孟劍鋒

（河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054031）

銀杏內(nèi)酯B對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的研究

孟劍鋒

（河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054031）

目的觀察銀杏內(nèi)酯B對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用并初步探討其可能的作用機(jī)制。方法采用夾閉左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備大鼠心肌缺血再灌注模型；設(shè)假手術(shù)組、模型組和銀杏內(nèi)酯B（15、30、60 mg/kg）組，每組20只。監(jiān)測(cè)各組大鼠心電圖波動(dòng)變化；通過高頻率超聲影像系統(tǒng)檢測(cè)舒張末期左室內(nèi)徑（LVIDd）和收縮末期左室內(nèi)徑（LVIDs）、短軸縮短率（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、每搏輸出量（SV）；TTC 染色法檢測(cè)心肌梗死面積，生化分析法測(cè)定血清中心肌酶含量；HE染色法觀察心肌組織病理變化；末端標(biāo)記法（TUNEL）觀察細(xì)胞凋亡狀況。結(jié)果與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B（15、30、60 mg/kg）組心電圖明顯改善，以銀杏內(nèi)酯 B 60 mg/kg 組最為顯著；銀杏內(nèi)酯 B（30、60 mg/kg）組 LVIDd、LVIDs顯著減?。≒<0.05），F(xiàn)S 顯著提高（P<0.01），EF、SV 顯著升高（P<0.01）；心肌組織梗死面積顯著降低（P<0.05 或P<0.01），血清心肌酶（AST、CPK、LDH）含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）；心肌組織病變明顯改善，心肌組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少、凋亡指數(shù)（AI）顯著降低（P<0.01）。結(jié)論銀杏內(nèi)酯B對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

銀杏內(nèi)酯B 心肌缺血再灌注 心電圖 超聲 凋亡

銀杏葉為我國傳統(tǒng)中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘，苦，澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，萜內(nèi)酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、M和白果內(nèi)酯。研究表明銀杏內(nèi)酯為血小板活化因子（PAF）拮抗劑，活性最強(qiáng)的為銀杏內(nèi)酯 B（GB），既往研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B具有抗凋亡、抗氧化等多種藥理學(xué)作用［1-4］。本實(shí)驗(yàn)通過建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，通過監(jiān)測(cè)心電圖波動(dòng)、血液流變學(xué)、梗死面積、心肌酶含量、組織病變以及細(xì)胞凋亡等指標(biāo)變化，探討銀杏內(nèi)酯B對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用大鼠品系SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，鼠齡8周齡，體質(zhì)量220～260 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 藥物與試劑 銀杏內(nèi)酯B購自美國Sigma公司；TTC購自美國Sigma公司；TUNEL試劑盒購自南京建成生物工程研究所；AST、CPK、LDH試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 分組與造模 將100只實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，銀杏內(nèi)酯 B（15、30、60 mg/kg）組，每組20只。參照徐叔云等［5］報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法，通過夾閉左冠狀動(dòng)脈前降支30 min的方法建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，實(shí)驗(yàn)過程實(shí)施心電圖監(jiān)測(cè)，心電圖示ST段抬高或T波高聳為心肌缺血，夾閉30 min后恢復(fù)血流灌注，抬高的ST段降低或高聳的T波得以恢復(fù)表示心肌再灌注成功。假手術(shù)組行手術(shù)通路但不夾閉冠狀動(dòng)脈。

1.4 給藥方法 銀杏內(nèi)酯 B（15、30、60 mg/kg）組腹腔注射給藥治療，每日1次，療程7 d。假手術(shù)組，模型組同步腹腔注射生理鹽水，每日1次。各組均造模后即刻給藥。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）超聲檢測(cè)。各組隨機(jī)取10只大鼠，采用Vevo770高分辨率超聲影像系統(tǒng)于取材前行超聲檢測(cè)。于左側(cè)胸骨旁取左室乳頭肌水平短軸切面，測(cè)量舒張末期左室內(nèi)徑（LVIDd）、收縮末期左室內(nèi)徑（LVIDs）、短軸縮短率（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、每搏輸出量（SV），所有檢測(cè)指標(biāo)均取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。2）TCC染色法測(cè)定心肌組織梗死面積。取心臟組織置-20℃凍存20 min后切片，2%TTC溶液（恒溫37℃、避光）孵育15 min，灰白色為梗死區(qū)，采用醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)分析心肌組織梗死面積。3）血清中心肌酶含量的測(cè)定。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并離心（1500 r/min，10 min）取血清，通過生化分析儀測(cè)定血清中心肌酶（AST、CPK、LDH）含量。4）心肌組織病變及心肌細(xì)胞凋亡的觀察。取心臟組織并置于4%多聚甲醛溶液中72 h進(jìn)行固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，HE染色并通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病變，TUNEL染色后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況。凋亡指數(shù)（AI）計(jì)算：每張TUNEL染色切片選取不重疊的6個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，各組取平均值后計(jì)算 AI：AI（%）=（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間均數(shù)兩兩比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心電圖監(jiān)測(cè)結(jié)果比較 與假手術(shù)組大鼠比較，模型組及銀杏內(nèi)酯B各劑量組大鼠結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后出現(xiàn)左心室前壁呈灰白，而后逐漸呈現(xiàn)紫紺的癥狀，心電圖示ST段抬高或T波高聳，提示急性心肌梗死大鼠模型造模成功。經(jīng)銀杏內(nèi)酯B干預(yù)治療7 d后，缺血再灌注損傷大鼠心電圖波形明顯改善，其中銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組心電圖波形基本恢復(fù)正常。見圖1。

