜,從而易形成較多的微折返環(huán),進(jìn)而促進(jìn)AF的發(fā)生發(fā)展[6,7]。 本研究發(fā)現(xiàn)左心房結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生改變,MYH7基因上調(diào)導(dǎo)致肌球蛋白由房性α-型向有收縮性質(zhì)的室性β-型轉(zhuǎn)變。心房纖維化也是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的基礎(chǔ),本研究發(fā)現(xiàn)pAF患者CTGF顯著上調(diào),說明心肌間質(zhì)纖維化增生。Pathway分析也顯示TGF-β信號通路、ECM-受體作用通路上調(diào),提示心房纖維化結(jié)構(gòu)重構(gòu)在AF發(fā)生、進(jìn)展中的重要作用[8]。
左心房的電重構(gòu):Ca2+離子平衡失調(diào)在AF的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),心肌RyR2在pAF患者表達(dá)顯著下調(diào)。正常心臟的Ca2+通過L型通道進(jìn)入細(xì)胞并通過肌漿網(wǎng)上RyR2誘導(dǎo)Ca2+釋放,作為心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣釋放通道,RyR2對心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度有重要影響。本研究顯示pAF中RyR2表達(dá)顯著下降,RyR2降低使正常心肌細(xì)胞Ca2+泄漏促進(jìn)心律失常發(fā)生。也有研究顯示在AF心肌細(xì)胞,RyR2有高磷酸化修飾,其靈敏度增加,誘發(fā)更多的Ca2+泄漏,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高,Na+-Ca2+交換增加,提高舒張期Ca2+電壓,延遲心房去極化活動,誘導(dǎo)心律失常[9]。
左心房的脂肪酸代謝、氨基酸代謝下降:離子運輸、心肌細(xì)胞收縮和左心房壁的高張力都可增加能源需求,pAF患者的左心房能量代謝處于高水平。雖然早期心肌細(xì)胞增殖的能量來源于糖酵解,成熟心肌細(xì)胞獲得能量的主要方式是脂肪酸β氧化。然而,在AF發(fā)生過程中,一些脂肪酸合成、分解代謝的關(guān)鍵酶發(fā)生明顯改變,如ACSL3、ACADL表達(dá)升高,而ACCβ、FASN表達(dá)減少,脂肪酸的合成、氧化分解都被下調(diào)[10]。另外,半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、酪氨酸代謝,甘油酯類代謝、丙酸鹽代謝也下調(diào)。Mayr等[11]發(fā)現(xiàn)心臟術(shù)后超過80%的患者如心肌代謝不正常都會導(dǎo)致AF,因此,在pAF發(fā)生中代謝功能障礙可能起重要作用。作為補償,在AF早期,通過糖酵解增加能源,在冠狀動靜脈的乳酸增加和一些糖酵解轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)也證明了這一點。Mayr等[11]用核磁共振波譜法發(fā)現(xiàn)在pAF患者心房組織β-羥基丁酸、生酮氨基酸的水平上升。從脂肪酸到葡萄糖的代謝轉(zhuǎn)換和酮體負(fù)反饋調(diào)節(jié)中,反映出AF患者左心房的高代謝狀態(tài)。β受體阻滯劑可以改善心肌代謝、減少心肌葡萄糖吸收、減輕心肌收縮和冠狀動脈血流從而減少心肌氧耗和代謝,從而減輕AF的臨床癥狀。
炎癥:目前研究提示炎癥在AF的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6在AF的左心房組織中表達(dá)超過正常2倍,作為多效性細(xì)胞因子,IL-6可能來源于免疫相關(guān)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞,可以刺激纖維蛋白原和C反應(yīng)蛋白的合成,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的活化和損傷[12,13]。另有報道提示腫瘤壞死因子(TNF)的過表達(dá)可以下調(diào)Cx40,從而縮短有效不應(yīng)期并易產(chǎn)生房性心律失常[14]。另外,C反應(yīng)蛋白可能和AF有密切聯(lián)系,如Avikes等[15]在大規(guī)模前瞻性的隊列研究中發(fā)現(xiàn)C反應(yīng)蛋白 升高可以作為預(yù)測AF發(fā)生的獨立因素。同時,GO分析顯示細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路也上調(diào),提示炎癥因子活化與AF發(fā)生密切相關(guān)。
本研究篩選出了一些與心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)密切相關(guān)的基因,為進(jìn)一步探索pAF發(fā)病的分子機制及相關(guān)信號通路提供了線索。
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2017-03-21)
(編輯:許菁)
Establishment and Analysis for Differential Gene Expression Profile of Left Atrium in Permanent Atrial Fibrillation Patients
GAO Jie, ZHOU Jian, SU Pi-xiong, LIU Yan, GU Song, ZHANG Xi-tao, AN Xiang-guang.
Department of Cardiac Surgery, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing (100020), China
AN Xiang-guang, Email: anxiangguang@sina.com
Objective: To explore the relevant gene, signaling pathway for permanent atrial fi brillation (pAF) occurrence in order to provide the molecular basis of the pathogenesis of pAF.
Methods: Our research included in 2 groups: pAF group, n=7 patients and Control group, n=4 healthy subjects with sinus rhythm. Agilent 4x44K microarray was used to analyze the mRNA in left atrium for differential gene expression prof i le.Based on Gene Ontology, KEGG and Biocarta databases, differentially expressed genes were studied for their relevant function and signaling pathway. Furthermore, the genes with signif i cant differences were verif i ed by quantitative real time PCR (qRT-PCR) in pathological specimen from 5 pAF patients and 5 normal heart donors.
Results: The expression prof i le identif i ed 987 abnormally expressed genes, 567 of them were down-regulated and 420 were up-regulated. 9 genes with signif i cant differences were verif i ed by qRT-PCR in pathological specimen and the changes were similar to microarray; those genes were closely related to pAF by involving left atrium fi brosis, electrical remodeling,inflammation, cellular stress response, metabolism and transcription regulation. GO and Pathway analysis indicated that down-regulated genes were mainly involved in metabolic processes; up-regulated genes had the effects on cellular stress response, immune response and platelet activation.
Conclusion: Microarray technology identif i ed some important genes related to pAF occurrence; such genes involved in left atrial structural and functional remodeling via affecting cellular metabolism, inflammation, immune response and thrombogenesis in relevant patients.
Atrial fi brillation; Gene expression prof i le
北京市教委科技面上項目(SQKM201410025018)
100020 北京市,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 心外科
高杰 副主任醫(yī)師 博士 主要從事心律失常學(xué)研究 Email:gaojie19750824@163.com 通訊作者:安向光 Email:anxiangguang@sina.com
R54
A
1000-3614(2017)11-1085-06
10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.010
(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1085.)