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        冠脈結(jié)扎術(shù)制備大鼠慢性心衰模型的實(shí)驗(yàn)改良*

        2017-11-29 06:19:04李文佳王冰梅藺禹帆王星燁
        中國(guó)中醫(yī)急癥 2017年11期
        關(guān)鍵詞:存活率心衰冠脈

        李文佳 王冰梅 藺禹帆 王星燁 郭 迪 王 迪△

        (1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130000;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130117)

        ·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

        冠脈結(jié)扎術(shù)制備大鼠慢性心衰模型的實(shí)驗(yàn)改良*

        李文佳1王冰梅1藺禹帆1王星燁2郭 迪1王 迪1△

        (1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130000;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130117)

        目的改良冠脈結(jié)扎術(shù)制備大鼠慢性心衰模型。方法60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組10只和手術(shù)組50只,大鼠麻醉后,經(jīng)口氣管插管,連接呼吸機(jī),開(kāi)胸,結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支(假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎),關(guān)胸縫合,6周后觀察兩組大鼠的心電圖變化、存活率、心體比、血流動(dòng)力學(xué)及心肌組織結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果手術(shù)組50只大鼠6周后存活39只,存活率為78.00%;術(shù)后手術(shù)組心電圖ST段明顯抬高;6周后手術(shù)組較假手術(shù)組左室收縮壓(LVSP)和最大上升速率(+dp/dtmax)均下降,左室舒張末壓(LVEDP)和最大下降速率(-dp/dtmax)均上升(P<0.05);HE染色及心肌組織電鏡可見(jiàn)手術(shù)組心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。結(jié)論改良冠脈結(jié)扎術(shù)提高了術(shù)后大鼠的存活率,在一定程度上為成功制備慢性心衰模型提供了更大的可能。

        冠脈結(jié)扎 大鼠 慢性心衰 存活率

        慢性心力衰竭(CHF)是一種極其復(fù)雜的臨床綜合征,是各種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的終末階段,是導(dǎo)致心血管疾病死亡的主要原因[1]。歐洲調(diào)查結(jié)果顯示,心衰患者占其總?cè)丝诘?.4%~2.0%,其中大約一半的患者在4年內(nèi)死亡[2]。我國(guó)50家醫(yī)院住院病例調(diào)查顯示,慢性心衰的住院率占同期心血管病的20%,死亡卻占40%[3]。可見(jiàn)慢性心力衰竭已成為嚴(yán)重影響人類健康的一大疾病。研究及開(kāi)發(fā)出治療慢性心衰新型藥物也迫在眉睫。實(shí)驗(yàn)室建立及制備慢性心衰動(dòng)物模型能為臨床藥物研究提供有效的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P?。冠脈結(jié)扎法是制備慢性心衰模型的重要方法。該種方法制備的相關(guān)模型與臨床相關(guān)疾病的病理發(fā)展過(guò)程及發(fā)生機(jī)制有很高的相似性,因而得到廣泛應(yīng)用[4]。但其造模方法難度較高,過(guò)程復(fù)雜,易受多種因素影響從而導(dǎo)致存活率及成模率高低不一[5-6]。本文針對(duì)上述問(wèn)題查閱近10年相關(guān)文獻(xiàn),綜合各方經(jīng)驗(yàn),在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不斷摸索總結(jié),改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法,提高了大鼠冠脈結(jié)扎術(shù)后的存活率,從而為提高相關(guān)模型制備的成功率提供了參考?,F(xiàn)報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào):211002300013347,許可證號(hào):SCXK(遼)2015-0001,適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分為假手術(shù)組10只,手術(shù)組50只。

