杜道坤+賀娟+孟利東+康志鈺

摘要：為探討黑青稞色素資源的開(kāi)發(fā)與利用，以完整黑青稞種子為材料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面分析法，以提取溫度、液料比、乙醇濃度、pH值為因素，花色苷提取量為響應(yīng)值優(yōu)化黑青稞花色苷提取工藝，進(jìn)而測(cè)定其還原能力，以及清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的能力。結(jié)果表明，黑青稞花色苷最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度60 ℃，液料比10.04 mL ∶ g，乙醇濃度55.76%，pH值1，在該條件下提取1 h花色苷的實(shí)際提取量為 9.68 mg/100 g，而在此基礎(chǔ)上使用超聲波提取40 min，提取量達(dá)到14.04 mg/100 g，提高了提取效率。同時(shí)所提黑青稞花色苷的抗氧化活性較強(qiáng)，且抗氧化能力與花色苷濃度間存在劑量效應(yīng)關(guān)系；與維生素C（vitamin C，簡(jiǎn)稱VC）相比，黑青稞花色苷清除DPPH自由基和羥自由基能力較強(qiáng)，但還原能力和清除超氧陰離子能力沒(méi)有VC強(qiáng)。黑青稞花色苷對(duì)自由基的清除能力大小依次為DPPH自由基>羥自由基>超氧陰離子自由基，半抑制濃度（50% inhibitory concentration，簡(jiǎn)稱IC50）依次為0.186、0.268、0.293 mg/mL，說(shuō)明黑青稞花色苷是一種較好的天然抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：黑青稞；花色苷；響應(yīng)面法；提取工藝；抗氧化活性

中圖分類號(hào)： S512.301 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0173-06

收稿日期：2016-04-20

基金項(xiàng)目：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新基金。

作者簡(jiǎn)介：杜道坤（1989—），男，河南信陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事作物遺傳和品種改良研究。E-mail：490041070@qq.com。

通信作者：康志鈺，博士，副教授，主要從事作物遺傳育種及種子科學(xué)與工程方面的研究。E-mail：zhiyukang@163.com。 青稞（Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook.f.）在植物分類學(xué)上為禾本科大麥屬普通大麥種多棱裸粒大麥變種[1]。我國(guó)擁有豐富的青稞資源，品種繁多、種類各異，其中黑青稞是一種獨(dú)特的種質(zhì)資源，具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。黑青稞種皮中含有豐富的花色苷而區(qū)別于普通白青稞，單月琴就從囊謙黑青稞的酸性乙醇提取液中鑒定出可能的7種花色苷[2]?；ㄉ帐且环N的水溶性的天然色素，它主要存在于植物的花、果實(shí)、種子中，從而使它們呈現(xiàn)出黑、紫、藍(lán)等多種顏色?，F(xiàn)代研究證明，人工合成的色素對(duì)人類的健康存在潛在的致畸性、致癌性[3]，而天然色素花色苷不僅無(wú)毒無(wú)害，還具有清除自由基、防癌抗腫瘤、清脂減肥等與人類健康息息相關(guān)的功能[4-6]，所以黑青稞具有生產(chǎn)天然色素的開(kāi)發(fā)和利用前景，而提取其中的花色苷是利用黑青稞的第1步，研究其提取工藝具有重要意義。

不同的提取條件對(duì)黑青稞花色苷的提取效果存在不同的影響。響應(yīng)面分析法（response surface methodology，簡(jiǎn)稱RSM）就是使用多元二次回歸方程來(lái)擬合多個(gè)提取條件（因素）與試驗(yàn)指標(biāo)（響應(yīng)值）之間的函數(shù)關(guān)系，并通過(guò)分析回歸方程來(lái)優(yōu)化工藝參數(shù)，它保留了正交試驗(yàn)工作量少的優(yōu)點(diǎn)，還克服了不能在整個(gè)區(qū)域上得出最佳因素組合和最優(yōu)值的缺點(diǎn)[7-8]。陳建國(guó)等使用這種方法以黑青稞種子粉為材料優(yōu)化了其花色苷的提取工藝[9]。但是青稞種子中淀粉成分獨(dú)特，普遍含有74%～78%的支鏈淀粉，有的甚至更高[10]，使用種子粉提取在加熱的過(guò)程中使提取液變得黏稠、糊化而影響測(cè)定結(jié)果，且黑青稞花色苷多數(shù)集中在種皮，所以本研究以去雜的、完整的黑青稞種子為材料，使用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并初步探索超聲波輔助提取黑青稞花色苷，同時(shí)測(cè)定所得花色苷提取液的抗氧化活性，旨為黑青稞天然色素的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以云南省當(dāng)?shù)胤N皮顏色為黑色的青稞為材料。

