余傳星 ，張 煥 ，趙自云 ，潘玉欽 ，王邱陳 ，劉 偉 ，朱 玲

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)免疫系及神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福建 福州 350004；3.福州市晉安區(qū)疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350014）

微菌落-雙分子信標(biāo)技術(shù)快速檢測結(jié)核桿菌的應(yīng)用評價

余傳星1*，張 煥2*，趙自云2*，潘玉欽3，王邱陳3，劉 偉3，朱 玲2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)免疫系及神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福建 福州 350004；3.福州市晉安區(qū)疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350014）

目的 探討結(jié)核病的準(zhǔn)確、快速、高特異性診斷方法，建立并評價微菌落-雙分子信標(biāo)法在結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用價值。 方法 采用MC-雙分子信標(biāo)技術(shù)與達(dá)安公司的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）的檢測結(jié)果相比較。 結(jié)果 102份臨床標(biāo)本中微菌落-雙分子信標(biāo)法檢出25份陽性，陽性率25%；達(dá)安結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒檢出25份陽性，陽性率也是25%。其中各有1例陽性標(biāo)本為陰性，2種檢測方法比較無顯著性差異（P＞0.05）。 結(jié)論 微菌落-雙分子信標(biāo)技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、高特異性等特點，不僅可快速發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者，而且可以監(jiān)測疫情，反映疾病的流行程度。

結(jié)核分枝桿菌；微菌落-雙分子信標(biāo)法；PCR-熒光法

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病。目前，全球已有20億人感染結(jié)核桿菌，活動性結(jié)核患者數(shù)達(dá)1 500萬，每年新發(fā)結(jié)核患者達(dá)800 萬～1 000 萬，有 180 萬人因結(jié)核病死亡［1-4］，已成為全球的重大公共衛(wèi)生問題。我國作為全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，對結(jié)核病的研究已成為人們普遍關(guān)注的熱點?，F(xiàn)有的細(xì)菌學(xué)診斷方法雖然是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于涂片陽性率低、培養(yǎng)耗時間，遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。本文采用微菌落-雙分子信標(biāo)技術(shù)［5］與達(dá)安公司結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較，以評價微菌落-雙分子信標(biāo)檢測方法的臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 改良羅斯氏培養(yǎng)基（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號A07-590B），結(jié)核桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒（中山大學(xué)自達(dá)安股份有限公司）。

1.2 標(biāo)本來源 收集于福州市晉安區(qū)疾病預(yù)防控制中心就診的結(jié)核病疑似患者的樣本。

1.3 標(biāo)本采集 采集患者肺部痰液標(biāo)本57份，支氣管灌洗液31份，胸腹水14份。收集晨痰，盛清潔干燥無菌的塑料痰瓶內(nèi)送檢。痰標(biāo)本應(yīng)以膿樣、干酪樣或膿性黏液樣性質(zhì)為合格標(biāo)本，痰量為3～5mL。

1.4 樣本前處理 取3～5 mL標(biāo)本置于50 mL離心管中，加入1～2倍的4%NaOH溶液，放于振蕩器上充分振蕩20 min，再加入40 mL PBS緩沖液，充分混勻后經(jīng)3600 rpm離心20 min，棄上清液，加入2 mL生理鹽水與沉渣混勻后備用。

1.5 微菌落培養(yǎng) 取10μL待測標(biāo)本接種于培養(yǎng)基上的微菌落膜表面，用L型玻棒涂勻，同時接種多張膜，分別用于微菌落的形態(tài)觀察和提取DNA之用。將接種了標(biāo)本的培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2的孵箱培養(yǎng)14 h后，細(xì)菌膜進(jìn)行透明、固定、封膜等特殊處理后在顯微鏡下觀察是否有細(xì)菌生長及微菌落的形態(tài)。

1.6 熒光定量PCR 用熱裂解法提取膜上微菌落的DNA分別進(jìn)行微菌落-雙分子信標(biāo)檢測及熒光定量PCR。參照本實驗室之前建立的雙分子信標(biāo)檢測方法［6］進(jìn)行熒光定量PCR實驗。達(dá)安公司結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒則按說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

MC-雙分子信標(biāo)法與達(dá)安結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒檢測結(jié)果顯示，MC-雙分子信標(biāo)法檢出25份陽性，陽性率25%；達(dá)安結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒檢出25份陽性，陽性率也是25%。其中各有1例陽性標(biāo)本為陰性，2種方法比較無顯著性差異（P＞0.05），見表 1。

表1 微菌落-雙分子信標(biāo)法與達(dá)安結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒檢測結(jié)果比較

3 討 論

快速檢測結(jié)核桿菌及其耐藥性一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點，依據(jù)檢測原理可以分為表型和基因型檢測，所謂表型檢測是通過觀察結(jié)核桿菌形態(tài)及分離培養(yǎng)進(jìn)行鑒定。尤其是檢出痰中含有結(jié)核分枝桿菌是臨床診斷肺結(jié)核或鑒別肺結(jié)核與其他肺病的重要依據(jù)［7-8］，而痰中結(jié)核桿菌的檢測方法常規(guī)采用痰涂片及痰培養(yǎng)。涂片雖快速、價廉、簡單易行，但敏感性低，通常需5 000～10 000條菌／mL才能得到陽性結(jié)果，特異性差，各種分枝桿菌均可著色，無法區(qū)別死菌與活菌［9-10］。本研究中將培養(yǎng)法與分子生物學(xué)方法相結(jié)合，從而建立了MC-雙分子信標(biāo)法快速診斷法。

本研究應(yīng)用微菌落-雙分子信標(biāo)法，與達(dá)安公司結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒檢測結(jié)果比較，2種方法無顯著性差異；但微菌落-雙分子信標(biāo)檢測方法不僅能夠在14 h內(nèi)觀察微菌落形態(tài)，還能夠區(qū)分死菌還是活菌，幫助流行病學(xué)的診斷，所以微菌落-雙分子信標(biāo)檢測方法具有準(zhǔn)確、快速、敏感、特異等優(yōu)點，有望成為結(jié)核病快速篩查診斷的新方法。

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R378.91

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1000-338X（2017）05-0036-01

2017-08-24

福建省社會發(fā)展引導(dǎo)性重點項目（2014Y0058）

*并列為第一作者。

朱玲（1962—），女，教授。 E-mail：lingzhu29@sina.com