吳蓓　彭春燕　李軍茂　何明珍　李艷　歐陽輝　馮育林　楊世林

[摘要]該研究建立UFLCQTOFMS/MS 技術結合多元統(tǒng)計分析法快速、簡便、準確鑒別不同產(chǎn)地杏香兔耳風藥材差異性的方法。采用超高速液相飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（UFLCQTOFMS/MS）對江西、云南、江蘇和河南地區(qū)等產(chǎn)地的杏香兔耳風藥材進行檢測，質(zhì)譜采用ESI源的負離子模式，利用Markerview等軟件對數(shù)據(jù)結果進行PCA和OPLSDA聚類分析及t檢驗。結果顯示在負離子模式下不同產(chǎn)地的藥材主成分得到了良好的區(qū)分，聚類結果同時體現(xiàn)了杏香兔耳風藥材在地域間的差異性和相似性，共鑒定出40種差異成分。該研究建立的鑒別杏香兔耳風藥材產(chǎn)地差異性的方法具有快速準確和簡便等優(yōu)勢，為杏香兔耳風不同產(chǎn)地的藥材質(zhì)量評價奠定了基礎。

[關鍵詞]杏香兔耳風； 化學成分； 產(chǎn)地差異； 液質(zhì)聯(lián)用； 聚類分析

[Abstract]A rapid and accurate method of UFLCQTOFMS/MS combined with multivariate statistical analysis was established for the identification of Ainsliaea fragrans from different origins in this study The A fragrans from different producing areas of Jiangxi， Yunnan， Henan and Jiangsu were determined by UFLCQTOFMS/MS in the negative ion mode And the data of the study were analyzed by the Markerview and other software for the PCA and OPLSDA cluster analysis as well as t test The results of the principal component analysis（PCA）showed that the main components from different origins were well distinguished And the results of multivariate statistical showed the differences and similarities between different producing areas Besides， 40 different compounds were identified in the negative ion mode This method for identifying A fragrans from different producing areas has the advantages of rapid accuracy and simplicity， which laid the foundation for the evaluation of the quality of the A fragrans.

[Key words]Ainsliaea fragrans； chemical compositions； different sources； UFLCMS； cluster analysis

杏香兔耳風為菊科兔耳風屬植物杏香兔耳風Ainsliaea fragrans Champ，具有清熱，消積散結，止咳，涼血，解毒的功效，臨床主要用于上呼吸道感染，肺結核咯血，黃疸，腸炎痢疾，消化不良，跌打損傷和泌尿系統(tǒng)炎癥等疾病，具有良好的效果[1]。杏香兔耳風屬于收載在《江西省中藥材標準》中的江西特色優(yōu)勢藥材[2]，以其為主要組成的杏香兔耳風片制劑和杏香兔耳風膠囊屬于國家中藥保護品種，主要用于慢性宮頸炎，盆腔炎等疾病。杏香兔耳風抗宮頸炎療效較好，且不易產(chǎn)生耐藥性，在婦科用藥市場上具有一定的市場占有率。然而，目前杏香兔耳風產(chǎn)地較多，由于生長環(huán)境不同，藥材品質(zhì)存在一定的差異，缺少整體性分析的杏香兔耳風藥材評價方法 [35]。近年來，利用PCA和OPLSDA等統(tǒng)計方法建立的植物代謝組學技術為中藥整體性分析提供可能，該技術可對不同產(chǎn)地植物進行無差別代謝成分整體分析[6]。目前，該技術已經(jīng)應用于不同產(chǎn)地的人參[7]、草麻黃根與莖[8]、人參與西洋參葉[9]等的差異性研究，該方法不僅可以反映不同樣本的相似性，而且可以確定不同樣本的差異性，為中藥質(zhì)量控制提供一種強有力的整體鑒別技術[10]，此外，UFLCQTOFMS/MS 技術具有高分辨率、高靈敏度、分析時間短等優(yōu)勢，與植物代謝技術可以有效的結合。本實驗采用基于UFLCQTOFMS/MS 技術的植物代謝組學方法對不同產(chǎn)地的杏香兔耳風藥材進行比較分析，通過發(fā)現(xiàn)差異化合物的相對含量，對不同產(chǎn)地的藥材的指標性成分的差異進行探討，為杏香兔耳風藥材的質(zhì)量評價提供新依據(jù)。

