楊建林，羅一鈞

(贛州市第五人民醫(yī)院，江西 贛州 341000)

輔助檢查醫(yī)學

DNA微陳列芯片法快速檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變的臨床應用

楊建林，羅一鈞

(贛州市第五人民醫(yī)院，江西 贛州 341000)

目的：探討DNA微陳列芯片法快速檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變的臨床應用效果。方法：通過數(shù)字表法選擇2014年5月—2016年5月初步診斷為結(jié)核病患者70 例的痰樣，使用DNA微陳列芯片法快速檢測，并同時通過傳統(tǒng)藥敏試驗和DNA測序法進行再次檢查以作為對照。結(jié)果：70 株結(jié)核分枝桿菌中藥物敏感株芯片雜交共計20 株，這一結(jié)果完全符合標準株，符合率100%(20/20)，30 株耐利福平(RIF)臨床分離株均檢測到rpoB基因突變，基因突變檢出率為100%(30/30)，50 株異煙肼耐藥株中有41 株檢測katG基因突變，檢出率82.00%，9 株檢測到inhA基因突變，檢出率18.00%(9/50)，這一檢測結(jié)果和測序結(jié)果完全符合。結(jié)論：DNA微陳列芯片法快速檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變效果良好，雖然暫且不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的藥敏試驗方法，但其檢測的靈敏度高，特異性和重復性好。

DNA微陳列芯片；結(jié)核分枝桿菌；基因突變

結(jié)核病是一種常見傳染病，近幾年發(fā)病率逐年升高，且由于抗結(jié)核類藥物使用的不規(guī)范，結(jié)核病患者體內(nèi)的結(jié)核桿菌已經(jīng)對大部分抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥性，進一步形成耐多藥結(jié)核病，這也是近年結(jié)核病病情嚴重、患者死亡率升高的主要原因之一[1-2]。結(jié)核分枝桿菌基因突變和耐藥性之間存在密切聯(lián)系，因此通過有效方法快速鑒定對結(jié)核病早期治療和控制耐藥菌的傳播具有重要的臨床價值，但是結(jié)核分枝桿菌的生長速度緩慢，因此尋求快速檢測耐藥結(jié)核菌彌補常規(guī)藥敏試驗的不足是目前臨床研究的重點所在[3-4]。本文分析了DNA微陳列芯片法快速檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變的臨床應用效果，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過數(shù)字表法選擇2014年5月—2016年5月接受分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變檢查結(jié)核病患者70 例，男36 例，女34 例，年齡(29.8±9.9) 歲。均經(jīng)患者本人同意并自愿簽署《知情同意書》。

1.2 方法

1.2.1 傳統(tǒng)藥物敏感性試驗

對結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進行傳統(tǒng)的分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗作為對照。其中，耐INH標準1 μg/mL為低度耐藥，耐INH標準10 μg/mL則為高度耐藥。耐RIF標準50 μg/mL為低度耐藥，耐RIF標準250 μg/mL則為高度耐藥。

1.2.2 痰液標本的處理

痰液標本加入到離心管，首先為了有效避免實驗室生物的污染，進行85 ℃水浴處理30 min，進行結(jié)核分枝桿菌的滅活。然后加入等量現(xiàn)配的濃度為10%的NaOH化痰試劑，再進行30 min的37 ℃水浴化痰處理。最后對樣本進行12 000 r/min的離心處理5 min，棄掉上清液，加入生理鹽水1 mL，振蕩后再次進行12 000 r/min的離心處理5 min，棄上清液。以上實驗操作完全在生物安全柜內(nèi)完成，以免發(fā)生感染。

1.2.3 DNA提取

DNA提取操作完全按照結(jié)核分枝桿菌的DNA提取采用配套的試劑盒說明書進行操作，首先加核酸提取液80 μL到核酸提取管內(nèi)，然后加入處理過的患者痰液標本，通過晶芯ExtractorTM36核酸快速提取儀進行振蕩處理5min，再進行94 ℃水浴處理5 min，最后進行5 000 r/min離心處理1 min。通過紫外分光光度法測定提取液的濃度、純度，放置在-20 ℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴增

將PCR擴增試劑放置在室溫條件下直至融化，然后進行充分混勻，4 000 r/min離心處理15 s，按照每管18 μL進行分裝，每個被測樣品需分裝3 管。然后分別向3 管內(nèi)加入2 μL的核酸提取液。然后放入PCR擴增儀進行擴增反應，其反應條件為37 ℃ 600 s、94 ℃ 600 s、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，共進行35 個循環(huán)；94℃ 30 s、72℃ 40 s、共進行10 個循環(huán)。72℃延伸420 s，放在4 ℃的條件下進行保存。最后需要在濃度為2%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.5 芯片雜交

將雜交緩沖液放置室溫至融化，充分混勻后4 000 r/min離心15 s，按9 μL/管進行分裝，每個被測樣品需分裝2管(分別進行利福平和異煙肼陣列的雜交)。將9 μL雜交緩沖液和6 μL PCR擴增產(chǎn)物(與利福平微陣列進行雜交的加入PCR擴增產(chǎn)物1、2各3 μL，與異煙肼微陣列進行雜交的加入PCR擴增產(chǎn)物1、3各3 μL)混合、離心，然后在PCR擴增儀上95 ℃變性5 min，取出并立即冰浴3 min。然后將處理好的芯片置于雜交盒內(nèi)，同時加入200 μL的雙蒸水以防樣品出現(xiàn)揮發(fā)情況。用微量移液器取上述變性處理好的樣品13.5 μL，通過蓋玻片上的小孔滴加在芯片上點陣所在的區(qū)域，迅速蓋好雜交盒并密封。將雜交盒放入晶芯ExtractorTMⅡ芯片雜交儀進行雜交處理，50 ℃雜交2 h。

