李 環(huán)
(廣東汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 廣東 汕頭 515041)
·論著·
用優(yōu)化高效液相色譜法測定大棗中蘆丁含量的效果研究
李 環(huán)
(廣東汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 廣東 汕頭 515041)
目的:研究用優(yōu)化高效液相色譜法測定大棗中蘆丁含量的效果。方法:使用優(yōu)化高效液相色譜法測定大棗中蘆丁的含量,測定時的標(biāo)準(zhǔn)為:MACHEREY-NAGEL(MN) NUCLEODUR 100-5 C18柱(BATCH2064),測定時的流動相為:乙腈-0.05%磷酸(0.15:0.85),流速為:1.0ml/min,波長為:257nm,柱溫為:40℃。結(jié)果:經(jīng)檢測,蘆丁的線性范圍為0.05055~0.4044μg,其相關(guān)系數(shù)為r=0.9987,其加樣回收率為97.06%。上述結(jié)果均符合相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn),RSD=1.3%(n=6)。結(jié)論:用優(yōu)化高效液相色譜法測定大棗中蘆丁含量的效果確切,而且能夠避開大棗中糖類成分對測量結(jié)果的干擾。
大棗;蘆丁含量;高效液相色譜法;測定
大棗既是一種常見的食品,又是中醫(yī)常用的藥物?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),大棗中最有藥用價值的成分為蘆丁[1,2]。不過,由于大棗中含有大量的可影響蘆丁測定結(jié)果的糖類成分,因此如何準(zhǔn)確地測定大棗中蘆丁的含量一直是藥理學(xué)中的一個難題。在本次研究中,筆者使用優(yōu)化高效液相色譜法測定大棗中蘆丁的含量,取得了令人滿意的效果。現(xiàn)將本次實(shí)驗(yàn)的過程和結(jié)果報告如下:
1.1 實(shí)驗(yàn)用的儀器 本次實(shí)驗(yàn)使用的儀器包括:島津牌LC-10AT型高液相色譜儀、烘箱(WTB-BINDER ZYD04030)、粉碎機(jī)(RT-04)。
1.2 實(shí)驗(yàn)用的試劑和對照品 本次實(shí)驗(yàn)使用的試劑和對照品包括:乙醇、正丁醇、磷酸、丙酮(以上試劑均為A.R級,由廣州化學(xué)試劑廠提供)、蒸餾水、乙腈、甲醇(流動相為色譜醇)、大孔吸附樹脂(D-101凈品型,由廣州市廣聯(lián)津化工有限公司提供)、聚酰胺薄膜(10×20cm,由浙江省臺州市路橋四青生化材料廠提供)、蘆?。ㄊ|香苷)對照品(由中國藥品生物制品檢定所提供,批號為:0080-9705號)
1.3 試驗(yàn)用的藥材 本次實(shí)驗(yàn)使用的藥材為大棗(由廣州奇星制藥有限公司提供),其干燥和粉碎的方法為:將大棗切成薄片。將大棗片放入烘箱中進(jìn)行烘烤,烘烤時的溫度為70℃。待大棗片完全烘干后,將其在干燥的環(huán)境中放置8個小時,然后用粉碎機(jī)對其進(jìn)行粉碎處理。
2.1 提取溶劑
2.1.1 進(jìn)行水煮提取 精密稱取大棗樣品2g,將其放入250ml的燒杯中,并向燒杯中加入100ml的蒸餾水,然后用大火對燒杯進(jìn)行加熱,直至燒杯中的溶液沸騰后轉(zhuǎn)為小火煮1.5個小時。
2.1.2 進(jìn)行超聲提取 精密稱取大棗樣品2g,將其放入有塞的錐形瓶中,然后向錐形瓶中分別加入100ml濃度為50%的甲醇、100ml濃度為80%的甲醇和100ml濃度為90%的甲醇,并放置1個小時,最后對浸泡好的大棗樣品進(jìn)行30分鐘的超聲提取。
2.1.3 進(jìn)行索氏回流提取 精密稱取大棗樣品2g,將其放入濾紙筒中,用100ml濃度為50%的甲醇對其進(jìn)行3個小時的索氏回流提取,直至大棗樣品的顏色完全消失。
2.1.4 提取的結(jié)果 見圖1和表1。
表1 提取的比較(mg/g)
圖1 不同提取方法及提取溶劑樣品的HPLC色譜圖(該圖由下至上依次為蘆丁對照品、水煮提取的結(jié)果、超聲提取的結(jié)果和索氏回流提取的結(jié)果)
2.2 進(jìn)行正丁醇抽提 對大棗樣品溶液進(jìn)行過濾,提取其中的殘渣。先用提取溶媒洗滌過濾后的大棗樣品殘渣,然后用50ml的蒸餾水對大棗的殘渣進(jìn)行分次洗滌,將洗滌獲得的溶液放入分液漏斗中,再用水飽和正丁醇對該溶液進(jìn)行抽提,每次抽提40ml。留取抽提第四次和抽提第五次的溶液,將其分別蒸干并進(jìn)行薄層檢查(進(jìn)行薄層檢查的條件可參考2000年版的《中國藥典》)。進(jìn)行薄層檢查的結(jié)果顯示,用水飽和正丁醇對大棗樣品殘渣溶液進(jìn)行抽提4次后,基本能夠提取出大棗中的蘆丁成分。
2.3 進(jìn)行上柱試驗(yàn)(D101)