1材料

Tripie TOF 5600 Plus 高分辨質(zhì)譜儀（美國 Sciex 公司）；Analyst TF16，peakview 12 和markerview 121數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國 Sciex 公司）；LC30A 超高效液相色譜儀（日本島津公司），包括 LC30AD 高壓輸液泵，CBM20A 系統(tǒng)控制器，SIL30AC 自動進樣器，DUG20A5 在線脫氣機，CTO30A 柱溫箱；KQ250DB 型數(shù)控超聲清洗器（鞏義市予華儀器有限公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific，F(xiàn)airlawn，NJ，USA）；甲酸（色譜純，SigmaAldrich CoLtd，St Louis，MO，USA）；蒸餾水（屈臣氏集團），其他試劑為分析純。endprint

杏香兔耳風藥材自采、采購和本公司采購，見表 1，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學楊世林教授鑒定為杏香兔耳風A fragrans全草。

2方法

21供試品溶液的配制取杏香兔耳風藥材（10個產(chǎn)地）粉末（過 4 號藥篩） 10 g置于50 mL錐形瓶，加入70%乙醇30 mL，稱重，超聲提取45 min 后，放冷至室溫，用70%乙醇溶液補足失重，搖勻，冷卻取上清液，12 000 r·min-1高速離心10 min，稀釋 40 倍，022 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

22液質(zhì)條件色譜條件：色譜柱 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱；流動相01% 甲酸和 5 mmol 甲酸銨水溶液（A）乙腈（B）；梯度洗脫01 min，5% B，30 min，10% B，120 min，175% B，200 min，18% B，270 min，30% B，340 min，60% B，440 min，95% B，470 min，95% B，最后 3 min 平衡柱子。流速為 03 mL·min-1；柱溫 40 ℃；進樣量 3 μL。

質(zhì)譜條件：在負離子模式，離子源選擇電噴霧離子化源（ESI）；使用 m/z 50 ～1 250質(zhì)量掃描范圍；噴霧電壓（ISVF）-4 500 V；霧化氣溫度（TEM）500 ℃；去簇電壓（DP）-100 V；碰撞能量（CE）-35 eV，碰撞能量疊加（CES） （35±15）；氣簾氣（CUR）30 psi（1 psi=6895 kPa）；霧化器（GS1）和輔助氣（GS2）均為50 psi；數(shù)據(jù)采集時間 50 min；采用母離子觸發(fā)的子離子（TOFMSIDAMS/MS）掃描方式；多重質(zhì)量虧損（MMDF）和動態(tài)背景扣除（DBS）為觸發(fā)二級的條件，滿足該條件的優(yōu)先進行二級掃描。

23數(shù)據(jù)處理對不同產(chǎn)地杏香兔耳風藥材樣本進行 UFLCQTOFMS 分析，得到總離子流圖見圖1，觀測各個樣本的保留時間，色譜峰離子響應及其二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集情況；將各組由質(zhì)譜進行采集數(shù)據(jù)導入 markerview 121 應用軟件，處理參數(shù)設置如下：時間范圍1～48 min；質(zhì)譜范圍m/z 50～1 250；保留時間窗口02 min；質(zhì)量偏差001；最小強度1%；變化峰強度閾值100；去除少于3個樣本中出現(xiàn)的峰，最大峰數(shù)目8 000，除去同位素峰后，對數(shù)據(jù)進行分組并設定組標志，對數(shù)據(jù)進行標準化處理；采用PCA分析數(shù)據(jù)，選用Pareto 方法對數(shù)據(jù)進行縮放，得到PCADA模型的載荷圖和得分圖；再進行分組t檢驗，P<005說明差異具有統(tǒng)計學意義。進一步分析具有差異性的變量，將具有差異性的變量出入Peakview 12軟件中可以得到二級質(zhì)譜圖對特異性標記物進行鑒定分析。

