高杰，周建，蘇丕雄，劉巖，顧松，張希濤，安向光

臨床研究

永久性心房顫動患者左心房差異基因表達(dá)譜的建立與分析

高杰，周建，蘇丕雄，劉巖，顧松，張希濤，安向光

目的：探討與永久性心房顫動（pAF）發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因和信號通路，為研究pAF發(fā)生的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

方法：用Agilent 4x44K 基因芯片分析pAF患者（n=7例）與竇性心律健康者（n=4例）的左心房組織mRNA，尋找差異表達(dá)的基因。以Gene Ontology（GO）和KEGG、Biocarta數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，分析差異表達(dá)基因參與的功能和信號通路。選取差異顯著的部分基因應(yīng)用實(shí)時定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）在5例pAF患者與5例竇性心律健康者標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié)果：表達(dá)譜結(jié)果顯示，共有987個差異表達(dá)基因，其中567個基因表達(dá)下調(diào)，420個基因表達(dá)上調(diào)。選取9個差異顯著的基因在新一組的病例標(biāo)本上應(yīng)用qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示均有統(tǒng)計學(xué)差異，且改變與芯片結(jié)果一致。這些基因通過參與左心房組織纖維化、電重構(gòu)、炎癥、細(xì)胞應(yīng)激、代謝調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等與pAF的發(fā)生密切相關(guān)。GO和Pathway分析表明下調(diào)的基因主要參與調(diào)節(jié)代謝，表達(dá)上調(diào)的基因影響細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、血小板活化等過程。

結(jié)論：通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)與pAF發(fā)生相關(guān)的重要基因，通過影響細(xì)胞代謝、炎癥、免疫應(yīng)答、血栓形成等參與左心房的結(jié)構(gòu)、功能重構(gòu)。

心房顫動；基因表達(dá)譜

我國成人心房顫動（AF）患病率為0.64%，其中70歲以上人群高達(dá)0.89%[1]。AF增加腦卒中及其他血栓栓塞事件的發(fā)生率，約15%的腦卒中由AF引發(fā)[2]，還可導(dǎo)致室性心律失常和心功能不全。目前治療AF的手段也不理想[1]。AF的發(fā)病機(jī)制是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，尤其永久性心房顫動（pAF)，具有高異質(zhì)性和自我延續(xù)性的特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制與心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)、神經(jīng)體液及分子表達(dá)異常等有關(guān)[3，4]?；蛐酒治隹梢酝ㄟ^高通量途徑研究差異性表達(dá)的基因，為pAF的發(fā)生、維持提供分子依據(jù)。本研究旨在應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析pAF患者與竇性心律健康者的左心房組織全基因表達(dá)譜，尋找與pAF發(fā)生和維持相關(guān)的基因，通過Gene Ontology（GO）和Pathway分析方法，分析與pAF發(fā)生相關(guān)的生物學(xué)過程和信號通路。

1 資料與方法

標(biāo)本采集及臨床資料：所有組織標(biāo)本均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心臟外科確診的7例pAF患者，4例竇性心律（SR）健康者為對照，pAF患者患病時間（47.7±25.0）個月，左心房組織取自AF射頻消融+左心耳切除術(shù)中，樣本大小約5 mm×10 mm×2 mm，為盡量減小樣本間差異，選取的心房組織均取自右肺靜脈入左心房口處。 4例竇性心律健康者的樣本組織取自心臟移植術(shù)的竇性心律的心臟供體。受試者的臨床資料見表1。獲取的樣本組織立即置于液氮罐中，由北京朝陽醫(yī)院倫理中心批準(zhǔn)，并與患者簽署知情協(xié)議書。