        1.2 試劑與儀器 10%水合氯醛(水合三氯乙醛1.0 g加0.9%氯化鈉注射液10 mL,無(wú)菌微孔針式過(guò)濾器過(guò)濾,封瓶備用);注射用青霉素鈉160萬(wàn)U/支(哈藥集團(tuán)制藥總廠,產(chǎn)品批號(hào):15110403-2);2.5%戊二醛(吉林大學(xué)電鏡室提供)。HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟軟件有限公司)、PowerLab八通道生理記錄儀(澳大利亞ADInstruments公司)、手術(shù)器械(均高溫滅菌)。

        1.3 動(dòng)物麻醉 手術(shù)前1 h禁食,不禁水。術(shù)前稱體質(zhì)量,左下腹碘伏消毒,10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射[7]。麻醉完全后,將大鼠固定在大小適中的鼠板上,連接心電圖,心電圖正常者繼續(xù)實(shí)驗(yàn),不正常者淘汰。

        1.4 氣管插管 將鼠板垂直放置,大鼠呈頭高腳低位,止血鉗夾住舌尖自然垂下暴露口腔,左手執(zhí)LED壓舌板伸入舌根部下壓,可見(jiàn)一張一合呈呼吸節(jié)律的聲門(mén),待聲門(mén)張開(kāi)時(shí)右手執(zhí)氣管插管插入氣道,插入時(shí)有卡頓感,連接呼吸機(jī)(設(shè)置潮氣量為6 mL/min,呼吸時(shí)比為 1∶1[8],呼吸頻率為 70 次/min,通入氣體為空氣),可見(jiàn)胸廓上下起伏即可確定進(jìn)入氣管。插管成功后用膠布固定以防術(shù)中脫出。

        1.5 冠脈結(jié)扎 大鼠取仰臥位,備皮區(qū)域縱向?yàn)樽笮?~5肋,橫向?yàn)樾毓侵烈盖熬€之間,局部碘伏消毒,鋪一次性無(wú)菌洞巾??v行切開(kāi)皮層,逐層鈍性分離胸大肌和前鋸肌,顯露肋骨,在心臟搏動(dòng)最明顯的肋間隙(3~4肋間)用彎鉗輕輕扎破肋間肌及胸膜,張開(kāi)彎鉗將心臟拉鉤插入,暴露視野可見(jiàn)心臟及隨呼吸機(jī)頻率收縮及舒張的左側(cè)肺葉。為避免擠出心臟時(shí)損傷肺葉,故在心臟與左肺之間放一帶線的無(wú)菌棉球 (生理鹽水浸濕,用前將棉球擠至無(wú)水)將肺壓向左側(cè)胸腔。用彎鑷子輕輕滑過(guò)心尖將心包膜挑破,用心臟拉鉤輕輕將心臟擠出,可見(jiàn)左心耳及肺動(dòng)脈圓錐。以6/0縫合線于左心耳根部下方約2 mm處進(jìn)行結(jié)扎[9],進(jìn)針深度約0.5~1 mm,寬約 1~2 mm[10]。 結(jié)扎后將心臟小心送回胸腔,拉出帶線棉球,觀察心電圖變化。假手術(shù)組只在左心耳根部下方進(jìn)針穿線,不結(jié)扎,其他步驟與手術(shù)組相同。

        1.6 關(guān)胸及術(shù)后處理 大鼠心臟節(jié)律規(guī)整后縫合肋骨,注射器吸取胸腔內(nèi)氣體及血液,恢復(fù)胸腔負(fù)壓,逐層縫合肌層及皮層,每層均敷適量青霉素鈉粉,無(wú)菌紗布包扎。撤掉呼吸機(jī),胸外按壓輔助恢復(fù)自主呼吸,待呼吸、心率平穩(wěn)后拔下氣管插管。觀察3~5 min無(wú)異常將大鼠放入單籠中室溫飼養(yǎng)。術(shù)后第2天每只大鼠給予腹腔注射青霉素4萬(wàn)U/d,連續(xù)注射3 d以預(yù)防術(shù)后感染。

