趙承彥(河南省腫瘤研究院，河南 鄭州 450008)

遵循藥理學(xué)原理的細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法探討

趙承彥
(河南省腫瘤研究院，河南 鄭州 450008)

細(xì)胞毒檢驗(yàn)是了解和評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能狀態(tài)的重要方法，歷來(lái)受免疫學(xué)家重視。51Cr釋放法是上世紀(jì)60年代建立的細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)方法，隨后又建立了多種檢驗(yàn)方法，包括熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)方法，統(tǒng)稱(chēng)為傳統(tǒng)細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法(TCA)。TCA方法用殺傷率表示細(xì)胞毒活力是概念應(yīng)用錯(cuò)誤，以效靶細(xì)胞比為條件檢測(cè)的殺傷率是實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)用錯(cuò)誤，違背藥理學(xué)原理，不反映細(xì)胞毒活力，沒(méi)有實(shí)用性。本文通過(guò)對(duì)TCA錯(cuò)誤理念和方法條件的探討分析，遵循藥理學(xué)原理建立了一個(gè)比較實(shí)用的細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)方法。新方法以極限稀釋分析方法為基礎(chǔ)，以效應(yīng)細(xì)胞密度為自變量，用效應(yīng)細(xì)胞含有的細(xì)胞毒活性細(xì)胞頻率(CCF)和100%殺傷率限定的效應(yīng)細(xì)胞密度(ID100)做細(xì)胞毒活力指標(biāo)，通過(guò)量-效曲線(xiàn)和條件標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定CCF和ID100；不標(biāo)記細(xì)胞，用全或無(wú)計(jì)數(shù)方法定量靶細(xì)胞；而且可以預(yù)置實(shí)驗(yàn)誤差和可信度。新方法用K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上檢測(cè)細(xì)胞毒活力，健康人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的ID100為6.8×104/孔左右；CIK細(xì)胞ID100≤4.0×104/孔；人紅細(xì)胞的克隆抑制率為0；同一個(gè)細(xì)胞樣品，用紅細(xì)胞裂解液處理，克隆抑制率隨處理強(qiáng)度成比例變化；樣本批間檢測(cè)結(jié)果變異不大，表明該方法能真實(shí)反映細(xì)胞毒活力。

細(xì)胞毒性；細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)；細(xì)胞克?。粯O限稀釋分析方法；劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)

現(xiàn)代免疫學(xué)闡明，免疫是機(jī)體識(shí)別和排除抗原性異物的反應(yīng)。免疫反應(yīng)機(jī)制和反應(yīng)過(guò)程非常復(fù)雜，有各種各樣的免疫細(xì)胞和免疫因子參與，協(xié)同作用，共同完成。免疫殺傷是免疫細(xì)胞和免疫因子引起感染、變異和癌變細(xì)胞死亡的反應(yīng)形式，是免疫功能的集中體現(xiàn)。免疫殺傷既有免疫細(xì)胞的作用，也有免疫因子的作用，起殺傷作用的免疫細(xì)胞和免疫因子稱(chēng)為效應(yīng)細(xì)胞和效應(yīng)因子，被殺傷的變異細(xì)胞稱(chēng)為靶細(xì)胞。細(xì)胞毒性是指效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的作用，單純免疫因子的作用屬于藥物毒性。細(xì)胞毒活力是指效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力，是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。

細(xì)胞毒檢驗(yàn)是分析和評(píng)價(jià)機(jī)體免疫反應(yīng)能力的基本方法。細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法歷來(lái)為免疫學(xué)界所重視，半個(gè)多世紀(jì)來(lái)相繼建立了10多種細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)方法。51Cr釋放法[1-2]是較早建立的一種方法，該方法涉及輻射防護(hù)、污物處理和昂貴的檢測(cè)儀器，不易普及應(yīng)用。隨后建立了時(shí)間分辨鑭系元素標(biāo)記法[3]，各種酶釋放法[4-6]，生物發(fā)光法[7-8]，熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)方法等[9-11]，后續(xù)方法遵循同樣的方法原理和實(shí)驗(yàn)條件，只是定量靶細(xì)胞方法不同，統(tǒng)稱(chēng)為傳統(tǒng)細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法(traditional cytotoxicity assay，TCA)。

