林蓓蓓,郁引飛

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 藥劑科,浙江 溫州 325027)

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠II度燒傷傷口的促愈合作用

林蓓蓓,郁引飛

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 藥劑科,浙江 溫州 325027)

目的:通過堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)在大鼠Ⅱ度燒傷傷口中的局部應(yīng)用,觀察其對(duì)燒傷傷口愈合和燒傷創(chuàng)面愈合各個(gè)階段中相關(guān)因子的作用.方法:10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠.采用同體對(duì)照的方法,用砝碼在其背部以脊柱為對(duì)稱軸,做2個(gè)直徑為2 cm的燒傷創(chuàng)面,2個(gè)創(chuàng)面間距>1.5 cm.右邊傷口給予不同濃度的bFGF,左邊傷口給予等體積的0.9%氯化鈉溶液為對(duì)照.隨機(jī)分成3組,每組15只,分別給予125、500和2 000 ng bFGF.隔天給藥1次至第14天.在造模后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d處死大鼠,并取下傷口組織進(jìn)行包埋切片.采用Masson染色法檢測(cè)組織中膠原的產(chǎn)生,并用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白(CD68)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的表達(dá).結(jié)果:傷口愈合率統(tǒng)計(jì)顯示bFGF可以促進(jìn)大鼠皮膚燒傷傷口愈合.Masson染色顯示bFGF可以促進(jìn)傷口肉芽組織形成和膠原產(chǎn)生.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示bFGF可以調(diào)節(jié)傷口中CD68、MMP-2、PCNA和TGF-β1的表達(dá).結(jié)論:bFGF可以調(diào)節(jié)傷口中CD68、MMP-2、PCNA和TGF-β1的表達(dá)從而促使大鼠II度燒傷傷口愈合.

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子;II度燒傷;傷口愈合;大鼠

在所有的損傷中,燒傷被認(rèn)為是引起年輕群體死亡率上升的主要原因之一.然而,到目前為止,除了皮膚的自體移植,幾乎不存在有效方法幫助大面積的燒傷傷口愈合.

傷口愈合的早期階段以炎癥為主,之后傷口慢慢修復(fù)與重塑[1].這個(gè)過程需要各種組織和各細(xì)胞間相互合作,包括炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等.這些細(xì)胞受到細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)分子的調(diào)節(jié)[2].傷口部位的炎癥細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生和釋放各種生長(zhǎng)因子[3].研究表明,局部應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子可以加速急性和慢性傷口的修復(fù)[4].

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是生長(zhǎng)因子家族的成員之一,它可以誘導(dǎo)DNA的合成和血管新生,刺激ECM的合成,降低I型膠原的合成[5].研究表明,bFGF應(yīng)用到皮膚傷口可以促進(jìn)皮膚急慢性傷口的愈合[6].此外,bFGF基因敲除小鼠皮膚傷口愈合非常緩慢[7],這些研究都表明,bFGF在傷口愈合中起關(guān)鍵性作用.但是關(guān)于bFGF對(duì)促進(jìn)燒傷的愈合作用的相關(guān)機(jī)制研究較少.本研究檢測(cè)了bFGF在大鼠皮膚燒傷中的作用,并進(jìn)一步探索了bFGF在傷口愈合各個(gè)階段中可能影響的促愈合相關(guān)蛋白的表達(dá).

1 材料與方法

1.1 模型建立 清潔級(jí)雌性SD大鼠,體質(zhì)量200~220 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2012-0028.參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法構(gòu)建大鼠II度燒傷模型,用8%的水合氯醛腹腔注射麻醉,固定于簡(jiǎn)易操作臺(tái),剪去背部毛發(fā),用碘伏對(duì)背部皮膚進(jìn)行消毒.將在熱水浴中加熱的砝碼在其背部以脊柱為對(duì)稱軸,做2個(gè)相距1.5 cm以上直徑2 cm的傷口.右邊傷口給予bFGF,左邊給予等量的0.9%氯化鈉溶液.