1.2.6 芯片熒光掃描和結(jié)果分析以及測序分析

使用晶芯LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀掃描芯片，然后通過晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測芯片判別系統(tǒng)1.0.0212軟件分析熒光信號的強度，并對結(jié)果加以判讀。純化的PCR產(chǎn)物由ABIPRISM 310 Genetic Analyzer測序儀進行測序，檢測結(jié)果與芯片檢測結(jié)果進行比較。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

70株結(jié)核分枝桿菌中藥物敏感株芯片雜交共計20株，這一結(jié)果完全符合標準株，符合率100%(20/20)，30株耐利福平(RIF)臨床分離株均檢測到rpoB基因突變，基因突變檢出率為100%(30/30)，50株異煙肼耐藥株中有41株檢測katG基因突變，檢出率82.00%，9株檢測到inhA基因突變，檢出率18.00%(9/50)，且這一檢測結(jié)果和測序結(jié)果完全符合。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：DNA微陳列芯片法快速檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變效果良好，最終檢測結(jié)果和測序結(jié)果完全符合。這一結(jié)果和張立群等[5]的分析結(jié)果相符合，充分說明DNA微陳列芯片法快速檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變的臨床應用效果顯著。DNA微陳列芯片法快速檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變的主要檢測優(yōu)勢是可在短時間內(nèi)快速完成檢測，為疾病的診斷和治療提供有效快速的依據(jù)。而以往臨床傳統(tǒng)的藥敏試驗方法受到結(jié)核分枝桿菌生長緩慢等因素的限制，通常需要大約3～4 周的時間才能獲得最終檢測結(jié)果[6-9]。DNA微陳列芯片法所采用的檢測技術(shù)是一種分子生物學技術(shù)，這一技術(shù)能夠針對不同的基因突變，設(shè)計出相應的核苷酸探針，然后將其固定在固相載體上，同時能夠使用PCR技術(shù)對含有突變基因的片段進行擴增，并能夠?qū)⒑谢蛲蛔兊倪@些擴增片段和基因芯片雜交，其檢測結(jié)果和測序結(jié)果完全符合，可見這一檢測手段是可靠的[9]。

綜上所述，DNA微陳列芯片法快速檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變效果良好，雖然暫且不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的藥敏試驗方法，但其檢測的靈敏度高，特異性和重復性好。因此，DNA微陳列芯片法快速檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG和inhA基因突變可作為一種補充的藥敏試驗方法，能夠為結(jié)核病患者的早期有效治療提供快速的臨床診斷依據(jù)。

[1]徐威香，雷永良，王曉光，等.麗水市結(jié)核分枝桿菌5 種耐藥基因突變分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22(2)：353-356.

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[4]夏強，趙麗麗，劉志廣，等.等位基因特異性多重PCR快速檢測結(jié)核分枝桿菌喹諾酮耐藥性的初步研究[J].醫(yī)學研究雜志，2011，40(4)：31-34.

[5]張立群，王云霞，姚春艷，等.高特異性基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌的臨床應用評價[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2010，20(11)：1505-1508.

[6]彭章麗，劉梅，石亞萍，等.結(jié)核分枝桿菌katG、inhA、ahpC等突變與異煙肼耐藥關(guān)系的研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013，7(22)：9865-9868.

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[8]趙玉玲，趙東陽，李輝，等.7 年結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對一線和二線抗結(jié)核藥物耐藥趨勢監(jiān)測[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20(2)：338-340.

[9]李芳芳，唐曙明，李愛敏，等.膜芯片技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測的研究[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，34(21)：2792-2794.

2017-01-22

(本文編輯：張紅)

ClinicalapplicationofrapiddetectionofrpoB，katGandinhAgenemutationsinMycobacteriumtuberculosisbyDNAmicro-displaychipmethod

YANG Jianlin，LUO Yijun

(The Fifith People′s Hospital of Ganzhou，Ganzhou 341000，China)

Objective：To investigate the clinical effect of rapid detection of rpoB，katG and inhA gene mutations of Mycobacterium tuberculosis by DNA micro-display method.Methods：Through the digital meter method selection from May 2014 to May 2016 in hospital during the initial diagnosis of tuberculosis patients collected 70 cases of sputum samples，using DNA micro display chip method of fast detection，and at the same time through the traditional drug susceptibility testing and DNA sequencing method to check again as to explore the contrast analysis.Results：All 70 strains of Mycobacterium tuberculosis in drug sensitive strains hybridization totaling 20 strains，the results accord with the standard strain，the coincidence rate was 100% (20/20)，RIF (Li Fuping) resistance in 30 strains of clinical isolates were detected rpoB gene mutation，gene mutation rate was 100% (30/30)，50 strains of isoniazid resistant strains there are 41 strains of katG gene mutation detection，the detection rate of 82.00%，9 strains were detected inhA gene mutation detection rate of 18.00% (9/50)，and the test results and the sequencing result is entirely consistent.Conclusion：The method for rapid detection of mycobacterium tuberculosis DNA micro display chip rpoB，katG，and inhA gene mutation effect is good，though unable to replace the traditional drug sensitive test method，but its high detection sensitivity，specificity and good repeatability.

DNA micro display chips；Mycobacterium tuberculosis；genetic mutations

1671-8631(2017)11-0840-03

R521

B

楊建林(1981— )，女，江西省于都縣人，主管技師，主要從事臨床檢驗工作。