主要試劑有甲醇、乙醇、鹽酸、三氯乙酸、檸檬酸、冰乙酸、甲酸、乙酸乙酯、30%雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡(jiǎn)稱DPPH）、鐵氰化鉀、氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris-base、鄰苯三酚，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

主要儀器有Agilent Cary60紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）、Alpha 1-2型冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Martin Christ公司）、RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、予華SHZ-D型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、KQ32001超聲波震蕩器（東莞市柯橋超聲波設(shè)備有限公司）、YXT-2型高速電動(dòng)離心機(jī)、恒溫水浴鍋、電子天平等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑青稞花色苷吸收波長(zhǎng)的選擇 參照孫榮琴等的方法[11]，使用1%鹽酸甲醇進(jìn)行提取，將提取液離心定容后再用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Agilent Cary 60）進(jìn)行250～700 nm的掃描，確定可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)最大吸收波長(zhǎng)（λmax）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以黑色種皮的青稞種子為材料，分別考察種子粉碎與未粉碎、提取劑、乙醇濃度、提取劑pH值、酸化劑、提取溫度、提取時(shí)間、液料比8個(gè)單因素對(duì)黑青稞籽粒花色苷提取量的影響。

1.3.2.1 種子粉碎與未粉碎的選擇 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子和過(guò)60目篩網(wǎng)的黑青稞種子粉，按照 10 mL ∶ 1 g 的液料比，以鹽酸為酸化劑，配制pH值=3的60%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.2 提取劑的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，分別配制pH值=3的蒸餾水、60%甲醇、純甲醇、60%乙醇、純乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。endprint

1.3.2.3 乙醇濃度的選擇 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，分別配制pH值=3的30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.4 pH值的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，分別配制pH值為1、2、3、4、5的60%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.5 酸化劑的選擇 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，分別以鹽酸、三氯乙酸、冰乙酸、甲酸、檸檬酸為pH值調(diào)節(jié)劑，配制pH值=3的60%乙醇在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.6 提取溫度的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，配制pH值=3的60%乙醇，分別在溫度為30、40、50、60、70、80 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.7 提取時(shí)間的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，配制pH值=3的60%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下分別提取0.5、1、2、3、4、5 h。

1.3.2.8 液料比的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，分別按照5 mL ∶ 1 g、10 mL ∶ 1 g、20 mL ∶ 1 g、30 mL ∶ 1 g、40 mL ∶ 1 g、50 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，配制pH值=3的60%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下分別提取1 h。

1.3.3 花色苷提取量的測(cè)定 將按照以上單因素試驗(yàn)所確定的提取條件得到的提取液離心后，以提取劑為空白對(duì)照，在λmax處測(cè)定吸光度，參考趙桃等的方法[12]計(jì)算得出提取量，均平行測(cè)定3次，相關(guān)公式：

提取量（mg/100 g）=D×V×N×10098.2×m。

式中：D為在λmax處的吸光度；V為稀釋體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；98.2為花色素的平均消光系數(shù)；m為樣品干質(zhì)量，g。

1.3.4 黑青稞花色苷的響應(yīng)面試驗(yàn)及模型驗(yàn)證 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)黑青稞花色苷提取量影響較大的4個(gè)因素提取溫度（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）、pH值（D）作為影響因子，以提取量作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理使用4因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。利用 Design-Expert 8.06軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用響應(yīng)面法分析得出的黑青稞花色苷最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，算出實(shí)際提取

