田學(xué)智，龍昌洲，王子宇，張亞寧，張甫生*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 ，400715) 2(西南大學(xué) 國家級食品科學(xué)與工程實驗教學(xué)示范中心，重慶， 400715)

高靜壓處理對魔芋葡甘聚糖/大豆分離蛋白復(fù)合溶膠特性的影響

田學(xué)智1,2，龍昌洲1,2，王子宇1,2，張亞寧1，張甫生1*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 ，400715) 2(西南大學(xué) 國家級食品科學(xué)與工程實驗教學(xué)示范中心，重慶， 400715)

為考察高靜壓對多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合體系功能特性的影響，以魔芋葡甘聚糖和大豆分離蛋白為原料，研究不同壓力、不同時間下高靜壓處理對兩者復(fù)合溶膠的乳化活性、乳化穩(wěn)定性、黏度特性以及微觀結(jié)構(gòu)的影響。研究結(jié)果表明，在400 MPa壓力下經(jīng)不同的處理時間，復(fù)合溶膠的功能性質(zhì)均有顯著性提高，其中乳化活性、乳化穩(wěn)定性在處理10～15 min時達(dá)到最佳，與空白組相比分別提高了5.6%～6.2%和2.5%～2.7%，而黏度則在400 MPa/15 min時達(dá)最高值，比空白組提高了145.3%。同時掃描電鏡分析得出，適當(dāng)高靜壓處理可使多糖和蛋白質(zhì)復(fù)合溶膠體系形成更加均勻致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，二者間相互作用增強(qiáng)。

高靜壓(HHP)；魔芋葡甘聚糖(KGM)；大豆分離蛋白(SPI)；乳化特性；黏度特性；微觀結(jié)構(gòu)

魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM) 為天然高分子多糖，為魔芋塊根中提取的可溶性纖維[1]，具有減肥、排毒、防癌、助消化、降血糖、降血壓等多種功效[2]；魔芋葡甘聚糖也具有很強(qiáng)的結(jié)合水能力，是食品加工中常用的增稠劑、穩(wěn)定劑、膳食纖維補(bǔ)充劑等[3]。大豆分離蛋白(soybean protein isolated ，SPI)是以大豆粕為原料生產(chǎn)的一種全價蛋白類食品添加劑，蛋白質(zhì)含量90%以上，氨基酸有近20種，是為數(shù)不多的可替代動物蛋白的植物蛋白[4-5]。但其乳化性、膠凝性及溶解性等性質(zhì)與動物蛋白相比有較大差距[6]，限制了其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。研究表明，將魔芋葡甘聚糖與大豆蛋白經(jīng)合適的物理共混，能得到較好乳化特性的復(fù)合食品飲料體系[7-8]。

高靜壓技術(shù)(high hydrostatic pressure, HHP)是近年來興起的一種非熱加工技術(shù)[9-10]，利用高靜壓技術(shù)研究對食品中生物高分子的結(jié)構(gòu)和特性的影響，已經(jīng)成為當(dāng)今高靜壓食品處理技術(shù)研究的前沿[11]。高靜壓處理生物大分子可使其獲得較好凝膠性、流變性等品質(zhì)，如SOLEIMAN等利用 950 MPa、 20 ℃處理 k-卡拉膠 20 min 后發(fā)現(xiàn)壓力誘導(dǎo)多糖凝膠的黏度下降、亮度增加[12]； MU 等研究在800 MPa，加壓 5 min，pH=8.0條件下，可使140 g/L的 β-乳球蛋白生成乳白色凝膠[13]。但這些研究多集中于對單一生物高分子影響的研究，然而食品體系往往是多種生物大分子相互作用的混合體系，對混合體系研究更具有實際意義。多糖和蛋白質(zhì)作為食品體系其中最主要的高分子，兩者復(fù)合體系的相互作用在很大程度上決定了食品的品質(zhì)。但有關(guān)高靜壓對多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合體系性質(zhì)影響的報道較少，對其復(fù)合溶膠特性以及微觀結(jié)構(gòu)等的研究更不多見。因此，本文以極具代表性和資源豐富的KGM和SPI復(fù)合物為研究對象，旨在探索高靜壓處理對該復(fù)合物功能特性以及微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期為今后有關(guān)KGM-SPI復(fù)合溶膠產(chǎn)品的改良及其他多糖-蛋白復(fù)合體系的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1試驗材料及試劑

