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        視黃醇對大腸桿菌誘發(fā)的急性乳腺炎大鼠氧化應(yīng)激的作用研究

        2017-11-17 06:23:17顧蓓蓓盧勁曄
        獸醫(yī)導刊 2017年16期
        關(guān)鍵詞:視黃醇腺泡活性氧

        顧蓓蓓 馬 卉 盧 煒 劉 靜 盧勁曄*

        (1.泰州出入境檢驗檢疫局,江蘇泰州 225300;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院,江蘇泰州 225300)

        視黃醇對大腸桿菌誘發(fā)的急性乳腺炎大鼠氧化應(yīng)激的作用研究

        顧蓓蓓1馬 卉1盧 煒2劉 靜2盧勁曄2*

        (1.泰州出入境檢驗檢疫局,江蘇泰州 225300;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院,江蘇泰州 225300)

        本文探討視黃醇對大鼠大腸桿菌乳腺炎氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用。選用72只清潔級SD大鼠,隨機分成實驗組和對照組(n=36)。懷孕后10d起,灌胃視黃醇(溶劑為大豆油)8000I.U/kg·d,連續(xù)灌注10d;對照組灌胃等體積的大豆油。產(chǎn)后72h,經(jīng)乳頭管灌注LPS 10μɡ/側(cè)到第四對乳腺內(nèi)。分別于灌注前(0h)及灌注后2、4、8、16和24h(n=6)頸靜脈放血處死大鼠后采樣。髓過氧化物酶活力檢測結(jié)果與組織病理學觀察顯示,視黃醇降低了LPS誘發(fā)炎癥過程中中性粒細胞在組織中的積聚與持續(xù)激活,有效控制了細胞損傷,并加快了組織修復;同時,視黃醇處理顯著降低LPS灌注后IL-8及外周血PMN活性氧的釋放。實驗結(jié)果表明,灌胃視黃醇對LPS誘導的實驗性乳腺炎大鼠PMN引起的氧化應(yīng)激具有一定的保護作用。

        視黃醇;中性粒細胞;活性氧;乳腺炎;大鼠

        乳腺炎是導致奶牛業(yè)經(jīng)濟損失最嚴重的疾病之一。由于乳腺炎是由多種非特異病原微生物引起的,目前尚無有效的疫苗進行防治;抗生素和糖皮質(zhì)激素雖然對乳腺炎有一定的治療作用,但是乳汁中的藥物殘留會危害人的健康[1]。盡管乳腺組織中存在多種抗菌物質(zhì),如溶菌酶、乳鐵蛋白等,嗜中性粒細胞(PMN)仍然是乳腺抵御外源病原微生物最主要的效應(yīng)細胞[2]。

        當乳腺遭受病原微生物或外源性致熱源侵襲時,PMN首先被動員,從毛細血管經(jīng)乳腺上皮細胞進入感染部位,識別和吞噬入侵病原?;罨腜MN通過釋放活性氧殺滅病原微生物,但PMN的持續(xù)過度激活,所產(chǎn)生氧化劑(次氯酸、酪氨?;龋┥蛇^量,超過局部抗氧化劑的防御反應(yīng)時,能降解蛋白多糖,減少細胞外基質(zhì)與乳腺上皮的粘附性,引起乳腺上皮細胞的死亡從而促進乳腺上皮的脫落和泌乳功能的損傷[3]。體外研究表明活化的PMN釋放的活性氧自由基對培養(yǎng)的乳腺上皮細胞具有一定的細胞毒性作用[4]。

        視黃醇是一類天然或人工合成的維生素A及其衍生物,能調(diào)節(jié)多種免疫細胞(如巨噬細胞、淋巴細胞、PMN的功能)[5]。研究表明視黃醇通過提高機體的抗氧化水平,抑制機體超氧化物的產(chǎn)生保護乳腺組織[6]。本實驗研究了灌喂一定劑量的視黃醇對LPS誘發(fā)乳腺炎癥引起的中性粒細胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用,深入闡明視黃醇對乳腺組織的保護機理。