1.2 分組 對(duì)照組:n=45,0.9%氯化鈉溶液0.5 mL;實(shí)驗(yàn)組(bFGF混合0.9%氯化鈉溶液稀釋至0.5 mL):高劑量組,n=15,bFGF濃度為4 000 ng/mL;中劑量組,n=15,bFGF濃度為1 000 ng/mL;低劑量組,n=15,bFGF濃度為250 ng/mL;

1.3 給藥途徑及治療時(shí)間 給藥方法:傷口涂抹0.5 mL的bFGF或0.9%氯化鈉溶液后,無(wú)菌紗布包扎傷口,隔天換藥至14 d.

1.5 傷口愈合評(píng)價(jià) 分別于21 d和28 d量取傷口未愈合面積(用透明的紙畫下傷口面積,再將畫下的面積復(fù)印到坐標(biāo)紙上,數(shù)格計(jì)算出面積),計(jì)算比較傷口愈合率.傷口愈合率(%)=(開始時(shí)傷口面積-取材日傷口面積)/開始時(shí)傷口面積X100%[8].

1.6 病理學(xué)評(píng)價(jià) 分別在造模后3、7、14、21、28 d取bFGF與相應(yīng)的0.9%氯化鈉溶液的組織塊,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只大鼠,進(jìn)行石蠟包埋,切片.進(jìn)行Masson染色,光鏡觀察;免疫組織化學(xué)染色方法分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白(CD68)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)蛋白表達(dá)量.切片脫蠟脫水,高壓抗原修復(fù),山羊血清封閉,37 ℃孵育30 min,分別滴加鼠抗CD68(1:100稀釋)、鼠抗PCNA(1:100稀釋)、兔抗MMP-2(1:100稀釋)、兔抗TGF-β1(1:100稀釋),4 ℃過夜,37 ℃復(fù)溫30 min,滴加山羊抗兔FITC IgG(H+L)(1:200稀釋)、羊抗兔IgG-HRP(1:200稀釋)、羊抗鼠IgG-HRP(1:200稀釋),37 ℃孵育120 min,PBS溶液沖洗,DAB顯色,脫水,樹膠封片,顯微鏡觀察.每張切片隨機(jī)選3個(gè)高倍視野觀察相應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞分布.判斷標(biāo)準(zhǔn):顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),鏡下胞質(zhì)或胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞,無(wú)棕黃色顆粒者為陰性.

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad prism統(tǒng)計(jì)軟件分析.計(jì)量資料以表示,傷口愈合率結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn),各實(shí)驗(yàn)組間愈合率比較采用單因素方差分析,免疫組織化學(xué)結(jié)果分析采用秩和檢驗(yàn).P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 bFGF促進(jìn)大鼠燒傷傷口愈合 在大鼠傷口部位放上比初始傷口面積稍大的由硬紙板剪成的正方形框,拍攝照片并進(jìn)行圖像分析,如圖1所示,在21 d和28 d時(shí),對(duì)照組的愈合率分別為65.19%±3.34%、88.77%±1.69%,實(shí)驗(yàn)組的愈合率:低劑量組分別為84.79%±2.43%、97.53%±0.69%,中劑量組分別為86.31%±2.19%、97.68%±0.94%,高劑量組分別是81.34%±2.81%、96.99%±1.17%,給予bFGF治療的傷口的愈合速度明顯比對(duì)照組的傷口愈合速度快(P<0.05).中劑量促傷口愈合效果相對(duì)較好,但是各實(shí)驗(yàn)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),所以在后面的病理分析中選擇低劑量組作為實(shí)驗(yàn)組.

圖1 4組創(chuàng)面在0、21、28 d的傷口愈合情況

2.2 Masson染色結(jié)果 Masson染色可將組織中膠原纖維染成綠色,如圖2所示,在3 d時(shí)所有組別的皮膚上皮都深染壞死,層次增厚,表面有血痂,上皮下真皮纖維變性;與對(duì)照組比,實(shí)驗(yàn)組的真皮變性更加嚴(yán)重,并有空泡樣的變性;在7、14 d時(shí),實(shí)驗(yàn)組的真皮纖維比對(duì)照組有更多的水腫壞死,結(jié)構(gòu)破壞,毛囊及腺體壞死變性固縮,并且壞死的組織也開始被清除;在21 d時(shí),表面血痂剝脫,壞死組織被清除,組織重塑,膠原生成,實(shí)驗(yàn)組的皮膚膠原排列更加清晰,有新生血管形成;在28 d時(shí),對(duì)照組的膠原纖維排列紊亂,而實(shí)驗(yàn)組的膠原排列致密清晰.