圖1 各組大鼠心電圖

2.2 各組大鼠超聲檢測(cè)結(jié)果比較 見表1。與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs顯著升高（P<0.05 或P<0.01），F(xiàn)S、EF、SV 顯著降低（P<0.01）；而與模型組比較，銀杏內(nèi)酯 B 30、60 mg/kg組 LVIDd、LVIDs顯著減小 （P<0.05），F(xiàn)S 顯著提高 （P<0.01），EF、SV 顯著升高（P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠超聲檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠超聲檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10銀杏內(nèi)酯B 15 mg/kg組 10 EF（%） SV（μL）72.81±7.34 190.25±24.80 29.37±4.50** 78.14±17.65**33.74±4.83 86.40±19.27銀杏內(nèi)酯 B 30 mg/kg組 10 6.87±0.22△ 5.47±0.35△ 26.08±5.42△△ 36.29±5.16△ 107.53±18.24△銀杏內(nèi)酯 B 60 mg/kg組 10 6.74±0.26△ 5.03±0.31△△ 28.62±5.83△△ 46.03±7.24△△ 119.02±21.51△△LVIDd（mm） LVIDs（mm） FS（%）6.68±0.25 3.90±0.28 42.95±7.16 7.23±0.27* 6.18±0.39** 15.34±3.28**7.01±0.30 5.92±0.43 18.71±4.15

2.3 各組心肌組織梗死面積測(cè)定結(jié)果比較 見表2。模型組心肌組織梗死面積較假手術(shù)組顯著升高（P<0.01）；銀杏內(nèi)酯B 30、60 mg/kg組梗死面積與模型組比較，顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表2 各組大鼠血清心肌酶含量及心梗面積比較（±s）

表2 各組大鼠血清心肌酶含量及心梗面積比較（±s）

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2.4 各組心肌酶含量比較 見表2。模型組血清心肌酶（AST、CPK、LDH）含量較模型組均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 30、60 mg/kg組血清AST、CPK、LDH含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

2.5 各組心肌組織病變觀察結(jié)果比較 見圖2。經(jīng)HE染色后觀察病理切片，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)均未見明顯異常；模型組心肌組織呈現(xiàn)肌原纖維斷裂、排列紊亂，心肌細(xì)胞呈空泡變性，細(xì)胞質(zhì)著色不均，胞核深染等病理性改變；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 15、30、60 mg/kg組心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織病變呈現(xiàn)不同程度改善，以銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組效果最為顯著。

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)（HE染色，200倍）

2.6 心肌細(xì)胞凋亡狀況觀察結(jié)果 經(jīng)TUNEL染色后觀察，模型組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 15、30、60 mg/kg組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，以銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組最為顯著，見圖 3。 模型組心肌細(xì)胞 AI［（57.42±9.76）%］較假手術(shù)組 AI（0）顯著升高（P<0.01）；銀杏內(nèi)酯 B 15、30、60 mg/kg 組 AI分別為 （46.08±7.93）%、（39.32±7.58）%、（26.72±5.89）%；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯 B 30、60 mg/kg組AI顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 討 論

隨著高血壓、高血脂等基礎(chǔ)疾病發(fā)病率的提高，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–HD）以及由其所引發(fā)的急性心肌梗死（AMI）發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害著人類的生命健康［6-7］。及時(shí)通過藥物或介入手術(shù)溶栓以實(shí)現(xiàn)血流恢復(fù)灌注是目前臨床上治療AMI的主要方案，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥嚴(yán)重影響著AMI預(yù)后。缺血再灌注損傷病理機(jī)制非常復(fù)雜，既往研究發(fā)現(xiàn)心功能異常、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)以及繼發(fā)性心肌細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制［8-12］，這也為我們研發(fā)能夠有效降低缺血再灌注損傷的新型藥物提供了思路。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況（TUNEL，400倍）

心電圖ST段抬高或T波高聳是急性心梗死的典型表現(xiàn)，本研究采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備急性心肌梗死大鼠模型，造模過程全程實(shí)施心電圖監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后出現(xiàn)左心室前壁呈灰白、紫紺的癥狀，心電圖示ST段抬高或T波高聳，提示造模成功。該造模方法操作簡(jiǎn)單、成功率高且與臨床AMI癥狀接近，是目前AMI動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究常用的造模方法［13］。銀杏內(nèi)酯B是我國傳統(tǒng)中藥銀杏葉的主要活性成分之一，具有抗凋亡、抗氧化、抗炎等多種藥理學(xué)作用［1-4，14-15］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)銀杏內(nèi)酯 B 治療能夠有效改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心電圖波形，有效降低 LVIDd 和 LVIDs，提高 FS、EF、SV；顯著降低血清心肌酶（AST、CPK、LDH）含量，改善心肌組織病變，減小心肌組織梗死面積，提示銀杏內(nèi)酯B對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

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R285.5

A

1004-745X（2017）11-1977-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.028

2017-05-06）