魏蜜+張偉+管維軒+朱潔倩+傅本重+王立華+李國元

摘要：為獲得并鑒定高效拮抗油茶主要真菌病害的拮抗菌，研究其拮抗作用，采用點接法和發(fā)酵培養(yǎng)法從油茶根部土壤分離獲得1株能同時拮抗6種油茶病害真菌的拮抗菌。通過生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，將該拮抗菌鑒定為解淀粉芽孢桿菌，并命名為Bacillus amyloliquefaciens D2WM。該拮抗菌能拮抗油茶炭疽病病菌（Colletotrichum nicotianae）、膠孢炭疽病病菌（C. gloeosporioide）、葉斑病病菌（Phyllosticta capitalensis）、軟腐病病菌（Agaricodochium camellia）、黑斑病病菌（Altermaria alternate）和潰瘍病病菌（Bothyosphaeria dothidea）6種油茶病害病原菌，且拮抗菌發(fā)酵產(chǎn)生的無菌濾液對以上6種病原菌的抑菌率均高于95%。同時，D2WM菌株發(fā)酵產(chǎn)生的10倍稀釋菌液還對細菌性軟腐病病原菌歐文氏菌3個亞種的抑菌圈均大于22 mm，是1株具有廣譜拮抗作用的生防菌株。D2WM菌株發(fā)酵液耐酸堿范圍廣，在pH值為9時拮抗作用最佳；不耐高溫，溫度達到80 ℃及以上時抑菌活性完全喪失。研究結(jié)果對細菌性軟腐病及油茶無公害防治提供了理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；鑒定；油茶病害；拮抗作用

中圖分類號： S435.659 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0100-05

收稿日期：2016-04-24

基金項目：國家自然科學基金（編號：31200488）；湖北省教育廳中青年人才項目（編號：Q20152707）；湖北省教育廳重點項目（編號：D20102704）；特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室開放基金重點項目（編號：2016K07）。

作者簡介：魏 蜜（1987—），女，湖北孝感人，博士，講師，主要從事微生物學和植物病害防治等方面的研究。Tel：（0712）2345155；E-mail：weimi555@163.com。 油茶（Camellia oleifera）屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），是我國特有的一種高級油料作物，主要生長于中國南方亞熱帶地區(qū)高山及丘陵地帶，是重要的木本油料樹種之一[1]。油茶病害種類繁多，油茶炭疽病、油茶葉枯病、油茶軟腐病是油茶生產(chǎn)中3種毀滅性病害，在我國各油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，油茶的地上各部位均可受害[2]，且油茶黑斑病、油茶潰瘍病等也時常發(fā)生，每年油茶產(chǎn)業(yè)因上述真菌性病害造成了巨大的經(jīng)濟損失。

芽孢桿菌（Bacillus）是一類理想的生防菌，在目前生防細菌中研究較多。周盈等報道了1種對胡蘿卜軟腐歐文氏菌具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌BSn5及其產(chǎn)生的抑菌蛋白APn5，但該菌只能拮抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌亞種，其生防范圍較窄[3]。劉君昂等公開了1種拮抗油茶病害的短芽孢桿菌Z26，它能有效抑制油茶炭疽病病菌、根腐病病菌、半邊瘋病菌等病原菌的生長，該生防菌劑對油茶炭疽病的最大抑制率達到 83.4%[4]。陳瓊珍等利用枯草芽孢桿菌對有害真菌的生防作用及最佳發(fā)酵條件進行研究，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌只對紅鐮刀菌的拮抗作用明顯[5]。目前，關(guān)于解淀粉芽孢桿菌能同時在油茶主要真菌性病害及細菌性軟腐病上的防治研究及應用報道較少。

本研究從油茶根部土壤分離獲得1株能拮抗油茶主要病害真菌的解淀粉芽孢桿菌D2WM。采用平板對峙法和發(fā)酵培養(yǎng)法研究該拮抗菌對油茶6種病害真菌的拮抗作用。另外，使用管碟法測定該拮抗菌的無菌發(fā)酵液對細菌性軟腐病病菌的拮抗作用。最后本研究對拮抗菌發(fā)酵菌液的理化性質(zhì)進行了初步研究，為油茶真菌病害及蔬菜細菌性軟腐病的無公害防治提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株來源：油茶炭疽病病菌（Colletotrichum nicotianae）、油茶膠孢炭疽病病菌（C. gloeosporioides）、油茶葉斑病病菌（Phyllosticta capitalensis）、油茶軟腐病病菌（Agaricodochium camellia）、油茶黑斑病病菌（Altermaria alternate）、油茶潰瘍病病菌（Bothyosphaeria dothidea），均分離自湖北孝感大悟油茶林地；胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種（Erwinia carotovora ssp. carotovora）、胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑脛亞種（E. carotovora ssp. atroseptica）、菊歐文氏菌（E. chrysanthemi），均分離自湖北孝感當?shù)厥卟颂镏懈癄€的蔬菜。所有菌株均保存于湖北工程學院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室。