量與模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較。

1.3.5 超聲波輔助提取試驗(yàn) 根據(jù)所得最佳提取條件，為進(jìn)一步縮短提取時(shí)間，進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，超聲波分別提取20、40、60、80 min后測(cè)定提取量，平行測(cè)定3次。

1.3.6 抗氧化性的測(cè)定 根據(jù)“1.3.4”節(jié)優(yōu)化的提取條件提取黑青稞中的花色苷，濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次進(jìn)行純化，40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶液黏稠，最后置于冷凍干燥機(jī)中獲得紫色凍干粉，然后用60%乙醇溶液配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的黑青稞花色苷溶液進(jìn)行抗氧化性的研究，使用相同濃度的維生素C（vitamin C，簡(jiǎn)稱VC）溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6.1 還原能力的測(cè)定參考莫開(kāi)菊等的方法[13]。采用普魯士法，分別準(zhǔn)確移取1.0 mL不同濃度樣品于干燥試管中，再依次加入3.0 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=6.6）、2.5 mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液，于50 ℃水浴保溫 20 min 后，迅速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，離心，取3.0 mL上清液，再依次加入3.0 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后，室溫靜置10 min，再在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度。

1.3.6.2 DPPH清除能力參考朱璐等的方法[14]。精確稱取2.5 mg DPPH粉末，用無(wú)水乙醇定容至100 mL，避光保存?zhèn)溆?。分別取1.0 mL不同濃度的樣品溶液于試管中，再加入2.0 mL DPPH溶液，搖勻后室溫避光保存30 min，以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，在517 nm處測(cè)吸光度。計(jì)算清除率，并計(jì)算當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)所需的濃度，即IC50值，清除率計(jì)算公式如下：

清除率=（1-D1（517 nm）-D2（517 nm）D0（517 nm））×100%。

式中：D0（517 nm）為不加樣品溶液的空白管溶液的吸光度；D1（517 nm）為反應(yīng)溶液的吸光度；D2（517 nm）為不加DPPH溶液的對(duì)照管吸光度。

1.3.6.3 羥自由基清除能力參考趙桃等的方法[12] 取干燥試管，依次加入1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2、1.0 mL 10 mmol/L FeSO4、1.0 mL 10 mmol/L水楊酸乙醇溶液，再加入1.0 mL樣品溶液，最后加入1.0 mL H2O2于37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水作為對(duì)照，在510 nm處測(cè)吸光度，計(jì)算清除率：

清除率=（1-D1（510 nm）-D2（510 nm）D0（510 nm））×100%。

式中：D0（510 nm）為不加樣品溶液空白管溶液的吸光度；D1（510 nm）為反應(yīng)溶液的吸光度；D2（510 nm）為含1.0 mL H2O2和1.0 mL樣品溶液對(duì)照管的吸光度。

1.3.6.4 超氧陰離子自由基清除能力參考資名揚(yáng)等的方法[15] 采用鄰苯三酚自氧化速率法，取干燥試管加入 4.5 mL pH值=8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液和4.5 mL蒸餾水，混合后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min，然后加入于25 ℃預(yù)熱過(guò)的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速搖勻后倒入比色皿，每隔0.5 min在波長(zhǎng)320 nm處測(cè)定溶液的吸光度，至5 min后停止。計(jì)算線性范圍內(nèi)1 min吸光度的增加值（ΔD0（320 nm））。在加入鄰苯三酚前，先加入1.0 mL樣品溶液，蒸餾水3.5 mL，從而得到ΔD320 nm，按下式計(jì)算清除率：endprint

清除率=ΔD0（320 nm）-ΔD320 nmΔD0（320 nm）×100%。

式中：ΔD0（320 nm）表示鄰苯三酚自氧化速率；ΔD320 nm表示加入樣品溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑青稞花色苷吸收波長(zhǎng)的確定

由圖1可知，黑青稞花色苷提液葉在紫外區(qū)270～280 nm 和可見(jiàn)光區(qū)500～550 nm之間均有吸收峰出現(xiàn)，分別為275、528 nm，符合花色苷特征吸收峰的范圍，在324 nm處有吸收峰，則表示該色素分子結(jié)構(gòu)具有酰化基團(tuán)[16]。因此確定黑青稞花色苷測(cè)定波長(zhǎng)為528 nm。