        1 材料與方法

        108只清潔級健康SD大鼠,購自上海實驗動物中心,其中雌鼠72只,體重260~300g,均未孕;雄鼠36只,體重350~400g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,將雌鼠與雄鼠按2:1同籠飼養(yǎng),使之交配受孕。大鼠自懷孕第10d起,灌喂8000I.U/kg·d視黃醇(溶解于大豆油),對照組大鼠灌喂等量的大豆油,連續(xù)灌喂10d。大鼠產(chǎn)后72h經(jīng)乳頭管注入內(nèi)毒素10μg/側(cè)到大鼠第四對乳腺(雙側(cè))內(nèi),正常對照組注入等量滅菌的生理鹽水。分別于灌注前(定義為0h)及灌注后2、4、8、16和24h(n=6)頸靜脈放血處死動物,收集血清及肝素抗凝血500μL,采集乳腺組織,部分中性甲醛液固定,部分置于液氮后轉(zhuǎn)存于-70℃中用于后續(xù)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 乳腺組織的病理組織學觀察

        圖1 灌注大腸桿菌內(nèi)毒素后乳腺組織PMN的動態(tài)變化(H.E.200×)C、T分別為對照組與實驗組灌注LPS前0h,灌注后2、4、8、16、24h乳腺組織PMN的變化

        組織病理學觀察顯示:LPS灌注前對照組和實驗組腺泡結(jié)構(gòu)均清晰可見,腺泡腔內(nèi)乳汁充盈(腺泡內(nèi)均勻分布的紅色區(qū)域為著色乳汁);灌注LPS后,對照組第4h起腺泡中開始出現(xiàn)較多的PMN,同時,組織損傷開始出現(xiàn),乳汁分泌量明顯減少;組織病理變化第8h最為嚴重,此時腺泡腔內(nèi)充滿PMN,致使腺泡結(jié)構(gòu)模糊難辨;第24h結(jié)果顯示乳腺組織損傷有所修復。與對照組相比,視黃醇處理加快了PMN向腺泡內(nèi)遷徙及炎癥反應(yīng)的進程,降低了組織損傷的程度;實驗組病理變化最嚴重的時間點同樣出現(xiàn)在LPS灌注后第8h,但病變程度要明顯輕于對照組;實驗組在第16 h腺泡內(nèi)的PMN數(shù)量已經(jīng)明顯減少,乳腺的泌乳功能也有所恢復。

        2.2 灌注LPS后乳腺組織與血清中MPO的活性變化

        圖2 灌注LPS后大鼠乳腺組織和血清中MPO活性的變化

        乳腺組織中(圖2 A)實驗組和對照組MPO活性均先上升后下降。對照組灌注LPS后,MPO活性迅速上升,最高峰值出現(xiàn)在第8h(P<0.01),第16h該酶的活力仍顯著高于0h(P <0.05);實驗組在第8h達到峰值(P <0.05)后迅速下降,第16h已恢復至正常水平;血清中(圖2B)的變化規(guī)律與組織中相反,MPO活性無論是實驗組還是對照組同0h相比均先降后升,最低點同樣出現(xiàn)在LPS灌注后的第8h,到24h有所恢復。

        2.3 灌注LPS后乳腺組織與血清中IL-8的活性變化

        圖3 灌注LPS后大鼠乳腺組織和血清中IL-8的變化

        如圖3所示,與0h相比,LPS灌注后第8 h對照組乳腺組織中IL-8含量極顯著升高8h乳腺組織中IL-8的活性(P <0.01),而實驗組在各個時間點均無顯著變化。與相應(yīng)的0h相比,對照組第8h(P <0.01),實驗組第4h(P <0.05)、8h(P <0.01)血清中IL-8含量顯著升高;與對照組相比視黃醇處理的實驗組顯著下調(diào)第8hIL-8的含量(P <0.05)。