1.2 培養(yǎng)基[6]及主要試劑和儀器

LB培養(yǎng)基（篩選培養(yǎng)基）：1 L中含有10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl、15～20 g瓊脂，pH值7.0～7.2，用去離子水調(diào)至總體積為1 L；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)基）：1 L中含有3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，15.0 g瓊脂，pH值7.2～7.4，用去離子水調(diào)至總體積為1 L。上述培養(yǎng)基分裝后于121 ℃滅菌20 min，備用。

DNA凝膠回收試劑盒、PCR反應用的各種試劑，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 拮抗菌的篩選、分離及拮抗作用研究

采用稀釋分離法[7]從油茶根部土壤分離拮抗細菌，取 10 g 健康油茶根際土樣加入到盛有90 mL無菌水和玻璃珠（直徑0.5 cm，每瓶30～50個）的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min 搖床中振蕩20 min后，將菌懸液放置在80 ℃水浴中保持15 min。將1 mL土壤懸浮液移入盛有9 mL無菌水的試管中，制成10-1菌懸液，依此類推，獲得10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液。梯度稀釋后，吸取100 μL稀釋度為 10-6～10-3的菌懸液均勻涂布在分離培養(yǎng)基上，將涂布有菌懸液的平板置于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后觀察分離培養(yǎng)基上菌落的狀態(tài)，用三步劃線法進行分離純化，統(tǒng)一編號登記。接種斜面后，可在4 ℃短暫保藏，用50%甘油作為保護劑，可在-80 ℃長久保藏。endprint

采用平板對峙法[8]篩選能同時拮抗各油茶病原真菌的拮抗細菌，將直徑為7 mm的病原菌餅置于PDA平板中心，然后用無菌牙簽蘸取待測菌，于等距離點（距平板中央1.5 cm）接拮抗菌，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5 d后觀察抑菌帶的大小，每個處理重復3次，篩選抑菌帶寬大于5 mm的菌株。

將初篩有拮抗作用的菌株在LB液體培養(yǎng)基中于 150 r/min 適溫培養(yǎng)24 h，發(fā)酵菌液以8 000 r/min離心 10 min，上清用0.22 μm微孔濾膜過濾至滅菌EP管中。將初篩拮抗菌濾液與約50 ℃的PDA固體培養(yǎng)基按體積比1 ∶ 19混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央放入直徑為7 mm的油茶病原真菌菌餅，以無菌水為對照，每個處理3次重復，5 d后測量病原菌菌落直徑。無菌濾液抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.7）×100%。

采用平板對峙法分析拮抗菌對真菌主要病害的拮抗作用[8]：將打好的直徑為7 mm的油茶炭疽病等病原菌菌餅置于PDA平板中心，然后用無菌牙簽蘸取待測菌，于等距離點（距平板中央1.5 cm）接拮抗菌，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后觀察抑菌帶的大小，每個處理重復3次。采用管碟法[9]分析拮抗菌對歐文氏菌的拮抗作用：在涂布有100 μL病原菌（約1×107 CFU/mL）的LB瓊脂平板上等距離用打孔器打直徑為7 mm的孔。每個孔中接入50 μL發(fā)酵液10倍稀釋液，以無菌水為對照，每個處理設(shè)置3次重復。在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)20～28 h后測量抑菌圈直徑，根據(jù)數(shù)值大小確定拮抗程度。

1.4 拮抗菌株鑒定

1.4.1 拮抗菌的形態(tài)特征和生理生化鑒定 將純化后的菌種轉(zhuǎn)接到LB平板上，于30 ℃培養(yǎng)24 h后，對菌落形態(tài)、顏色、基質(zhì)顏色及有無運動性等進行形態(tài)特征鑒定，并依據(jù)東秀珠等的方法[10]對拮抗菌株進行生理生化鑒定。