2.3.1 進(jìn)行洗脫液極性的比較 將大棗樣品上柱后,分別用60ml的蒸餾水、60ml濃度為30%的乙醇、60ml濃度為50%的乙醇和60ml濃度為80%的乙醇對其進(jìn)行洗脫處理,并收集每種洗脫液。對每種洗脫液都進(jìn)行蒸干處理,然后用1ml的甲醇對每種洗脫液的殘渣進(jìn)行溶解,并對溶解液進(jìn)行聚酰胺薄層檢查。檢查的結(jié)果為:用濃度為50%的乙醇進(jìn)行洗脫處理時大棗中蘆丁的斑點(diǎn)最清晰(為兩個斑點(diǎn)),用濃度為30%的乙醇和濃度為80%的乙醇進(jìn)行洗脫處理時大棗中蘆丁的斑點(diǎn)隱約可見。因此,可將濃度為50%的乙醇作為洗脫大棗樣品的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.3.2 進(jìn)行洗脫液體積的比較 將大棗樣品上柱,分別用60ml的蒸餾水、60ml濃度為50%的乙醇、50ml濃度為50%的乙醇和40ml濃度為50%的乙醇對其進(jìn)行洗脫處理,并收集每種洗脫液。對每種洗脫液都進(jìn)行蒸干處理,然后用1ml的甲醇對每種洗脫液的殘渣進(jìn)行溶解,并對溶解液進(jìn)行聚酰胺薄層檢查。檢查的結(jié)果為:用60ml濃度為50%的乙醇進(jìn)行洗脫處理時大棗中蘆丁的斑點(diǎn)最清晰。
2.4 進(jìn)行流動相和柱溫的比較 本次實(shí)驗(yàn)先使用甲醇-0.5%磷酸(0.32:0.48)作為流動相,將柱溫調(diào)節(jié)至38℃后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果未能獲得大棗樣品的色譜峰。然后,本次實(shí)驗(yàn)使用乙腈-0.05%磷酸(0.15:0.85)作為流動相,將柱溫調(diào)節(jié)至40℃后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果獲得了大棗樣品的色譜峰。
2.5 進(jìn)行線性關(guān)系考察 精密稱取適量的蘆丁對照品,用甲醇將其配制成濃度為0.2022mg/ml的對照品溶液。精密稱取蘆丁對照品溶液2ml,將其放入20ml的量瓶中,用甲醇對其進(jìn)行定溶,然后對其色譜峰面積(A)和濃度(c)進(jìn)行線性關(guān)系考察。進(jìn)行線性關(guān)系考察的回歸方程為:C=-3.543621×10-3+6.7052×10-7A,r=0 .9987。結(jié)果顯示,蘆丁對照品的線性范圍為:0.05055-0.4044μg。
2.6 進(jìn)行精密度試驗(yàn) 取蘆丁對照品溶液(20.22ug/ml)10μl,對其連續(xù)進(jìn)行8次的進(jìn)樣處理,然后計算8次進(jìn)樣時蘆丁對照品溶液峰面積的平均值,結(jié)果為:319916。RSD=1.3%(n=8)。
2.7 進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn) 稱取大棗樣品12g,將其平均分成6份,對每份大棗樣品進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn),具體的結(jié)果見表2。
表2 進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)的結(jié)果
2.8 進(jìn)行回收率試驗(yàn) 稱取大棗樣品6g,將其平均分成6份,將每份樣品加入到5ml濃度為(15.96μg/ml)的蘆丁對照液中,然后對其進(jìn)行回收率試驗(yàn)。具體的結(jié)果見表3。
表3 進(jìn)行回收率試驗(yàn)的結(jié)果
本次研究的結(jié)果說明,用優(yōu)化高效液相色譜法測定大棗中蘆丁含量的效果確切,而且能夠避開大棗中糖類成分對測量結(jié)果的干擾。不過,為了進(jìn)一步提高用優(yōu)化高效液相色譜法測定大棗中蘆丁含量的效果,筆者認(rèn)為,在使用此方法測定大棗中蘆丁含量時應(yīng)注意以下幾點(diǎn):①不要將沒經(jīng)過用水飽和正丁醇抽提的大棗樣品直接上柱,否則會影響大棗樣品色譜峰的峰形。②在進(jìn)行索氏回流提取的過程中,應(yīng)在濾紙筒中鋪墊少許的棉花,以免導(dǎo)致大棗樣品粉末隨甲醇回流入燒杯中。③在用不同濃度的乙醇對大棗樣品進(jìn)行洗脫處理時,應(yīng)盡量放慢洗脫的速度,以免因乙醇中產(chǎn)生氣泡而導(dǎo)致大孔樹脂發(fā)生斷層,從而影響洗脫的效果。
[1]樊君,呂磊,尚紅偉.大棗的研究與開發(fā)進(jìn)展[J].食品科學(xué),2003,24(4):161-163.
[2]王朝周,程秀民.薄層掃描法測定槐米中蘆丁含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2004,10(4):21-22.
R282.5
B
2095-7629-(2017)3-0001-02