2.3 bFGF調(diào)節(jié)傷口中CD68的表達(dá)水平 在清除壞死組織的早期(3、7、14 d時(shí)),實(shí)驗(yàn)組中CD68表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05);在組織的重塑后期(21 d時(shí)),實(shí)驗(yàn)組的CD68表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05),見圖3.

圖2 造模后不同時(shí)間點(diǎn)的傷口組織切片Masson染色(X400)

2.4 bFGF影響傷口中TGF-β1的水平 實(shí)驗(yàn)組在給藥14 d、21 d后,TGF-β1的表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05),而28 d時(shí)TGF-β1的表達(dá)量下降(P<0.05),見圖4.

圖3 bFGF對(duì)傷口中CD68表達(dá)的影響

2.5 bFGF對(duì)傷口中PCNA水平的影響 在7、14和21 d時(shí),實(shí)驗(yàn)組PCNA蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05);在28 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的PCNA蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖5.

2.6 bFGF影響傷口中MMP-2的水平 MMP-2在創(chuàng)面愈合早期(14 d)表達(dá)較高,并且實(shí)驗(yàn)組表達(dá)要高于對(duì)照組(P<0.05).而在21 d和28 d時(shí),MMP-2的表達(dá)逐漸降低,但實(shí)驗(yàn)組表達(dá)仍要高于對(duì)照組(P<0.05),見圖6.

一旦自動(dòng)制動(dòng)手柄放置在此位置，列車管迅速減壓到零，均衡風(fēng)缸以常用制動(dòng)速率減壓到零，16CP模塊響應(yīng)列車管減壓變化，迅速給作用管（16#管）充風(fēng)到最大允許壓力，BCCP模塊響應(yīng)作用管壓力增加，給機(jī)車制動(dòng)缸充風(fēng)產(chǎn)生緊急制動(dòng)作用；同時(shí)車輛副風(fēng)缸給車輛制動(dòng)缸充風(fēng)，車輛制動(dòng)機(jī)制動(dòng)。

3 討論

bFGF作為一種重要的促有絲分裂原,能夠促進(jìn)組織修復(fù),誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積,刺激結(jié)締組織增生,加速上皮細(xì)胞移行增殖,現(xiàn)已證明許多生長(zhǎng)因子在創(chuàng)面修復(fù)中具有重要作用[9-10],且已有用含bFGF的人造真皮用于燒傷創(chuàng)面修復(fù)等[11].然而,bFGF在大鼠II度燒傷傷口愈合的作用及其分子機(jī)制還未見報(bào)道.為此,我們構(gòu)建了大鼠燒傷模型,考察不同劑量的bFGF對(duì)于傷口愈合的作用,并設(shè)置給予0.9%氯化鈉溶液的空白對(duì)照組.在證實(shí)bFGF促創(chuàng)傷愈合的作用基礎(chǔ)之上,采用Masson染色和免疫組織化學(xué)分析證實(shí)bFGF通過促進(jìn)創(chuàng)傷中膠原蛋白的形成和炎癥反應(yīng)從而加速了這一燒傷愈合的過程.

燒傷傷口愈合是個(gè)復(fù)雜的過程.燒傷傷口中的一些印跡激活炎癥細(xì)胞,而這些炎癥細(xì)胞一旦激活,會(huì)釋放炎癥因子,并結(jié)合生長(zhǎng)因子試圖去清除引起傷口損傷的介質(zhì).隨后,細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子開始修復(fù)由于燒傷摧毀的表皮,使皮膚再上皮化,并觸發(fā)受傷真皮層中的成纖維細(xì)胞增殖[12].炎癥反應(yīng)主要是清除受損的組織碎片.中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的溶酶體,活性氧的代謝物,花生四烯酸類代謝物像白三烯類和前列腺素類在炎癥過程中起著非常重要的作用.這些炎癥介質(zhì)也有能力引起內(nèi)皮損傷和組織損傷,它們可能會(huì)加劇燒傷部位的損害[12].燒傷傷口愈合的另一個(gè)過程是血管新生,肉芽組織生成,細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成,膠原蛋白存儲(chǔ)和組織重塑.