51Cr釋放法為世界各國(guó)所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)室接受，已經(jīng)應(yīng)用了半個(gè)多世紀(jì)，甚至有人將其奉為細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)方法金標(biāo)準(zhǔn)。作者于上世紀(jì)90年代初從事細(xì)胞免疫學(xué)研究，選擇應(yīng)用以51Cr釋放法為代表的多種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞毒活力，均未獲得過(guò)滿(mǎn)意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，主要表現(xiàn)是用同一個(gè)方法檢測(cè)同一個(gè)樣品，不同實(shí)驗(yàn)室甚至同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同一個(gè)人，不同批次之間實(shí)驗(yàn)結(jié)果不相同。后來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法考核發(fā)現(xiàn)，TCA的問(wèn)題主要是方法原理違背細(xì)胞毒反應(yīng)規(guī)律，用效靶比作變量是實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)用錯(cuò)誤，用殺傷率做細(xì)胞毒活力指標(biāo)是概念應(yīng)用錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不反映效應(yīng)細(xì)胞性能。

1 傳統(tǒng)細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法存在原則性錯(cuò)誤

1.1TCA違背細(xì)胞毒反應(yīng)規(guī)律免疫細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞相當(dāng)于藥物毒性殺傷靶細(xì)胞，細(xì)胞毒性作用本質(zhì)上與藥物毒性作用相似。藥理學(xué)研究表明：藥物毒性反應(yīng)，效應(yīng)是劑量的函數(shù)。如果用效應(yīng)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，劑量(濃度)為橫坐標(biāo)作圖，呈二維雙曲線(xiàn)，將劑量改用對(duì)數(shù)值作圖，呈S型曲線(xiàn)，稱(chēng)為量效曲線(xiàn)(圖1)。S型曲線(xiàn)表示，藥物劑量很低時(shí)不產(chǎn)生效應(yīng)，達(dá)到閾值劑量以后效應(yīng)隨著劑量增大而增強(qiáng)，在線(xiàn)性區(qū)效應(yīng)隨劑量增加很快，接近飽和劑量時(shí)，效應(yīng)隨劑量變化減慢。藥物毒性一般用劑量參數(shù)半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)和LD90作為指標(biāo)[12-16]，通過(guò)測(cè)定量效曲線(xiàn)獲得。

圖1 量效曲線(xiàn)模式圖

細(xì)胞毒性反應(yīng)規(guī)律與藥物毒性反應(yīng)規(guī)律一樣，細(xì)胞毒效應(yīng)是細(xì)胞劑量的函數(shù)，即殺傷率(killing rate,KR)是細(xì)胞密度的函數(shù)。細(xì)胞密度很低時(shí)，效靶細(xì)胞接觸機(jī)會(huì)很小，殺傷率很低；隨著細(xì)胞密度增高，效靶細(xì)胞接觸機(jī)會(huì)增多，殺傷率增高；達(dá)到飽和密度時(shí)，由于非活性細(xì)胞的阻礙作用，效靶細(xì)胞接觸機(jī)會(huì)不再增大，殺傷率也不再升高。TCA以效靶細(xì)胞比為變量檢測(cè)KR，效靶細(xì)胞比不是細(xì)胞密度，KR不體現(xiàn)量效關(guān)系，也不是劑量參數(shù)，不反映細(xì)胞毒活力。TCA沒(méi)有遵循藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)原理，違背細(xì)胞毒性反應(yīng)規(guī)律。