        1.7 觀察指標(biāo) 1)結(jié)扎前后心電圖變化:取大鼠冠脈結(jié)扎前及結(jié)扎后5 min的心電圖,心電圖顯示標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高(≥0.1 mV),表明冠脈結(jié)扎成功。2)術(shù)后6周存活率:觀察并統(tǒng)計(jì)手術(shù)組及假手術(shù)組術(shù)后6周大鼠的存活情況,計(jì)算存活率。3)血流動(dòng)力學(xué)改變:術(shù)后正常喂養(yǎng)6周后從手術(shù)組中采取抽簽法隨機(jī)選取9只大鼠,與假手術(shù)組大鼠均禁食不禁水1 h后稱體質(zhì)量麻醉,進(jìn)行右側(cè)頸動(dòng)脈插管術(shù),操作方法參照文獻(xiàn)[11]并稍作改進(jìn),記錄 LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax,統(tǒng)計(jì)并分析大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化。4)心體比:血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)完畢后取心臟稱重,計(jì)算心體比,心臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)=心體比。 5)病理切片鑒定:術(shù)后6周取心臟,結(jié)扎部位下2 mm處進(jìn)行橫切,結(jié)扎端甲醛固定,石蠟包埋切片,病理切片厚度均為4 μm,HE染色后光鏡下觀察。6)心肌微觀結(jié)構(gòu)觀察:取心尖組織用2.5%戊二醛固定,切片,電鏡下觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以(±s)表示,兩組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 手術(shù)前后心電圖變化 見(jiàn)圖1,圖2。術(shù)中觀察心電圖變化,可見(jiàn)冠脈結(jié)扎后心電圖ST段明顯抬高(如箭頭所示)。假手術(shù)組心電圖無(wú)明顯變化??勺C明手術(shù)組結(jié)扎成功。

        圖1 手術(shù)組大鼠術(shù)前術(shù)后Ⅱ?qū)?lián)變化

        2.2 兩組術(shù)后6周存活率比較 本實(shí)驗(yàn)手術(shù)組選用雌性SD大鼠50只,術(shù)中心室顫動(dòng)死亡4只,呼吸衰竭死亡2只,術(shù)后2 h因呼吸道阻塞死亡1只,術(shù)后1 d因心衰死亡1只,呼吸道阻塞死亡1只,術(shù)后15、16 d因慢性心衰分別死亡1只,術(shù)后6周總存活率為78.00%。假手術(shù)組術(shù)中因心律失常死亡1只,術(shù)后6周存活率為90.00%。

        2.3 兩組心體比及血流動(dòng)力學(xué)改變比較 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組相比,手術(shù)組心體比明顯增高,LVSP與+dp/dtmax明顯降低,LVEDP與-dp/dtmax明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從心體比及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)可見(jiàn)手術(shù)組造模成功。

        表1 兩組心體比及血流動(dòng)力學(xué)改變比較(±s)

        表1 兩組心體比及血流動(dòng)力學(xué)改變比較(±s)

        與假手術(shù)組比較,△P<0.05。

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        2.4 兩組心肌細(xì)胞石蠟切片HE染色結(jié)果 見(jiàn)圖2。假手術(shù)組石蠟切片HE染色可見(jiàn)肌絲排列整齊,有分叉,肌纖維無(wú)斷裂扭曲,細(xì)胞著色均勻,細(xì)胞核位于細(xì)胞的中央,核大小及形態(tài)正常。手術(shù)組切片可見(jiàn)肌絲排列紊亂交織成網(wǎng)狀,部分肌纖維扭曲斷裂,細(xì)胞著色不均勻,部分細(xì)胞核固縮,核周?chē)梢?jiàn)空白區(qū)。

        圖2 兩組心肌細(xì)胞比較(HE染色,40倍)