2.2 花色苷提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 籽粒粉碎與未粉碎的影響 由圖2-A可看出，完整種子的花色苷提取量高于過(guò)60目篩的黑青稞種子粉，這是由于黑青稞種子中含有大量的支鏈淀粉[10]，在加熱過(guò)程中造成溶液黏稠不利于色素的溶解。因此，以后試驗(yàn)均采用完整的種子浸提。

2.2.2 提取劑的影響 由圖2-B可看出，以60%甲醇為提取劑時(shí)花色苷提取量最高，其次為60%乙醇，100%乙醇的花色苷提取量最低，說(shuō)明水能促進(jìn)色素的溶解。由于甲醇對(duì)人體毒性較強(qiáng)，而乙醇無(wú)毒且易回收，因此一般選用一定濃度的乙醇溶液作為提取劑。

2.2.3 乙醇濃度的影響 由圖2-C可知，隨著乙醇濃度的增大，花色苷提取量先升高后下降，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，花色苷提取量最高，當(dāng)超過(guò)60%后，花色苷提取量便開(kāi)始下降。由于水能滲透進(jìn)植物細(xì)胞，因此適量的水有利于花色苷從細(xì)胞中滲出。由此可知，60%乙醇溶液提取效果最好。

2.2.4 提取液pH值的影響 由圖2-D可知，當(dāng)提取液pH值為2時(shí)花色苷提取量最高，之后隨著pH值的升高，花色苷提取量開(kāi)始下降。酸性溶劑能破壞細(xì)胞膜從而有利于水溶性色素的溶解，但過(guò)高的pH值會(huì)使溶液中花色苷的結(jié)構(gòu)向無(wú)色的查耳酮轉(zhuǎn)變，穩(wěn)定性變差[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，黑青稞花色苷溶液在pH值為2時(shí)比較穩(wěn)定。

2.2.5 溶液酸化劑的影響 由圖2-E可知，經(jīng)鹽酸酸化的提取劑提取花色苷的提取量最高，其次為甲酸，檸檬酸的提取量最低，所以以鹽酸作為下步試驗(yàn)的酸化劑。該結(jié)果與趙桃等的研究結(jié)果[12]不一致，可能是其他提取條件不一樣或不同黑青稞材料的花色苷對(duì)各酸化劑的適應(yīng)性不同所致。

2.2.6 提取溫度的影響 由圖2-F可知，隨著提取溫度的升高，黑青稞花色苷提取量先升高后降低，在50 ℃時(shí)提取量達(dá)到最大值，此時(shí)再提高溫度，就會(huì)對(duì)花色苷的結(jié)構(gòu)造成破壞，促進(jìn)其降解，從而使提取量降低。

2.2.7 提取時(shí)間的影響 由圖2-G可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷提取量也在逐漸提高。提取時(shí)間從0.5 h升到 1 h 時(shí)，黑青稞花色苷提取量提高明顯，而后再增加提取時(shí)間，提取量雖有提高但它們之間變化并不明顯。過(guò)長(zhǎng)的提取時(shí)間可能會(huì)促進(jìn)雜質(zhì)的滲出和花色苷受熱降解，所以選擇提取時(shí)間為1 h。

2.2.8 液料比的影響 由圖2-H可知，隨著液料比的增大，花色苷提取量先提高后變化平緩，10 mL ∶ 1 g液料比的提取量最高。當(dāng)液料比超過(guò)10 mL ∶ 1 g時(shí)，增加液料比對(duì)提取效果影響并不明顯，并且過(guò)量的提取劑會(huì)增加濃縮的時(shí)間與成本。

2.3 數(shù)學(xué)模型與方差分析結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）、pH值（D）等4個(gè)對(duì)黑青稞花色苷提取量影響較大的因素為自變量，以提取量為響應(yīng)值的響應(yīng)面分析結(jié)果如表2所示。

使用Design-Exper 8.06軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以提取量（Y）為目標(biāo)函數(shù)，提取溫度（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）、pH值（D）為自變量的二次多元回歸方程：