大豆分離蛋白(食品級)，鄭州亨多寶化工有限公司；魔芋膠(食品級)，上海北連生物科技有限公司；大豆調(diào)和油(食品級)，南海油脂工業(yè)有限公司；十二烷基硫酸鈉(分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.2儀器設(shè)備

SL602N高精顯電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司； JJ-1精密增力電動攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；STA-II高剪切乳化機(jī)，上海索祥電機(jī)設(shè)備制造有限公司； TC-500B真空封口機(jī)，上海星貝包裝機(jī)械有限公司； HHP-M1高靜壓處理設(shè)備，包頭科發(fā)高壓技術(shù)有限責(zé)任公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHR-1流變儀，美國TA公司； PB-10精密pH計，德國Sartorius公司； S-3000N掃描電子顯微鏡，日本日立精密儀器公司；Avanti J-30I真空冷凍干燥機(jī)，美國貝克曼有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 魔芋葡甘聚糖/大豆分離蛋白復(fù)合物制備及高靜壓處理

KGM-SPI復(fù)合溶膠制備參考謝建華等[14]的方法，將0.9%的KGM-SPI(7∶3)混合后溶于100 mL蒸餾水中，在250 mL燒杯中充分?jǐn)嚢杈鶆?，待KGM溶脹完全后，55 ℃恒溫水浴30 min，攪拌均勻，立即冷卻到室溫，在4 ℃下靜置12 h，待測。

高靜壓處理參考WANG等[6]的方法，將樣品放入2層聚乙烯塑料袋中，進(jìn)行真空熱封，后將樣品放入高靜壓處理設(shè)備中，將加壓腔體密封，設(shè)置相應(yīng)處理參數(shù)加壓，升壓速度為3.4 MPa/s，初始溫度為20 ℃。處理參數(shù)為：(1)在15 min保壓處理時間下，用200、300、400、500、600 MPa壓力處理樣品；(2)在400 MPa下，分別保壓處理5、10、15、20 min。對照為未經(jīng)高靜壓處理的樣品。

1.3.2 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定

參照TANG等[15]采用濁度法來表征共混溶膠的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。按上述方法制備100 mL溶膠，加入40 mL調(diào)和大豆油，用高速乳化機(jī)在6 000 r/min條件下均質(zhì)1 min；分別在0 min與10 min后取樣，并以0.1% SDS稀釋100倍后，在500 nm下測其吸光值，以0.1% SDS溶液為空白。在0 min下測得的吸光值為溶膠的乳化活性(EA)，而乳化穩(wěn)定性(ES)用乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)來表示，計算公式為

ESI=ΔT/(1-K)

(1)

式中:ΔT為時間差，K為靜置10 min測得的吸光值與0 min測得的吸光值的比值[16]。

其中，SDS主要作用是為了防止油滴絮凝在比色皿的側(cè)壁[17]。

1.3.3 黏度特性的測定

黏度特性的測定參考ZHU等人的方法并有所改進(jìn)[18-19]。按1.3.1制備100 mL溶膠，采用DHR-1流變儀在25 ℃測定，測試夾具為40 mm 平板，間距為1 000 μm，頻率1 Hz，剪切速率1～300 s-1。為了保持測量時的熱和機(jī)械平衡，每個樣品測量時間預(yù)設(shè)為靜置5 min，測定前以硅油涂膜樣品周圍以免測量期間出現(xiàn)蒸發(fā)。表觀黏度為溶膠測定表觀黏度的初始值。

1.3.4 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察

參考ZHANG等對溶膠掃描電鏡方法并有所改進(jìn)[20-22]。將溶膠樣品于培養(yǎng)皿中涂膜(厚薄均勻)，后置于冰箱中預(yù)冷凍24 h，再使用真空冷凍干燥樣品24 h。將干燥好的樣品保存待用。掃描電鏡觀察前，將樣品塊用固定膠粘于樣品銅臺，在真空度133.322×10-3Pa，濺射電壓1.1～1.2 kV，鍍膜時間2～3 min條件下鍍金，放置10 min，再送入電鏡觀察，選擇有代表性的區(qū)域拍攝。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)均用Origin 8.6與SPSS軟件進(jìn)行處理與分析，每組實驗均重復(fù)3次，取平均值，試驗結(jié)果以誤差的形式標(biāo)出。