1.4.2 拮抗菌株的16S rDNA PCR擴增和序列測定 拮抗菌株基因組DNA的提取方法參考文獻[11]。采用生工生物工程（上海）股份有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒（編號：B518225）提取細菌基因組DNA，-20 ℃保存。

采用細菌的通用引物F27（AGAGTTTGATCCTGGCT CAG）和R1492（TACGGCTACCTTGTTACGACTT）進行PCR擴增，得到該細菌的16S rDNA。PCR反應總體系為50 μL：各 2 μL 引物F27和R1492（由天一輝遠生物科技有限公司合成）、5 μL 10×buffer、2 μL dNTP、1 μL Taq酶、5 μL MgCl2、33 μL 雙蒸水。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共設(shè)35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)顯示并記錄電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物委托天一輝遠生物科技有限公司進行純化和測序。

1.5 拮抗菌株無菌發(fā)酵液的特性研究

酸堿穩(wěn)定性測定[12]：將拮抗菌株菌液經(jīng)無菌濾器過濾，吸取5 mL無菌濾液轉(zhuǎn)入無菌試管中，用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)pH值分別至1、3、5、7、9、11、13，靜置1 h后，測試不同pH值拮抗菌株菌液對歐文氏菌的抑制作用。以不調(diào)pH值的濾液作為對照，每個處理重復3次。

熱穩(wěn)定性研究[13]：將拮抗菌液經(jīng)無菌濾器過濾，取5 mL無菌濾液轉(zhuǎn)入無菌試管中，分別在20、40、60、80、100 ℃下處理2 h，測試不同溫度處理的拮抗菌株菌液對歐文氏菌的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選和分離

以實驗室分離到的油茶炭疽病病菌（C. nicotianae）為指示菌，以分離得到的菌株為待檢菌，將分離純化得到的細菌利用平板對峙法依次篩選，初步確定對油茶主要真菌病害有拮抗作用的3株菌株D2WM、D9WM、D21WM。然后采用發(fā)酵法進行復篩，最終確定D2WM的拮抗作用最強。

2.2 拮抗菌株D2WM的形態(tài)學及生理生化特性分析

如圖1所示，D2WM菌株的菌體呈桿狀，周生鞭毛，并具有運動性；菌落為乳白色，呈近圓形，表面粗糙有褶皺，邊緣不規(guī)則，不產(chǎn)生可溶性色素。生理生化鑒定結(jié)果表明，該菌株屬于革蘭氏陽性菌，具有接觸酶活性，能水解淀粉，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖產(chǎn)酸，能利用檸檬酸鹽，能夠水解酪素并使明膠液化，能夠還原石蕊牛奶和硝酸鹽，伏-普（V-P）反應呈陽性，不具有卵磷脂酶活性，不能水解馬尿酸鹽和酪氨酸，不能利用葡萄糖產(chǎn)氣。

2.3 拮抗菌株D2WM的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對菌株D2WM進行分子鑒定，將測得的16S rDNA序列（片段長度為1 439 bp）與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST分析，選取9株菌株用ClustalX 2.1進行多序列比對分析，利用MEGA 6.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和聚類分析，如圖2所示。菌株D2WM（登錄號為KU973511）與GenBank中登錄號為HM107808.1[解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） strain 15]菌株的同源性達到99%。依據(jù)16S rDNA分類標準，一般認為16S rDNA序列同源性大于97%，可認為屬于同一個種。結(jié)合上述形態(tài)和部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌株D2WM屬于解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

2.4 拮抗菌株D2WM的拮抗作用分析

采用平板對峙法和發(fā)酵菌液培養(yǎng)法開展解淀粉芽孢桿菌D2WM與多種油茶病原菌拮抗作用研究。由圖3可知，解淀粉芽孢桿菌D2WM對油茶炭疽病、油茶膠孢炭疽病、油茶葉斑病、油茶軟腐病、油茶黑斑病和油茶潰瘍病6種油茶病害致病菌均有較好的拮抗作用，尤其是對油茶炭疽病病菌、葉斑病病菌、黑斑病病菌的拮抗效果明顯。由表1可知，解淀粉芽孢桿菌D2WM對油茶主要病害致病菌的抑菌率均高于95%，尤其是對葉斑病病菌的抑菌率達到100.00%。上述結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌D2WM的抗菌譜較廣，是1株針對油茶主要病害的高效生防菌株。endprint