Y=-38.976 43+0.869 28A-0.230 19B+0.767 75C+2.072 51D-4.582 05×10-3AB-6.587 25×10-4AC-0.067 739AD+0.0244 27BC-0.078 494BD+0.040 462CD-5.445 78×10-3A2-0.038 747B2-9.091 41×10-3C2-0.795 13D2。

由表3可知，該模型P<0.000 1，極顯著。模型R2為0963 2>0.900，說(shuō)明相關(guān)性良好，即該模型可以解釋 96.32%的數(shù)據(jù)。失擬項(xiàng)不顯著，表明回歸方程對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度高，可以使用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。對(duì)模型中各回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A、D因素對(duì)提取量的影響極顯著，各因素對(duì)提取量的影響從大到小排序?yàn)閜H值>提取溫度>液料比>乙醇濃度，并且溫度和pH值交互影響顯著，液料比和乙醇濃度交互影響極顯著。

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

響應(yīng)曲面能直觀反映各因素間的相互作用，由上述研究結(jié)果可知AD、BC交互作用分別為顯著、極顯著，使用 Design-Exper 806軟件得到相應(yīng)的響應(yīng)曲面和等高線，如圖3、圖4所示。隨著pH值、液料比、乙醇濃度這3個(gè)因素的增大或減小，對(duì)提取量的影響較大，并且pH值對(duì)提取量變化的影響極顯著。

通過(guò)軟件對(duì)方程進(jìn)一步分析得出，黑青稞花色苷提取的最佳條件為提取溫度60 ℃，液料比10.04 mL ∶ 1 g，乙醇濃度55.76%，pH值=1，在此條件下提取量的預(yù)測(cè)值為 9.29 mg/100 g。

2.5 模型驗(yàn)證和超聲波輔助提取

對(duì)根據(jù)模型得到的提取黑青稞花色苷的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，平行測(cè)定3次得到的實(shí)際提取量平均值為9.68 mg/100 g，

與模型理論值9.29 mg/100 g很接近，表明該模型對(duì)黑青稞花色苷的提取具有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。endprint

在最優(yōu)提取條件的基礎(chǔ)上使用超聲波輔助提取黑青稞總花色苷的結(jié)果如圖5所示，可見(jiàn)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黑青稞花色苷提取量也在不斷提高。這是由于超聲波增強(qiáng)了溶劑的水合與滲透作用，加速了花色苷的溶出。超聲波處理20 min后花色苷提取量為11.15 mg/100 g，不僅比浸提法提取1 h得到的提取量要高1.47 mg/100 g，還縮短了時(shí)間，超聲40 min后花色苷提取量為14.04 mg/100 g，隨后增加超聲時(shí)間對(duì)提取量的變化并不明顯，超聲80 min時(shí)花色苷提取量為 15.03 mg/100 g，而且超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)促進(jìn)糖、淀粉等其他雜質(zhì)的滲出而造成溶液黏稠，增加了純化的難度，因此超聲時(shí)間以40 min為宜。

2.6 黑青稞花色苷的抗氧化性

利用反應(yīng)體系中的還原物質(zhì)可將Fe3+還原成Fe2+，從而使溶液顏色加深，因此吸光度越高，溶液中物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)。由圖6-a可見(jiàn)，隨著黑青稞花色苷、維生素C濃度的增大，吸光度也在增大，說(shuō)明還原能力也越來(lái)越強(qiáng)。黑青稞花色苷濃度與吸光度之間的相關(guān)系數(shù)為0.958，呈顯著正相關(guān)，維生素C濃度與吸光度之間的相關(guān)系數(shù)為0.982，呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明還原能力與它們的濃度之間關(guān)系密切，并且總體上黑青稞花色苷的還原能力不如維生素C。