表1 7例永久性心房顫動患者和4例竇性心律健康者臨床資料

cRNA制備、標(biāo)記、芯片雜交：每例樣本取100 mg組織，BioPulverizerTM冰凍粉碎組織，加1 ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen公司），Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。瓊脂糖變性凝膠電泳對樣品總RNA進(jìn)行完整性檢測，NanoDrop ND-1000分光光度法定量總RNA并評估純度。RNA標(biāo)記和芯片雜交按照Agilent單色芯片基因表達(dá)分析方法進(jìn)行。cRNA合成并標(biāo)記：取1 μg總RNA轉(zhuǎn)錄合成cRNA，同時用Cy3-CTP 熒光染料標(biāo)記。使用QIAGEN RNeasy?Mini kit純化cRNA，用NanoDrop測得cRNA濃度。cRNA樣品片段化和芯片雜交：按以下配液 Cy3 cRNA 1.65g、10×Blocking Agent 11 μl、25×Fragmentation Buffer 2.2 μl、無核酸酶水補(bǔ)至總體積55 μl，在60℃溫浴30 min進(jìn)行片段化。加入55 μl 2×GEx 雜交緩沖液稀釋cRNA。取100 μl上芯片，與Agilent人全基因組（4x44K）v2 芯片 （＞27 000探針）雜交，65℃，17 h，10 rpm滾動雜交，芯片洗滌后，Agilent掃描儀中掃描，掃描儀自動以100%和10%的光電耦合裝置各掃描一次，兩次結(jié)果Agilent軟件可自動合并。由上海康成生物公司提供技術(shù)幫助。

數(shù)據(jù)收集、分析：基因篩選：應(yīng)用10.7.3.1版Agilent萃取軟件，分析得到的陣列圖像，GeneSpring GX v11.5.1(Agilent)。完成篩選及后續(xù)數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用聚類分析和火山圖法分析，找到差異表達(dá)的mRNA（倍數(shù)變化＞2）。

GO和Pathway分析：按照GO將差異表達(dá)的基因分類，并依據(jù)KEGG和Biocarta數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Pathway分析，應(yīng)用Agilent GeneSpring GX 軟件的聚類分析法找出有意義的GO和Pathway。

實(shí)時定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）驗(yàn)證：收集新一組的左心房組織標(biāo)本，其中pAF患者5例，SR健康者5例，臨床資料見表2。qRT- PCR驗(yàn)證篩選的9個差異表達(dá)的基因，樣本用RNeasy mini kit試劑盒提取總RNA，取2μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。SYBR Green（Thermo Fisher Scientific）法進(jìn)行qRTPCR驗(yàn)證。引物設(shè)計如表3，采用18S作為內(nèi)參，結(jié)果是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。

表2 5例永久性心房顫動患者和5例竇性心律健康者臨床資料

表3 引物設(shè)計

2 結(jié)果

2.1 pAF患者和SR健康者的左心房組織的差異表達(dá)基因

全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，共有987個差異表達(dá)基因，其中420個基因表達(dá)上調(diào)，567個基因表達(dá)下調(diào)（圖1），與pAF相關(guān)的表達(dá)發(fā)生顯著改變前10個上調(diào)和下調(diào)基因見表4。其中，表達(dá)升高最明顯的是B型腦利鈉肽前體蛋白（NPPB），比竇性心律健康者升高30倍。

2.2 差異表達(dá)基因的功能和代謝通路分析

為系統(tǒng)認(rèn)識pAF差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，以GO、KEGG和Biocarta數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。GO分析顯示下調(diào)基因的功能中有明確參與物質(zhì)代謝（圖2A），通過升高長鏈脂酰CoA合成酶3（ACSL3）、長鏈脂酰CoA脫氫酶（ACADL）下調(diào)脂肪酸、丙酸鹽代謝（圖2C）[5]，通過下調(diào)乙酰輔酶A羧化酶β（ACCβ）、脂肪酸合成酶（FASN）使脂肪酸的合成減少。Pathway分析也顯示下調(diào)的信號通路有脂肪酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、酪氨酸代謝，甘油酯類代謝、丙酸鹽代謝（圖2B）。

GO分析顯示上調(diào)基因的生物過程是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、血小板活化等，參與房顫的發(fā)生和維持機(jī)制（圖3A），例如白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、血小板4因子(PF4)等。其中，最重要的生物過程是免疫反應(yīng)和血小板激活（圖3C）。Pathway分析顯示上調(diào)的信號通路有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體作用通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)（圖3B），顯示出炎癥因子、免疫反應(yīng)、心房纖維化在pAF發(fā)生和維持中的作用。同時，病毒性心肌炎和肥厚性心肌病也是參與AF病理生理的因素之一。