        2.5 兩組心肌細(xì)胞電鏡結(jié)果 見(jiàn)圖3。假手術(shù)組可見(jiàn)肌絲排列緊密整齊,肌節(jié)明顯,明暗帶清晰,肌絲間可見(jiàn)單排線粒體排列整齊,形態(tài)規(guī)則,無(wú)腫脹。手術(shù)組可見(jiàn)肌絲排列疏松紊亂,部分肌絲斷裂,肌絲間線粒體數(shù)目明顯增多,排列紊亂,線粒體形態(tài)不規(guī)則,部分線粒體固縮變小。

        圖3心肌組織電鏡(1000倍)

        3 討 論

        通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),綜合優(yōu)化實(shí)驗(yàn)大鼠選擇、術(shù)中通氣管理、術(shù)中處理、脫機(jī)管理等可提高冠脈結(jié)扎大鼠存活率。

        3.1 實(shí)驗(yàn)大鼠選擇 在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)天數(shù)與造模存活率有一定的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均采用SPF級(jí)雌性SD大鼠,體質(zhì)量(200±10)g。手術(shù)起初新進(jìn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,術(shù)中發(fā)生室性心動(dòng)過(guò)速,心臟驟停,心室顫動(dòng)者居多,死亡率較高。術(shù)后也易發(fā)生呼吸衰竭、心功能衰竭導(dǎo)致死亡。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,術(shù)中大鼠耐受性較前增強(qiáng),惡性心律失常風(fēng)險(xiǎn)下降,術(shù)后猝死率降低,但術(shù)中及術(shù)后存活率仍不理想。為觀察大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)時(shí)間與手術(shù)存活率的關(guān)系,將大鼠分別適應(yīng)性喂養(yǎng)10、14 d后行冠脈結(jié)扎術(shù),發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d后大鼠術(shù)中及術(shù)后存活率均提高,術(shù)中心律失常風(fēng)險(xiǎn)亦明顯下降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性喂養(yǎng)2周,體質(zhì)量(250±10)g時(shí)進(jìn)行冠脈結(jié)扎術(shù)存活率最高(見(jiàn)表2)。有鑒于此,本實(shí)驗(yàn)均采用適應(yīng)性喂養(yǎng)2周的大鼠進(jìn)行結(jié)扎。

        表2 適應(yīng)性喂養(yǎng)天數(shù)及死亡關(guān)系

        3.2 術(shù)中通氣管理 以往研究表明,術(shù)中呼吸管理大致采用3種方法,不插管、有創(chuàng)插管、經(jīng)口腔無(wú)創(chuàng)插管。李貽奎等采用術(shù)中不插管,從開(kāi)胸、結(jié)扎到縫合要求在10 s左右完成,對(duì)術(shù)者手法要求較高,且存活率不能保證[12]。有創(chuàng)插管分氣管切開(kāi)和注射針頭直接刺入氣管[13]兩種,氣管切開(kāi)法插管雖然直觀、準(zhǔn)確,但容易因出現(xiàn)氣道出血和分泌物過(guò)多而導(dǎo)致窒息,術(shù)后氣管切口縫合不當(dāng)還容易造成氣管狹窄或氣管瘺,術(shù)后肺部感染的可能性增大[14];注射針頭直接插入氣管雖可降低因氣管切開(kāi)所致的分泌物增多阻塞呼吸道的風(fēng)險(xiǎn),但兩者同樣頸部切開(kāi)增加了大鼠感染的幾率,延長(zhǎng)了術(shù)后大鼠恢復(fù)的時(shí)間。

        經(jīng)口腔無(wú)創(chuàng)插管,對(duì)大鼠氣道創(chuàng)傷小,術(shù)中通氣穩(wěn)定,術(shù)后易恢復(fù),但口腔內(nèi)光線暗,不易觀察到氣管,影響插管成功率,王學(xué)文等[15]采用頸部強(qiáng)光照射經(jīng)口腔插管,但發(fā)現(xiàn)口腔視野仍較差,不直觀,不能準(zhǔn)確判斷氣管位置。本實(shí)驗(yàn)采用LED壓舌板,可直觀清晰的看到氣管位置,聲門(mén)開(kāi)合,在聲門(mén)打開(kāi)時(shí)將氣管插管插入氣道,大大提高了氣管插管的成功率。