2 結(jié)果與分析

2.1高靜壓處理對KGM-SPI復(fù)合溶膠乳化特性的影響

2.1.1 不同壓力對KGM-SPI復(fù)合溶膠乳化特性的影響

不同壓力處理KGM-SPI復(fù)合溶膠的乳化活性及乳化穩(wěn)定性如圖1所示。

圖1 不同壓力對KGM-SPI復(fù)合溶膠乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of different pressure on emulsifying and emulsion stability of the KGM-SPI compositesol

從圖1可以看出，KGM-SPI復(fù)合溶膠的乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在0～400 MPa壓力下，溶膠的乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨著壓力的升高而增加，并在400 MPa時達(dá)到最高；高于400 MPa后，乳化能力有所降低，出現(xiàn)下降的趨勢。此結(jié)論與沙小梅等對高壓處理大豆蛋白-大豆多糖體系的研究結(jié)果類似[23]。原因可能是當(dāng)壓力低于400 MPa時，隨著壓力升高，復(fù)合溶膠中的SPI蛋白高級結(jié)構(gòu)逐漸伸展，疏水性氨基酸側(cè)鏈外露，表面疏水性增加，親油性提高，同時也提高了KGM-SPI的相互作用和溶解性[24-25]，從而使乳化能力得到提高。但當(dāng)壓力超過400 MPa后，隨壓力逐漸增大，蛋白分子發(fā)生變性，進(jìn)而發(fā)生進(jìn)一步折疊和聚集， 導(dǎo)致復(fù)合大分子表面活性降低， 故乳化活性和乳化穩(wěn)定性又呈下降趨勢。

2.1.2 不同處理時間對KGM-SPI復(fù)合溶膠乳化特性的影響

不同時間處理KGM-SPI復(fù)合溶膠的乳化活性及乳化穩(wěn)定性的變化趨勢如圖2所示。

圖2 不同處理時間對KGM-SPI復(fù)合溶膠乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of different pressure holding time on emulsifying and emulsion stability of the KGM-SPI composite sol

由圖2可知，在400 MPa下，0～20 min范圍內(nèi)，復(fù)合體系的乳化活性及乳化穩(wěn)定性隨壓力處理時間呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。在處理10～15 min時，復(fù)合體系的乳化活性及乳化穩(wěn)定性均達(dá)到較好，與對照組相比分別提高了5.6%～6.2%和2.5%～2.7%，這與袁道強(qiáng)等的研究結(jié)果基本相符[26]。出現(xiàn)此趨勢的原因主要是隨著處理時間的延長，蛋白分子得到更充分的伸展，內(nèi)部氨基酸以及疏水基團(tuán)、活性巰基的外露導(dǎo)致表面疏水性增加[27]，與KGM的相互作用也逐漸增強(qiáng)，表面活性的增加導(dǎo)致了乳化性能的提高。而且與SPI發(fā)生相互交聯(lián)的同時，KGM自身也占據(jù)了一定空間，減少了蛋白分子間的相互作用，防止了聚集和沉淀的出現(xiàn)，所以乳化穩(wěn)定性提高。但在處理20 min以后，過長的處理時間使復(fù)合大分子裸露出來的基團(tuán)被重新包裹，而界面活性逐漸降低[28]，因此乳化能力隨之下降。

2.2高靜壓處理對KGM-SPI復(fù)合溶膠黏度的影響

2.2.1 不同壓力對KGM-SPI復(fù)合溶膠黏度的影響

不同壓力處理對KGM-SPI復(fù)合溶膠黏度的影響如圖3所示。從中可知，在0～600 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力增大，復(fù)合溶膠的黏度依然呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，與之前乳化活性、乳化穩(wěn)定性的變化規(guī)律相同。在壓力為400 MPa時，復(fù)合溶膠黏度達(dá)到最高，且與對照組相比有顯著提高。溶膠的黏度主要與溶膠中物質(zhì)的存在狀態(tài)有關(guān) ，即伸展?fàn)顟B(tài)的分子比無規(guī)則卷曲的分子體現(xiàn)出更大的表觀黏度[29]。在0～400 MPa壓力下，蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)在一定程度上變性，分子逐漸伸展，在這個過程中KGM可能也起到了促進(jìn)作用，同時，暴露出來的內(nèi)部極性基團(tuán)和疏水基團(tuán)數(shù)量逐漸增加，從而使得兩者間的交聯(lián)作用得到進(jìn)一步加強(qiáng)，體系的黏度隨之增加。但當(dāng)壓力達(dá)到400 MPa以上時，過高的壓力使溶膠分子轉(zhuǎn)向收縮折疊，KGM-SPI之間有序的鍵合作用被破壞或重組，分子進(jìn)一步聚集，水合度減小，溶液流動時受到的阻力大大減小[30]，導(dǎo)致最終黏度下降。