圖4 bFGF對(duì)傷口中TGF-β1表達(dá)的影響

研究表明,bFGF可以作用于巨噬細(xì)胞并促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)促重塑因子TGF-β1[13].外源性應(yīng)用bFGF能夠通過提高TGF-β1的分泌,進(jìn)而協(xié)同其他生長(zhǎng)因子對(duì)肌成纖維細(xì)胞形成和凋亡發(fā)揮作用,最終影響愈合的結(jié)局[14].通過CD68免疫組織化學(xué)染色表明,經(jīng)bFGF治療后顯著的增加了燒傷修復(fù)早期3 d、7 d和14 d的巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68.這表明在創(chuàng)傷修復(fù)炎癥階段早期,bFGF可以趨化炎癥細(xì)胞像傷口部位聚集.而在燒傷修復(fù)后期bFGF治療組的減少,這也表明炎癥得到了控制,可以進(jìn)入燒傷修復(fù)的下一階段.再將組織切片進(jìn)行TGF-β1免疫組織化學(xué)染色,創(chuàng)面14 d和21 d時(shí),實(shí)驗(yàn)組TGF-β1的表達(dá)較對(duì)照組高.TGF-β1可以引起成纖維細(xì)胞中膠原的合成[15].這一結(jié)果意味著bFGF是通過增加傷口部位的TGF-β1的合成從而促進(jìn)了膠原的產(chǎn)生.在體內(nèi)不同微環(huán)境的影響下,巨噬細(xì)胞可以被極化為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞或選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞[16].M1型巨噬細(xì)胞在IFN-α、TNF-γ的誘導(dǎo)下生成,可分泌IL-1、IL-2等促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子,參與殺傷病原體微生物,導(dǎo)致機(jī)體組織炎癥和免疫損傷;而M2型巨噬細(xì)胞在IL-4、IL-13的誘導(dǎo)下生成,可分泌IL-10、TGF-β等抗炎性細(xì)胞因子,具有限制炎癥反應(yīng)、參與組織修復(fù)重塑的作用.在我們的研究中,傷口經(jīng)bFGF治療后早期炎癥增加,可能這個(gè)時(shí)期的M1型巨噬細(xì)胞多,利于清除壞死細(xì)胞和組織,而在14 d、21 d時(shí),實(shí)驗(yàn)組中TGF-β1表達(dá)較高,可能實(shí)驗(yàn)組中M1型巨噬細(xì)胞較早地進(jìn)行M2型的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)TGF-β1分泌有利于組織修復(fù).所以,我們的研究表明bFGF可以適當(dāng)?shù)钠胶饩奘杉?xì)胞M1/M2亞型轉(zhuǎn)化對(duì)于調(diào)節(jié)反應(yīng)及加速損傷修復(fù)再生具有重要意義.

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)切,在細(xì)胞增殖過程中起重要調(diào)控作用.最近研究報(bào)道,PCNA亦可參與許多其他細(xì)胞重要活動(dòng),如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、染色體重組及DNA甲基化等.通過PCNA的免疫組化染色表明bFGF顯著增加了傷口部位細(xì)胞增殖.有研究表明,PCNA、α-SMA以及IL-1α和胎兒皮膚創(chuàng)傷后無(wú)瘢痕愈合可能相關(guān)[17].并且,PCNA表達(dá)變化趨勢(shì)和血漿IL-1α含量的變化趨勢(shì)基本一致,都是先升后下降的過程,說明PCNA蛋白和IL-1α存在相關(guān)性[18].本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,PCNA和巨噬細(xì)胞的含量變化趨勢(shì)一致.