圖1 永久性心房顫動患者和竇性心律健康者的左心房組織差異表達(dá)基因的熱圖（1A）和聚類分析圖（1B）

表4 表達(dá)譜芯片顯示永久性心房顫動患者表達(dá)顯著改變的前10個基因

圖2 差異表達(dá)下調(diào)基因的功能和通路分析

2.3 qRT- PCR驗(yàn)證結(jié)果

為驗(yàn)證芯片結(jié)果，收集新一組病例：pAF患者5例和SR健康者5例心房組織病例標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR分析。選擇9個差異較大的感興趣目標(biāo)基因檢測，分別是碳酸酐 酶 14（CA14）， 細(xì)胞質(zhì)監(jiān)控基因；雷諾定受體 2（RyR2），肌漿網(wǎng)Ca2+通道受體；Delta like1同源物（DLK1），一種生長調(diào)節(jié)因子；肌球蛋白（MYH7）；結(jié)締組織生長因子（CTGF），左心房纖維化調(diào)節(jié)因子；IL-6，炎性因子；PF4，與凝血相關(guān)的細(xì)胞因子；熱休克蛋白70 kD蛋白-2 （HSPA2），細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)蛋白；NPPB。結(jié)果顯示均有顯著性變化，且改變與芯片結(jié)果一致（表5）。

圖3 差異表達(dá)上調(diào)基因的功能和通路分析

表5 差異表達(dá)基因的實(shí)時定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證（結(jié)果是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值）

3 討論

本研究通過生物芯片技術(shù)對pAF的差異表達(dá)基因進(jìn)行初步篩選，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因987個，其中420個基因表達(dá)上調(diào)，567個基因表達(dá)下調(diào)。GO和Pathway分析顯示下調(diào)的基因主要參與細(xì)胞代謝如脂肪酸代謝，表達(dá)上調(diào)的基因影響細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程。以下是本研究發(fā)現(xiàn)的AF相關(guān)基因和可能參與的AF發(fā)病機(jī)制。

左心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)：在致病因素刺激下，左心房為維持穩(wěn)態(tài)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，形成新的表型，稱為結(jié)構(gòu)重構(gòu)。表現(xiàn)在心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變、心肌間質(zhì)膠原纖維重分布及纖維化等，結(jié)構(gòu)重構(gòu)可導(dǎo)致局部心肌電活動傳導(dǎo)異常，如使激動傳導(dǎo)速度減慢及傳導(dǎo)曲折復(fù)雜，從而易形成較多的微折返環(huán)，進(jìn)而促進(jìn)AF的發(fā)生發(fā)展[6，7]。 本研究發(fā)現(xiàn)左心房結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生改變，MYH7基因上調(diào)導(dǎo)致肌球蛋白由房性α-型向有收縮性質(zhì)的室性β-型轉(zhuǎn)變。心房纖維化也是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的基礎(chǔ)，本研究發(fā)現(xiàn)pAF患者CTGF顯著上調(diào)，說明心肌間質(zhì)纖維化增生。Pathway分析也顯示TGF-β信號通路、ECM-受體作用通路上調(diào)，提示心房纖維化結(jié)構(gòu)重構(gòu)在AF發(fā)生、進(jìn)展中的重要作用[8]。

左心房的電重構(gòu)：Ca2+離子平衡失調(diào)在AF的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌RyR2在pAF患者表達(dá)顯著下調(diào)。正常心臟的Ca2+通過L型通道進(jìn)入細(xì)胞并通過肌漿網(wǎng)上RyR2誘導(dǎo)Ca2+釋放，作為心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣釋放通道，RyR2對心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度有重要影響。本研究顯示pAF中RyR2表達(dá)顯著下降，RyR2降低使正常心肌細(xì)胞Ca2+泄漏促進(jìn)心律失常發(fā)生。也有研究顯示在AF心肌細(xì)胞，RyR2有高磷酸化修飾，其靈敏度增加，誘發(fā)更多的Ca2+泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，Na+-Ca2+交換增加，提高舒張期Ca2+電壓，延遲心房去極化活動，誘導(dǎo)心律失常[9]。