圖3 不同壓力對KGM-SPI復(fù)合溶膠剪切黏度的影響Fig.3 Effect of different pressure on viscosity of the KGM-SPIcomposite sol

2.2.2 不同處理時間對KGM-SPI復(fù)合溶膠黏度的影響

不同時間處理對KGM-SPI復(fù)合溶膠黏度的影響如圖4所示。

圖4 不同處理時間對KGM-SPI復(fù)合溶膠剪切黏度的影響Fig.4 Effect of different pressure holding time on viscosity of the KGM-SPI composite sol

從圖4可知，隨著時間的延長，復(fù)合溶膠的黏度依然呈先增大后減小的趨勢，與之前復(fù)合溶膠乳化性、乳化穩(wěn)定性等的變化基本相同，區(qū)別的地方在于，當(dāng)處理15 min時體系黏度達(dá)到最高值，并且與空白對照組相比提高了145.3%。這與HEMAR 等的結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)在中等剪切速率(10～100 s-1)下， 300 MPa和450 MPa高靜壓處理15 min時觀察到脫脂乳-明膠混合物黏度明顯增加[31]。原因可能是在高壓處理下，體系向體積減少的方向過渡，隨著處理時間的延長，逐漸伸展的蛋白分子與KGM形成較好的鍵合作用，體系由混亂轉(zhuǎn)為有序，不僅溶解度得到提高，結(jié)合水的能力也顯著增強(qiáng)[32-33]，表觀黏度明顯升高；過長的處理時間則使蛋白分子由伸展?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)向內(nèi)部收縮，分子間締合聚集加強(qiáng)，部分親水區(qū)域重新被包裹在內(nèi)部， 且與KGM之間發(fā)生熱力學(xué)不相容性[34]，導(dǎo)致復(fù)合物溶解性降低，因此體系黏度最終表現(xiàn)為下降。

2.3高靜壓處理對KGM-SPI復(fù)合溶膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 不同壓力對KGM-SPI復(fù)合溶膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

綜合乳化特性與黏度特性的研究結(jié)果，經(jīng)200、400、600 MPa高靜壓處理后的復(fù)合溶膠樣品功能性質(zhì)差異顯著，代表性強(qiáng)，故以它們作為研究對象來考察壓力對復(fù)合體系顯微結(jié)構(gòu)的影響。不同壓力下KGM-SPI復(fù)合溶膠的掃描電鏡圖如圖5所示。

a、b、b、d分別是未處理、200、400以及600 MPa處理后的掃描電鏡圖片圖5 不同壓力處理KGM-SPI復(fù)合溶膠前后的掃描電鏡照片(×200)Fig. 5 Effect of different pressure on SEM of the KGM-SPI composite sol(×200)

從圖5可知，未經(jīng)高靜壓處理的KGM-SPI復(fù)合體系 (圖5-a)相互貫穿、交聯(lián)形成一種三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但存在大量的孔洞且連接的結(jié)構(gòu)多數(shù)較細(xì)，孔洞的出現(xiàn)可能是因為KGM的存在促進(jìn)了發(fā)生有序聚集前SPI蛋白亞基的展開。在200～400 MPa高靜壓處理后，交聯(lián)的結(jié)構(gòu)明顯變粗(圖5-b)，孔洞數(shù)量與直徑也大大減少，并且在400 MPa時形成較為均勻緊密的三維網(wǎng)絡(luò)(圖5-c)，這與CAO等的研究結(jié)果很相似[35]。說明高靜壓處理后蛋白分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子逐漸伸展開來，蛋白分子的聚集減少，同時與KGM間的相互作用得到加強(qiáng)，穩(wěn)定性提高，表觀體現(xiàn)于乳化特性以及黏度的升高。當(dāng)處理壓力達(dá)到600 MPa時，孔洞數(shù)量又明顯增加，體系再次轉(zhuǎn)向無序狀態(tài)(圖5-d)，說明兩者間的相互作用開始減弱，也與前面的研究結(jié)果一致。同時有研究結(jié)果表明，KGM與 SPI兩者間的相互作用以氫鍵為主，這主要是因為KGM 為非離子型多糖，親水性極強(qiáng)，而蛋白質(zhì)與多糖分子鏈上含有大量的羥基、氨基、羰基等基團(tuán)，氫鍵作用極易發(fā)生于KGM與 SPI 這樣的分子中，且氫鍵易受高壓等因素的影響[36]。