MMPs是一組由效應(yīng)細(xì)胞分泌、參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶,影響組織修復(fù)、重塑和瘢痕形成[19].MMPs是創(chuàng)傷早期清除壞死組織的重要物質(zhì),也是上皮細(xì)胞遷移覆蓋創(chuàng)面所必需的.隨著修復(fù)進(jìn)程的延續(xù),在組織愈合后期,MMPs主要定位于皮膚基底膜、血管內(nèi)皮細(xì)胞和創(chuàng)傷深部皮膚附件上皮細(xì)胞中,另外成纖維細(xì)胞中也有表達(dá)[20].創(chuàng)面外用bFGF治療14 d,21 d和28 d后,MMP-2的表達(dá)高于對(duì)照組.這表明bFGF可以促進(jìn)MMP-2的表達(dá),有利于壞死組織的及時(shí)清除,角質(zhì)形成細(xì)胞遷移.綜上所述,TGF-β1、PCNA和MMP-2的表達(dá)都與炎癥因子存在著相關(guān)性,炎癥階段是傷口愈合的基礎(chǔ),為肉芽組織的形成和組織重塑做準(zhǔn)備.

圖5 bFGF對(duì)傷口中PCNA表達(dá)的影響

在本研究中,我們證明了bFGF可以促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的愈合.bFGF通過調(diào)節(jié)皮膚傷口中CD68、TGF-β1、PCNA和MMP-2的表達(dá)從而加速傷口再上皮化、肉芽組織的形成和膠原的產(chǎn)生.在以往關(guān)于bFGF對(duì)燒傷創(chuàng)面愈合的研究并不少.但在我們的研究中首次對(duì)燒傷創(chuàng)面愈合各個(gè)階段中的相關(guān)因子進(jìn)行了全面的研究.在今后的研究中我們還可以通多細(xì)胞層面對(duì)這幾個(gè)蛋白的相關(guān)性作出更確切的研究.bFGF在臨床上應(yīng)用還需要大量的實(shí)驗(yàn)研究,例如最佳給藥劑量、給藥的時(shí)間間隔、治療窗口和bFGF與其他因子在傷口中的協(xié)同作用等,這些都需要被進(jìn)一步的探討研究.

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圖6 bFGF對(duì)傷口中MMP-2表達(dá)的影響

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(本文編輯:趙翠翠)

The healing function of basic fibroblast growth factor on the wound of second degree burns in rats

LIN Beibei, YU Yinfei.
Department of Pharmacy, the Eye Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou,325027

Objective:To examine the effect of topical basic fibroblast growth factor (bFGF) on wound healing in a rat skin partial thickness burn wound model.Methods:Female Sprague-Dawley rats were anaesthetized with an intraperitoneal injection of 10% chloralic hydrate (3.5 mL/kg). Hairs on the rat dorsum were clipped and then two partial thickness burn skin flaps were cut per rat. The two wounds were separated by at least 1.5 cm of unwounded skin. The right-side wounds were treated with different doses of bFGF, while the left-side wounds

equal volumes of saline as controls. Wounded rats were randomly divided into three groups (fifteen rats per group) and they were treated with 125, 500 and 2 000 ng of bFGF in right wounds respectively. bFGF treatments were repeated under anesthesia every other day for 14 days. The tissues were harvested and detected with Masson stain and immunohistochemistry to observe the expression of CD68, MMP-2,PCNA and TGF-β1.Results:By quantitative assessment of wound healing, we found that bFGF treatment significantly accelerated the rate of burn wound healing. Masson staining show that bFGF promoted the formation of granulation tissue and collagen production of wound. Immunohistochemical staining showed that the levels of CD68, MMP-2, PCNA and TGF-β1were significantly regulat in bFGF-treated groups compared to control.Conclusion:These findings suggest that bFGF significantly accelerates the healing of partial thickness burn wound healing by regulating the expression of CD68, MMP-2, PCNA and TGF-β1in rats.

basic fibroblast growth factor; partial thickness burn wound; wound healing; rats

R966

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.005

2017-02-20

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計(jì)劃項(xiàng)目(2016KYB207).

林蓓蓓(1989-),女,浙江蒼南人,藥師,碩士.

郁引飛,主任藥師,Email:wz88068866@163.com.