3結果

31產(chǎn)地間的PCA模型在色譜條件優(yōu)化的前提下，考察 UFLCQTOFMS/MS 負離子模式（ESI-）下質(zhì)譜出峰情況和離子響應，對不同產(chǎn)地杏香兔耳風樣本進行分析，得到動態(tài)背景扣除圖譜見圖1。根據(jù)質(zhì)譜采集的不同產(chǎn)地圖譜比較，各個產(chǎn)地杏香兔耳風藥材的圖譜也存在差異性。采用markerview 121 軟件對質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)進行分析，采用PCADA方法對數(shù)據(jù)進行聚類分析，得到不同產(chǎn)地杏香兔耳風藥材的得分圖，和聚散程度，見圖2，從圖中顯示，說明本實驗所建立的PCA模型聚類良好。不同產(chǎn)地的杏香兔耳風樣品點完全分離，同一產(chǎn)地藥材樣品很好聚在同一區(qū)域。江西省產(chǎn)地較好的聚集為一類，江蘇省產(chǎn)地與河南省產(chǎn)地較好的聚集為一類，云南省產(chǎn)地聚集為一類。江西內(nèi)不同產(chǎn)地杏香兔耳風具有相似性，表明化學成分種類和含量上差異較?。唤K產(chǎn)地與河南產(chǎn)地具有相似性，表明化學成分種類和含量上差異較小；云南產(chǎn)地、江西產(chǎn)地、江蘇和河南產(chǎn)地在主成分方向具有明顯的區(qū)分，說明兩兩存在化學種類及含量上的差異。PCA模型的載荷圖能夠說明變量對于各個主成分的貢獻大小，在某一主成分方向上，距離原點越遠的變量說明對此主成分的貢獻越大[11]，從聚類分析所得到的載荷圖，見圖2，大部分化合物聚集在一起，僅有少部分化合物的離群是導致不同產(chǎn)地藥材顯著差異性的原因。

32不同產(chǎn)地杏香兔耳風差異性成分應用 markerview 121 軟件對江西產(chǎn)地與江蘇、河南和云南產(chǎn)地杏香兔耳風藥材的 UFLCQTOFMS/MS 數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，再結合載荷圖的差異值篩選，最終篩選出對分類貢獻較大的化合物，根據(jù)其實驗測到的質(zhì)荷比（m/z）、色譜峰的保留時間和離子存在的形式導入到Peakview軟件中，再根據(jù)文獻和massbank數(shù)據(jù)庫與二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)匹配對照，共鑒定出貢獻較大的化合物40個推斷結果列在表2。對其質(zhì)譜響應強度進行初步分析，一些化合物僅在不同產(chǎn)地的杏香兔耳風中以相對含量不同，也有些化合物只存在于某一產(chǎn)地而其他產(chǎn)地中含量非常低甚至觀察不到。

33杏香兔耳風差異成分的鑒定化合物5，HRESIMS 準分子離子峰m/z 445077 3[M-H]-，保留時間為1391 min，誤差為-07，Peak View 中XIC Manager 軟件推測其分子式為C21H18O11，該化合物二級質(zhì)譜中，產(chǎn)生碎片離子m/z 269045 0，225053 6，175024 3，149023 4，117019 3和113024 8，由此可以推測為芹菜素母核。該化合物失去1分子葡萄糖醛酸（中性丟失176）生成碎片

m/z 269045 0。其他碎片離子以芹菜素一致。因此推測該化合物為芹菜素7O葡萄糖醛酸苷，該化合物二級質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖3。

化合物13，HRESIMS 準分子離子峰m/z 463087 7[M-H]-，保留時間為 1031 min，誤差為-1，Peak View 中 XIC Manager 軟件推測其分子

式為C21H20O12，該化合物二級質(zhì)譜中，產(chǎn)生碎片離子m/z 343043 0，301033 9，300030 3，271023 5，255026 0，178997 5，151002 7，由此可以推測為槲皮素母核。碎片離子中m/z 301033 9 比m/z 300030 3 豐度要高，可以推斷糖基接在酚羥基上。該化合物失去1分子葡萄糖生成碎片m/z 301033 9 或 300030 3。其他碎片離子以槲皮素一致。因此推測該化合物為槲皮素素5O葡萄糖苷，該化合物二級質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖4。endprint

4討論與總結

本研究建立了基于 UFLCQTOFMS/MS 技術結合多元統(tǒng)計分析法，首次對不同產(chǎn)地杏香兔耳風藥材的差異性進行了總體評價，目前可作為發(fā)展杏香兔耳風藥材地道性及控制其質(zhì)量穩(wěn)定的一種參考

手段；從差異性成分分析結果來看，酚酸類、黃酮類和倍半萜類成分均具有一定的差異，這可能是不同產(chǎn)地藥材內(nèi)在品質(zhì)和藥效差異物質(zhì)基礎。本方法的結果表明，UFLCQTOFMS/MS 技術結合多元統(tǒng)計分析法可為杏香兔耳風藥材的產(chǎn)地差異研究提，供一種快速、簡便、準確的途徑，同時也為今后同類中藥的質(zhì)量分析和產(chǎn)地研究提供良好的借鑒。

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[責任編輯丁廣治]endprint