左心房的脂肪酸代謝、氨基酸代謝下降：離子運(yùn)輸、心肌細(xì)胞收縮和左心房壁的高張力都可增加能源需求，pAF患者的左心房能量代謝處于高水平。雖然早期心肌細(xì)胞增殖的能量來源于糖酵解，成熟心肌細(xì)胞獲得能量的主要方式是脂肪酸β氧化。然而，在AF發(fā)生過程中，一些脂肪酸合成、分解代謝的關(guān)鍵酶發(fā)生明顯改變，如ACSL3、ACADL表達(dá)升高，而ACCβ、FASN表達(dá)減少，脂肪酸的合成、氧化分解都被下調(diào)[10]。另外，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、酪氨酸代謝，甘油酯類代謝、丙酸鹽代謝也下調(diào)。Mayr等[11]發(fā)現(xiàn)心臟術(shù)后超過80%的患者如心肌代謝不正常都會導(dǎo)致AF，因此，在pAF發(fā)生中代謝功能障礙可能起重要作用。作為補(bǔ)償，在AF早期，通過糖酵解增加能源，在冠狀動靜脈的乳酸增加和一些糖酵解轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)也證明了這一點(diǎn)。Mayr等[11]用核磁共振波譜法發(fā)現(xiàn)在pAF患者心房組織β-羥基丁酸、生酮氨基酸的水平上升。從脂肪酸到葡萄糖的代謝轉(zhuǎn)換和酮體負(fù)反饋調(diào)節(jié)中，反映出AF患者左心房的高代謝狀態(tài)。β受體阻滯劑可以改善心肌代謝、減少心肌葡萄糖吸收、減輕心肌收縮和冠狀動脈血流從而減少心肌氧耗和代謝，從而減輕AF的臨床癥狀。

炎癥：目前研究提示炎癥在AF的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6在AF的左心房組織中表達(dá)超過正常2倍，作為多效性細(xì)胞因子，IL-6可能來源于免疫相關(guān)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞，可以刺激纖維蛋白原和C反應(yīng)蛋白的合成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的活化和損傷[12,13]。另有報道提示腫瘤壞死因子（TNF）的過表達(dá)可以下調(diào)Cx40，從而縮短有效不應(yīng)期并易產(chǎn)生房性心律失常[14]。另外，C反應(yīng)蛋白可能和AF有密切聯(lián)系，如Avikes等[15]在大規(guī)模前瞻性的隊列研究中發(fā)現(xiàn)C反應(yīng)蛋白 升高可以作為預(yù)測AF發(fā)生的獨(dú)立因素。同時，GO分析顯示細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路也上調(diào)，提示炎癥因子活化與AF發(fā)生密切相關(guān)。

本研究篩選出了一些與心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)密切相關(guān)的基因，為進(jìn)一步探索pAF發(fā)病的分子機(jī)制及相關(guān)信號通路提供了線索。

[1] Magnani JW, Rienstra M, Lin H, et al. Atrial fibrillation: current knowledge and future directions in epidemiology and genomics.Circulation, 2011, 124:1982-1993.

[2] Wijffels MC, Kirchhof CJ, Dorland R, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation: A study in awake chronically instrumented goats.Circulation, 1995, 92: 1954-1968.

[3] Thijssen VL, Ausma J, Borgers M. Structural remodeling during chronic atrial fibrillation: act of programmed cell survival. Cardiovasc Res, 2001, 52: 14-24.

[4] Hoit BD, Shao Y, Gabel M, et al. Left arterial mechanical and biochemical adaptation to pacing induced heart failure. Cardiovasc Res, 1995, 29: 469-474.

[5] Poppelreuther M, Rudolph B, Du C, et al. The N-terminal region of acyl-CoA synthetase 3 is essential for both the localization on lipid droplets and the function in fatty acid uptake. J Lipid Res, 2012, 53:888-900.

[6] Ohki R, Yamamoto K, Ueno S, et al. Gene expression profiling of human atrial myocardium with atrial fibrillation by DNA microarray analysis. Int J Cardiol, 2005, 102: 233-238.