DPPH由于自身特殊的分子結(jié)構(gòu)，在517 nm下有強(qiáng)烈吸收峰，并且它的乙醇溶液肉眼觀察下為紫色，抗氧化劑有供氫能力，可與DPPH的孤對(duì)電子配對(duì)使其原有結(jié)構(gòu)破壞，顏色變淺，吸光度降低，抗氧化性也就越強(qiáng)。通常以IC50（即清除率過(guò)半時(shí)抗氧化劑的濃度）來(lái)表示抗氧化能力，其值越小抗氧化能力越強(qiáng)。由圖6-b可見(jiàn)，隨著花色苷、維生素C濃度的增大，它們對(duì)DPPH自由基的清除能力也在逐漸增強(qiáng)。黑青稞花色苷、維生素C的濃度（x，mg/mL） 與DPPH自由基清除率（y，%） 的回歸方程分別為y=92.423x+32.793、y=87263x+22.785，r2分別為 0.964 3、0.992 9，說(shuō)明它們的線性關(guān)系良好。由此得出，花色苷、維生素C的IC50分別為0186、0.311 mg/mL，說(shuō)明黑青稞花色苷清除DPPH能力要好于維生素C，清除效果約為維生素C的2倍。

利用水楊酸與抗氧化劑相互競(jìng)爭(zhēng)溶液中羥自由基的能力，使原本水楊酸與羥自由基生成的物質(zhì)顏色變淺，因此可在510 nm下測(cè)定吸光度的變化來(lái)反映該物質(zhì)的清除能力， 通常

用IC50表示。羥自由基是對(duì)生物體危害最大的自由基，可使紅細(xì)胞失活，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物，從而引起器官、組織病變[18]。由圖6-c可知，黑青稞花色苷和維生素C都有一定的清除羥自由基能力，其清除率隨濃度增大而提高，線性關(guān)系較好。同樣得出黑青稞花色苷對(duì)羥自由基的IC50為0.268 mg/mL，維生素C對(duì)羥自由基的IC50為 0.406 mg/mL，說(shuō)明黑青稞花色苷的羥自由清除能力要好于維生素C。

由于鄰苯三酚堿性溶液在自然狀態(tài)下幾十秒后會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子，并進(jìn)一步產(chǎn)生具有顏色的中間物質(zhì)，該物質(zhì)的吸光度可隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈線性增加，當(dāng)有抗氧化劑加入時(shí)可抑制該物質(zhì)的生成而被用來(lái)測(cè)定抗氧化性，通常用IC50表示。超氧陰離子自由基不僅自身具有一定破壞性，它還會(huì)繼續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生其他氧自由基，對(duì)生物體的損壞作用進(jìn)一步加大[19]。由圖6-d可見(jiàn)，隨著花色苷、維生素C濃度的增大，它們對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，具有較好的線性關(guān)系。同樣得出黑青稞花色苷對(duì)超氧陰離子自由基的IC50為 0.293 mg/mL，維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的IC50為0.239 mg/mL，說(shuō)明維生素C對(duì)超氧陰離子的清除效果要略好于黑青稞花色苷。

3 結(jié)論

因?yàn)楸姸嗵崛l件都會(huì)對(duì)黑青稞花色苷提取量具有不同程度的影響，所以先根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)提取量影響較大的提取溫度、乙醇濃度、液料比、pH值4個(gè)因素，以提取量為響應(yīng)值，使用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件，結(jié)果為提取溫度60 ℃，液料比10.04 mL ∶ 1 g，乙醇濃度55.76%，pH值=1，在此條件下提取1 h的提取量的實(shí)測(cè)值為9.68 mg/100 g；并且各因素對(duì)黑青稞花色苷提取量影響的大小順序?yàn)閜H值>提取溫度>液料比>乙醇濃度。在此基礎(chǔ)上超聲波輔助提取40 min，提取量為14.04 mg/100 g，不僅縮短了提取時(shí)間還提高了提取量，是一種縮短提取時(shí)間的有效方法。

通過(guò)測(cè)定還原能力、清除DPPH自由基能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力發(fā)現(xiàn)，黑青稞花色苷具有一定的抗氧化活性，與維生素C相比，其清除DPPH自由基和清除羥自由基能力較強(qiáng)，但還原能力和清除超氧陰離子自由基能力沒(méi)有維生素C強(qiáng)。它對(duì)自由基的清除能力大小依次為DPPH自由基>羥自由基>超氧陰離子自由基，IC50依次為0.186、0.268、0.293 mg/mL，是一種較好的天然抗氧化劑。

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