1.2用殺傷率表示細(xì)胞毒活力是概念應(yīng)用錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)TCA的問(wèn)題，需要先明確細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞毒性反應(yīng)原理。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖嵌糠治鲂?yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力，了解機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。細(xì)胞毒性反應(yīng)是指免疫活性細(xì)胞殺傷或吞噬病原體的作用過(guò)程。免疫活性細(xì)胞有很多種類(lèi)型，統(tǒng)稱(chēng)為效應(yīng)細(xì)胞。病原體包括體內(nèi)變異的突變和癌變細(xì)胞，侵入體內(nèi)的病原微生物等，統(tǒng)稱(chēng)為靶細(xì)胞。細(xì)胞毒性不是所有效應(yīng)細(xì)胞能夠殺傷所有靶細(xì)胞，具有選擇適應(yīng)性，即一種效應(yīng)細(xì)胞可以殺傷某幾種靶細(xì)胞，或幾種效應(yīng)細(xì)胞可以作用于某一種靶細(xì)胞。細(xì)胞毒反應(yīng)發(fā)生的條件：一是效應(yīng)細(xì)胞中含有殺傷活性的免疫細(xì)胞，二是效靶細(xì)胞有接觸的機(jī)會(huì)。

殺傷率是TCA體外實(shí)驗(yàn)測(cè)得的靶細(xì)胞被殺傷的比率。殺傷率的大小決定于：1)效應(yīng)細(xì)胞中含有的免疫活性細(xì)胞頻率(cytotoxic cells frequency,CCF)；2)效靶細(xì)胞接觸機(jī)會(huì)。CCF是細(xì)胞樣本具有的屬性，不隨實(shí)驗(yàn)條件而變。效靶細(xì)胞接觸機(jī)會(huì)決定于細(xì)胞密度。TCA檢測(cè)殺傷率不是以細(xì)胞密度為自變量，而是以效靶細(xì)胞比為實(shí)驗(yàn)條件。效靶細(xì)胞比與細(xì)胞密度無(wú)關(guān)，同樣的效靶細(xì)胞比，細(xì)胞密度可以不同。維持效靶細(xì)胞比不變，可以做成許多個(gè)細(xì)胞密度，測(cè)出許多個(gè)殺傷率。同一個(gè)細(xì)胞樣本用同一個(gè)效靶比測(cè)出許多個(gè)殺傷率，而一個(gè)殺傷率反映細(xì)胞樣本細(xì)胞毒活力是不能明確的。這也是同一個(gè)細(xì)胞樣本各個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同實(shí)驗(yàn)者，不同批次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果都不相同的原因所在。殺傷率決定于實(shí)驗(yàn)條件，隨實(shí)驗(yàn)條件而變，而一個(gè)細(xì)胞樣本的細(xì)胞毒活力只有一個(gè)，不應(yīng)該隨實(shí)驗(yàn)條件變化，所以殺傷率不反映細(xì)胞毒活力。

再者，機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞密度與體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度不是一個(gè)概念，體液內(nèi)的細(xì)胞隨血液循環(huán)呈立體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒反應(yīng)發(fā)生在平面上，細(xì)胞呈靜止?fàn)顟B(tài)，兩者沒(méi)有相關(guān)性和可比性。即使TCA以細(xì)胞密度為變量測(cè)定殺傷率，因?yàn)轶w外無(wú)法建造與體內(nèi)完全相同的細(xì)胞密度，測(cè)得的殺傷率也不反映機(jī)體細(xì)胞免疫殺傷活力。