        2.4 外周血中性粒細胞活性氧釋放的動態(tài)變化

        圖4 LPS灌注后外周血中性粒細胞活性氧釋放的動態(tài)變化

        實驗結(jié)果顯示(圖5),LPS灌注乳腺組織后,對照組和實驗組各個時間點外周血PMN活性氧釋放均顯著升高;實驗組與對照組相比,LPS灌注后第16h外周血PMN活性氧的釋放極顯著降低(P <0.01)。

        3 討論

        乳腺炎包括乳腺感染、乳腺炎癥、微循環(huán)和免疫障礙等的綜合癥,是制約奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。大量循環(huán)血液中的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺組織遷徙,是乳腺炎發(fā)生時的重要特征[7]。在本研究中,病理切片結(jié)果顯示,實驗組與對照組在灌注LPS前乳腺腺泡結(jié)構(gòu)清晰,腺泡腔內(nèi)乳汁充盈,灌注LPS后2h腺泡腔內(nèi)開始出現(xiàn)PMN并在第8h達到浸潤高峰,乳腺組織損傷嚴重,此后PMN浸潤程度減輕,第24h基本恢復至正常水平。MPO是PMN的標志酶,組織中MPO活性的高低反映了PMN在組織中的潴留和活化程度[8],與病理切片結(jié)果一致,灌注LPS后,乳腺組織中MPO活性升高,同樣在第8h達到峰值,血清中的變化趨勢則與組織中相反,先降低而后升高,灌注后第8hMPO活性最低,動態(tài)反映了循環(huán)血液中PMN向乳腺組織遷徙的過程。

        吞噬細胞,主要是嗜中性粒細胞是機體抵抗感染的主要非特異性防御細胞,任何PMN功能的障礙均會影響乳用家畜的生產(chǎn)性能[2]。PMN吞噬病原微生物主要是通過釋放活性氧自由基(ROS)實現(xiàn)的,但是ROS的產(chǎn)生在殺滅病原微生物的同時,對宿主細胞和吞噬細胞本身也會造成損傷[3]。本研究中,LPS灌注后各個時間點,ROS釋放均顯著升高,視黃醇處理極顯著的下調(diào)了LPS灌注后第16h ROS的釋放。該結(jié)果與先前的報道(第一章)視黃醇能提高機體的抗氧化能力一致,這可能是視黃醇保護乳腺組織的重要機制之一。

        LPS是重要的免疫細胞激活劑,通過激活NFκB/AP-1刺激單核、巨噬細胞產(chǎn)生多種細胞因子[9]。白細胞介素(IL)-8是炎癥發(fā)生時一種重要的趨化因子,對PMN有激活作用,可以誘導其變形、趨化、脫顆粒、合成生物活性脂類、整合素上調(diào)以及呼吸爆發(fā)等。研究表明視黃醇可以抑制NFκB/AP-1活性從而下調(diào)相關(guān)炎癥因子的基因表達。在本研究中,LPS灌注后對照組血清中IL-8顯著升高并在第8 h達到峰值,視黃醇處理則顯著降低了該時間點IL-8釋放,表明視黃醇通過下調(diào)IL-8水平降低PMN活性氧的釋放,從而保護乳腺組織。

        4 小結(jié)

        PMN是乳腺發(fā)生感染時的主要效應(yīng)細胞,PMN通過釋放大量高毒性的活性氧在消滅病原微生物的同時亦會引起乳腺組織的損傷。孕鼠灌胃視黃醇促進PMN迅速遷徙、粘附,發(fā)揮吞噬活性,同時視黃醇抑制PMN持續(xù)激活,降低活性氧的過度釋放,減輕PMN對乳腺組織的損傷。

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        江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院科研課題(編號:NSF201609);江蘇省現(xiàn)代畜牧與新獸藥工程技術(shù)中心開放課題(編號:TGC2XKF1402);江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項目(PPZY2015C230)。

        顧蓓蓓(1983—),江蘇興化人,博士,研究方向:乳腺炎的營養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)機制研究。

        盧勁曄(1983—),江蘇邗江人,博士。

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