        3.3 術(shù)中處理 文獻(xiàn)中實(shí)驗(yàn)開(kāi)胸后為預(yù)防傷及肺葉多采用普通棉球或紗布放置于心臟與左肺之間,將心臟放回胸腔后容易將棉球及紗布遺留在胸腔內(nèi);在用鑷子或止血鉗將棉球拿出時(shí)亦容易損傷心臟、血管及肺葉,故本實(shí)驗(yàn)采用帶線棉球,可在結(jié)扎結(jié)束后直接將棉球拉出,避免了上述問(wèn)題,方便省時(shí)且安全,亦可提高手術(shù)的成功率。

        3.4 脫機(jī)管理 因開(kāi)胸縫合后胸內(nèi)負(fù)壓不能完全恢復(fù),脫機(jī)后難以自行恢復(fù)自主呼吸,本實(shí)驗(yàn)采用試探性脫機(jī)后胸外按壓刺激大鼠恢復(fù)自主呼吸,多數(shù)大鼠可恢復(fù)自主呼吸[16]。若脫機(jī)后動(dòng)物出現(xiàn)呼吸表淺緩慢及呼吸驟停,則立即重新連接呼吸機(jī)輔助呼吸,并配合胸外按壓,必要時(shí)反復(fù)脫機(jī)以促使恢復(fù)自主呼吸,實(shí)驗(yàn)證實(shí)操作可行。

        綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以上方法的改進(jìn)有效地提高了冠脈結(jié)扎術(shù)后大鼠的存活率,且飼養(yǎng)6周后各項(xiàng)觀察指標(biāo)均達(dá)到慢性心衰診斷標(biāo)準(zhǔn),為提高慢性心衰模型制備的成功率提供了參考。

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        [16]陳學(xué)娟,范金茹,廖建萍,等.冠脈結(jié)扎法大鼠心肌梗死模型的改進(jìn)[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2014,10(23):1806-1807.

        Experimental Improvement of Chronic Heart Failure Model Induced by Coronary Artery Ligation in Rats

        LI Wenjia,WANG Bingmei,LIN Yufan,et al. Changchun University of Chinese Medicine,Jilin,Changchun 130117,China.

        Objective:To establish a rat model of chronic heart failure by modified coronary artery ligation.Methods:60 SD rats were randomly divided into sham operation group(n=10) and the operation group(n=50).After anesthesia,the rats were intubated by mouth,connected to the ventilator,opened the chest and ligated the anterior descending branch of the left coronary artery (the sham group's line was not ligated),land ayer by layer closed chest.After 6 weeks,the changes of ECG,survival rate,ratio of heart to body,hemodynamics and myocardial tissue structure were observed in the operation group and sham operation group.Results:After 6 weeks,only 39 survived in 50 SD rats in the operation group;the survival rate was 78.00%.ECG of the operation group showed ST-segment elevation.After 6 weeks,compared with the sham group,both left ventricular systolic pressure(LVSP) and the maximum rise rate(+dp/dtmax) decreased in the operation group;both left ventricular end diastolic pressure(LVEDP) and the maximum decline rate(-dp/dtmax) increased(P<0.05).HE staining and myocardial tissue electron microscopy showed significant changes in myocardial tissue structure of the operation group.Conclusion:The improved coronary artery ligation improves the survival rate of rats after operation,and provides a greater possibility for the successful preparation of chronic heart failure models.

        Coronary ligation;Rat;Chronic heart failure;Survival rate

        R541.4

        A

        1004-745X(2017)11-1973-04

        10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.027

        吉林省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目(20140414054GH)

        △通信作者(電子郵箱:wangdi0606@126.com)

        2017-06-28)

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