2.3.2 不同處理時間對KGM-SPI復(fù)合溶膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

不同時間處理后KGM-SPI復(fù)合溶膠的掃描電鏡照片如圖6所示。

a、b、c、d分別是高靜壓400Mpa處理5min、10 min、15 min以及20 min后的掃描電鏡圖片圖6 不同時間處理KGM-SPI復(fù)合溶膠的掃描電鏡照片(×200)Fig.6 Effect of different pressure holding time on SEM of the KGM-SPI composite sol(×200)

從圖6中可看出，處理時間對復(fù)合溶膠結(jié)構(gòu)有顯著影響，復(fù)合體系的三維結(jié)構(gòu)原本混亂無序(圖6-a)，在400 MPa處理下，5～15 min范圍內(nèi)，逐漸變得均勻緊密，孔洞數(shù)量下降，直徑減小(圖6-b)，說明體系內(nèi)部的相互作用不斷增強(qiáng)，穩(wěn)定性也隨之逐步提高，在10 min與15 min時出現(xiàn)較多均勻光滑的連續(xù)相 (圖6-c)，此時體系穩(wěn)定性高， KGM-SPI復(fù)合溶膠的乳化特性與黏度能達(dá)到最好，證實了前面的實驗結(jié)果。隨著時間繼續(xù)延伸，原本均勻緊密的結(jié)構(gòu)逐漸瓦解，體系再度向無序狀態(tài)過渡，孔洞的數(shù)量與直徑都呈遞增趨勢(圖6-d)，說明在高壓下過長處理反而使得復(fù)合物之間的相互作用由強(qiáng)轉(zhuǎn)弱，但相比較而言，穩(wěn)定性仍然高于空白對照組，依然具有明顯優(yōu)勢[36]，故其乳化特性與黏度依舊均顯著優(yōu)于對照組。

3 結(jié)論

高靜壓處理會對復(fù)合溶膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，溶膠功能性質(zhì)也隨之發(fā)生改變。適當(dāng)?shù)母哽o壓處理(本文處理條件為400 MPa)，可以使KGM-SPI復(fù)合物的功能特性發(fā)生顯著性改善。然而目前國內(nèi)外關(guān)于高靜壓等非熱加工技術(shù)應(yīng)用于多糖/蛋白復(fù)合物改性的研究尚少，今后這方面還需要開展更多的研究，特別是對改性機(jī)理的探索，以期使經(jīng)改性后的多糖/蛋白復(fù)合物在膳食纖維乳飲料、多糖類酸奶等食品領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Effectofhighhydrostaticpressuretreatmentonthefunctionalpropertiesofkonjacglucomannan/soybeanproteincompositesol

TIAN Xue-zhi1,2, LONG Chang-zhou1,2, WANG Zi-yu1,2, ZHANG Ya-ning1, ZHANG Fu-sheng1*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(National Food Science and Engineering Experimental Teaching Center，Southwest University，Chongqing 400715，China)

Effect of high hydrostatic pressure on the functional properties of polysaccharide-protein mixture system was studied. Using konjac glucomannan(KGM) and soybean protein isolate(SPI) as raw materials, the emulsifying activity, emulsifying stability, viscosity properties and microstructure of the composite sol were investigated under high hydrostatic pressure . The results showed that the functional properties were significantly improved treated at 400 MPa pressure, the emulsifying activity and emulsifying stability achieved the best at 10-15 min (increased by 5.6%-6.2% and 2.5%-2.7% ), the viscosity also reached the highest value at 15min and increased 145.3% compared with the control group. Moreover, SEM analysis showed that the more uniform and dense three-dimensional network structure of the compound structure was formed after 400 MPa treatment, and the interaction between the polysaccharide and protein was enhanced.

high hydrostatic pressure (HHP); konjac glucomannan (KGM); soybean protein isolate (SPI); emulsifying properties; viscosity properties; microstructure

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014496

本科生(張甫生副教授為通訊作者,E-mail: zfsswu@163.com)。

國家自然科學(xué)項目基金(31301599)；中國博士后科學(xué)基金(2014M551502)

2017-04-10，改回日期：2017-05-12