另外，本研究還考察了解淀粉芽孢桿菌D2WM發(fā)酵液對細菌性軟腐病菌歐文氏菌的拮抗作用。由圖4可知，D2WM發(fā)酵液的10倍稀釋液對胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種、胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑脛亞種、菊歐文氏菌3個亞種的抑菌圈直徑均大，抑制效果較好，其無菌水對照處理組均未出現(xiàn)抑菌圈。

2.5 拮抗菌株D2WM的拮抗物質(zhì)特性研究

2.5.1 酸堿穩(wěn)定性研究 由圖5可知，D2WM菌株發(fā)酵液的無菌濾液酸堿耐受范圍較廣，在pH值為1～11范圍內(nèi)對軟腐病病原菌均有一定的抑制效果，并且在pH值為9時，其抑制效果最佳，證明偏堿性的環(huán)境更有利于無菌濾液中的有效成分發(fā)揮拮抗作用。

2.5.2 熱穩(wěn)定性研究 由圖6可知，D2WM菌株發(fā)酵液的無菌濾液在20～60 ℃范圍內(nèi)保留抑菌活性。試驗同時得到未經(jīng)處理的無菌濾液在室溫25 ℃條件下的抑菌圈直徑為（31.2±0.4）mm。結(jié)果表明，溫度大于40 ℃時會減弱無菌濾液的拮抗效果，當溫度高于80 ℃時，抑菌活性喪失，說明該無菌濾液中的有效成分不耐高溫。

3 討論與結(jié)論

本試驗通過對油茶主要病害的拮抗菌進行雙重篩選，最終獲得1株能同時高效拮抗油茶主要病害和歐文氏菌的解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）D2WM。該菌株分離自油茶健康植株根際土壤，經(jīng)檢測無致病性，具有較穩(wěn)定的生防作用?，F(xiàn)有報道中解淀粉芽孢桿菌多見于對真菌的抑制，王英國等從堆肥中分離到1株解淀粉酶芽孢桿菌，通過產(chǎn)生抗菌多肽類物質(zhì)拮抗尖孢鐮刀菌、草莓蛇病菌、毛霉和黑曲霉等多種真菌[14]。勾長龍等分離獲得1株對人參根腐病病原菌拮抗作用較強的解淀粉芽孢桿菌HB-3，其無菌發(fā)酵液對人參根腐病病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有顯著的抑制作用[15]。同時也有利用解淀粉芽孢桿菌對采后柑橘綠霉病的生防效果的相關(guān)研究等[16]。本研究篩選得到的解淀粉芽孢桿菌對油茶的6種主要病害真菌均有較好的抑制作用，同時還能較好地抑制細菌性軟腐病歐文氏菌的3個亞種，說明解淀粉芽孢桿菌確實是理想的生防菌株來源。

研究表明，解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生抑菌蛋白類、脂肽類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類、寡肽酶、肽類和聚酮化合物等[17-21]。本研究對解淀粉芽孢桿菌D2WM的抑菌物質(zhì)特性研究表明，其無菌濾液耐酸堿范圍較廣，在偏堿性條件下的抑菌活性更高，但是其熱穩(wěn)定性較差，推測其抑菌物質(zhì)成分中含有蛋白類[18]。下一步將分別采用有機溶劑提取法和硫酸銨沉淀法從菌株發(fā)酵液中制備出抑菌物質(zhì)粗提液和粗蛋白液，并對活性粗提物進行高效液相色譜（HPLC）法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析[22-23]，為揭示拮抗菌的物質(zhì)基礎(chǔ)和拮抗機制奠定基礎(chǔ)。另外，該拮抗菌株液體培養(yǎng)代謝產(chǎn)物只需要在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～20 h即可獲得較好的拮抗效果，相對于一般細菌、真菌大大縮短了培養(yǎng)時間，降低了生產(chǎn)成本[6]。

目前，對油茶主要病害和細菌性軟腐病普遍通過種植抗性品種和化學防治來控制，過多地使用化學殺菌劑有危害人類身體健康、藥物殘留破壞生態(tài)環(huán)境、引發(fā)病原物產(chǎn)生抗藥性、影響產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全等諸多缺點，不利于綠色可持續(xù)發(fā)展[4]。尋求安全、高效和經(jīng)濟的生物源農(nóng)藥已成為當前防治細菌性軟腐病和油茶病害的熱點和當務(wù)之急，其中拮抗微生物在植物病害生物防治中起到十分重要的作用。本研究首次報道了單一微生物菌劑同時防治多種油茶病原真菌和歐文氏菌的3個亞種，在油茶真菌病害及蔬菜細菌性軟腐病的無公害防治上有一定的應用潛力。

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