[7] Kim NH, Ahn Y, Oh SK, et al. Altered pattems of gene expression in response to chronic artial fibrillation. Int Heart J, 2005, 46: 383-395.

[8] Gu J, Liu X, Wang QX, et al. Angiotensin II increase CTGF expression via MAPKs/TGF-beta1/TRAF6 pathway in atrial fibroblasts. Exp Cell Res, 2012, 318: 2105-2115.

[9] Voigt N, Li N, Wang Q, et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+leak and invreased Na+-Ca2+exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.Circulation, 2012, 125: 2059-2070.

[10] Poppelreuther M, Rudolph B, Du C, et al. The N-terminal region of acyl-CoA synthetase 3 is essential for both the localization on lipid droplets and the function in fatty acid uptake. J Lipid Res, 2012, 53:888-900.

[11] Mayr M, Yusuf S, Weir G, et al. Combined metabolomic and proteomic analysis of human atrial fibrillation. J Am Coll Cardiol, 2008, 51: 585-594.

[12] Kaski JC, Arrebola-Moreno AL. Inflammation and thrombosis in atrial fibrillation. Rev Esp Cardiol, 2011, 65: 551-553.

[13] Marcus GM, Whooley MA, Glidden DV, et al. Interleukin-6 and atrial fibrillation in patients with coronary artery disease: data from the Heart and Soul Study. Am Heart J, 2008, 155: 303-309.

[14] Guo Y, Lip GY, Apostolakis S. Inflammation in atrial fibrillation. J Am Coll Cardiol, 2012, 60: 2263-2270.

[15] Avikes RJ, Martin DO, Apperson-Hansen C, et al. Inflammation as a risk factor for atrial fibrillation. Circulation, 2003, 108: 3006-3010.

2017-03-21）

（編輯：許菁）

Establishment and Analysis for Differential Gene Expression Profile of Left Atrium in Permanent Atrial Fibrillation Patients

GAO Jie, ZHOU Jian, SU Pi-xiong, LIU Yan, GU Song, ZHANG Xi-tao, AN Xiang-guang.

Department of Cardiac Surgery, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing (100020), China

AN Xiang-guang, Email: anxiangguang@sina.com

Objective: To explore the relevant gene, signaling pathway for permanent atrial fi brillation (pAF) occurrence in order to provide the molecular basis of the pathogenesis of pAF.

Methods: Our research included in 2 groups: pAF group, n=7 patients and Control group, n=4 healthy subjects with sinus rhythm. Agilent 4x44K microarray was used to analyze the mRNA in left atrium for differential gene expression prof i le.Based on Gene Ontology, KEGG and Biocarta databases, differentially expressed genes were studied for their relevant function and signaling pathway. Furthermore, the genes with signif i cant differences were verif i ed by quantitative real time PCR (qRT-PCR) in pathological specimen from 5 pAF patients and 5 normal heart donors.

Results: The expression prof i le identif i ed 987 abnormally expressed genes, 567 of them were down-regulated and 420 were up-regulated. 9 genes with signif i cant differences were verif i ed by qRT-PCR in pathological specimen and the changes were similar to microarray; those genes were closely related to pAF by involving left atrium fi brosis, electrical remodeling,inflammation, cellular stress response, metabolism and transcription regulation. GO and Pathway analysis indicated that down-regulated genes were mainly involved in metabolic processes; up-regulated genes had the effects on cellular stress response, immune response and platelet activation.

Conclusion: Microarray technology identif i ed some important genes related to pAF occurrence; such genes involved in left atrial structural and functional remodeling via affecting cellular metabolism, inflammation, immune response and thrombogenesis in relevant patients.

Atrial fi brillation; Gene expression prof i le

北京市教委科技面上項目（SQKM201410025018）

100020 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 心外科

高杰 副主任醫(yī)師 博士 主要從事心律失常學(xué)研究 Email：gaojie19750824@163.com 通訊作者：安向光 Email：anxiangguang@sina.com

R54

A

1000-3614（2017）11-1085-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.010

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1085.)