字如燕

（蘭坪縣兔峨鄉(xiāng)人民政府農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南怒江 671407）

轉(zhuǎn)賴氨酸基因鼠奶對哺乳期小鼠生長成績的影響

字如燕

（蘭坪縣兔峨鄉(xiāng)人民政府農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南怒江 671407）

為確定賴氨酸轉(zhuǎn)基因奶對哺乳期小鼠的生長成績的作用，本研究選取92只轉(zhuǎn)基因后代，經(jīng)PCR檢測，其中陽性轉(zhuǎn)基因小鼠為56只，剩余的為同窩陰性小鼠，并取25只野生型小鼠為對照，進行后代體重測定。結(jié)果表明：飲用賴氨酸鼠奶小鼠生長明顯快于野生型對照組（P<0.05），說明賴氨酸鼠奶對哺乳期小鼠生長具有進作用。同時，來源促于同窩的轉(zhuǎn)基因非轉(zhuǎn)基因小鼠之間沒有觀察的明顯差異，說明導(dǎo)致小鼠體重增長差異的主要因素是飲用高賴氨酸奶，而不是轉(zhuǎn)基因本身。

轉(zhuǎn)賴氨酸基因鼠；PCR檢測；體重

1 前言

1.1 賴氨酸重要性

對于動物體來說，蛋白質(zhì)是一種必需的營養(yǎng)物質(zhì)，它不僅是維持和合成體蛋白的原料，同時還可以增強仔畜免疫力，提高成活率。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，蛋白質(zhì)營養(yǎng)的本質(zhì)是氨基酸營養(yǎng)，并且主要是限制性氨基酸營養(yǎng)。限制性氨基酸是指動物需要量大且一般日糧容易缺乏的氨基酸，根據(jù)其相對缺乏的程度，又可分為不同序列的限制性氨基酸。一般認(rèn)為，賴氨酸是玉米-豆粕型日糧的第一限制性氨基酸，賴氨酸是影響機體代謝、生產(chǎn)性能和飼料成本的核心因素之一，其需要量是建立理想蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。因此，賴氨酸的營養(yǎng)一直是較為活躍的研究領(lǐng)域。

1.2 賴氨酸對生長成績的促進作用

賴氨酸是一種α-氨基酸。它的化學(xué)式表示為：HO2CCH（NH2）（CH2）4NH2，是人體必需氨基酸之一，就像精氨酸和組氨酸一樣，賴氨酸屬于堿性氨基酸，能促進人體發(fā)育、增強免疫功能，并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用。由于谷物食品中的賴氨酸含量甚低，且在加工過程中易被破壞而缺乏，故稱為第一限制性氨基酸。必需氨基酸是指人體需要，但自身不能合成或合成速度不能滿足身體需要，必須從食物中獲得的氨基酸。在必需氨基酸中，賴氨酸是最受關(guān)注的，因為它是谷物的第一限制性氨基酸，而谷物是人和動物的主要食物。

1.3 研究的目的與意義

為了對轉(zhuǎn)賴氨酸基因鼠奶功能進行初步測定，我們以引用非轉(zhuǎn)基因鼠奶小鼠為對照，來分析轉(zhuǎn)賴氨基因鼠奶對哺乳期小鼠生長成績的促進作用。

2 材料方法

2.1 實驗動物

昆明白（KM）小鼠購自長春市高新實驗動物中心；ICR小鼠購自吉林大學(xué)實驗室動物中心。小鼠均飼養(yǎng)于光控條件（14h光照/10h黑夜）。

2.2 實驗方法

2.2.1 體重測定

本實驗共選取共92只轉(zhuǎn)基因后代和25只野生型小鼠后代進行體重測定。轉(zhuǎn)基因母鼠為8～10周齡，體重24～26 g，均為第一泌乳期。為保證實驗的同源性，分別于小鼠出生后第3d調(diào)整每窩小鼠數(shù)量至8～10只，并進行轉(zhuǎn)基因鑒定，調(diào)整公母比例接近1：1。每窩小鼠每天上午9點都進行體重測定，直至泌乳期第22d。

2.2.2 小鼠尾部組織基因組DNA的提取

利用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根），對轉(zhuǎn)賴氨酸基因小鼠基因組進行提取。

（1）剪鼠尾加入 300μl 的緩沖液 ACL，加入 20μl 的蛋白酶 K 溶液（100mg/ml），混勻，水浴鍋中55℃消化1～3h。

（2）加入緩沖液AB 300μl，混勻，靜置5min，10000轉(zhuǎn)離心3min。

（3）將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心30s，并棄去廢液。

（4）向吸附柱中加入漂洗液WB 500μl，（實驗前加入無水乙醇），室溫 12000rpm 離心 30s，棄廢液。重復(fù)此步驟一次。

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠尾部組織基因組DNA提取

本研究分別提取轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因小鼠后代尾部基因組DNA，結(jié)果如圖所示（圖1），基因組各項指標(biāo)均達到要求，可以用于后續(xù)實驗。

圖1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因組提取結(jié)果。

3.2 轉(zhuǎn)基因小鼠PCR篩選

利用特異性引物擴增高賴氨酸基因LR、乳蛋白啟動子、NEO基因及內(nèi)參基因β-actin，內(nèi)參基因β-actin在轉(zhuǎn)基因陽性小鼠和野生型小鼠均有條帶擴增，說明PCR體系合理模板質(zhì)量良好，高賴氨酸基因LR、乳蛋白啟動、NEO基因，有轉(zhuǎn)基因陽性小鼠有擴增條帶，野生型無擴增條帶，檢測與預(yù)期結(jié)果一致，部分轉(zhuǎn)基因小鼠擴增。

4 討論

轉(zhuǎn)基因動物檢測一直都較為困難。因此，建立一套精準(zhǔn)、方便、快捷、經(jīng)濟易行的轉(zhuǎn)基因動物檢測技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。本研究分別設(shè)計內(nèi)參基因β-actin、外源基因Neo及高賴氨酸基因設(shè)計特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，以建立轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測方法，以便于準(zhǔn)確快速的檢測轉(zhuǎn)基因后代。

[1]王和民.賴氨酸和精氨酸的營養(yǎng)需要特點[J].廣東飼料，1998，（4）：12-13.