1.3以效靶細(xì)胞比為條件檢測(cè)殺傷率是實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)用錯(cuò)誤效靶細(xì)胞比不影響殺傷率，TCA方法以效靶細(xì)胞比為自變量測(cè)定殺傷率，顯然認(rèn)為殺傷率與效靶比有關(guān)，效靶比高殺傷率大。這種認(rèn)識(shí)是不對(duì)的。TCA方法細(xì)胞毒性反應(yīng)發(fā)生在平面上，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞在平面上均勻分布，彼此之間相對(duì)靜止。效應(yīng)細(xì)胞中有活性細(xì)胞，也有非活性細(xì)胞，只有活性細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸才能發(fā)生殺傷反應(yīng)。一般是效應(yīng)細(xì)胞多靶細(xì)胞少。殺傷反應(yīng)，細(xì)胞之間(效-效、靶-靶)沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)，即一個(gè)效應(yīng)細(xì)胞殺傷一個(gè)靶細(xì)胞，與其他效應(yīng)細(xì)胞或靶細(xì)胞的存在沒(méi)有關(guān)系。細(xì)胞密度大，細(xì)胞之間距離小，效靶細(xì)胞接觸機(jī)會(huì)多，靶細(xì)胞被殺傷的風(fēng)險(xiǎn)大。即使一個(gè)靶細(xì)胞同時(shí)與一個(gè)或幾個(gè)效應(yīng)細(xì)胞接觸，由于非活性細(xì)胞總是多于活性細(xì)胞，總有靶細(xì)胞不被殺傷。在細(xì)胞密度一定的條件下，效靶比低，相對(duì)靶細(xì)胞少，被殺傷的靶細(xì)胞也少，而沒(méi)有被殺傷的也少；效靶比高，相對(duì)靶細(xì)胞多，被殺傷的靶細(xì)胞也多，而沒(méi)有被殺傷的也多，殺傷比率不變。因此殺傷率決定于細(xì)胞密度，與效靶細(xì)胞比無(wú)關(guān)。

1.4細(xì)胞免疫殺傷活力的指標(biāo)應(yīng)該是效應(yīng)細(xì)胞中活性細(xì)胞頻率細(xì)胞毒活力是指效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒反應(yīng)的能力，能力大小決定于效應(yīng)細(xì)胞中對(duì)靶細(xì)胞敏感、能殺傷靶細(xì)胞的CCF。CCF具有樣本屬性，與免疫細(xì)胞殺傷活力直接相關(guān)，不同個(gè)體的CCF各不相同，決定細(xì)胞毒活力不同。健康人群CCF維持一個(gè)正常值水平，CCF水平低的個(gè)體免疫細(xì)胞殺傷活力會(huì)低。而且CCF在體內(nèi)狀態(tài)與在體外實(shí)驗(yàn)條件下一樣，不會(huì)隨實(shí)驗(yàn)操作而改變。因此，CCF是理想的細(xì)胞毒活力指標(biāo)。根據(jù)藥理學(xué)原理創(chuàng)建的細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法，可以檢測(cè)CCF。

1.5消除TCA錯(cuò)誤理念的影響，建立實(shí)用的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)方法TCA因?yàn)椴环从痴鎸?shí)的細(xì)胞毒活力，所以至今沒(méi)有成為臨床檢驗(yàn)方法。TCA的問(wèn)題還沒(méi)有被認(rèn)識(shí)，TCA現(xiàn)在還在應(yīng)用，還在繼續(xù)影響細(xì)胞免疫學(xué)的研究和應(yīng)用。這種狀況應(yīng)該盡快改變。通過(guò)對(duì)TCA方法的認(rèn)識(shí)和檢討再分析，我們建立了一個(gè)符合藥理學(xué)原理的細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法，叫做極限稀釋細(xì)胞克隆抑制試驗(yàn)(limiting dilution clone inhibition assay,LDCIA)[17]。LDCIA以效應(yīng)細(xì)胞密度為變量檢測(cè)殺傷率，通過(guò)量-效曲線(xiàn)確定100%克隆抑制率對(duì)應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞密度 (density of 100% inhibited,ID100)。ID100具有樣本屬性。健康人群的ID100有一個(gè)正常值，對(duì)應(yīng)一個(gè)CCF值。只要測(cè)定樣本的ID100，通過(guò)與ID100正常值比較，就可以確定樣本的CCF。LDCIA根據(jù)極限稀釋分析方法(limiting dilution assay,LDA)[17-19]原理，用全或無(wú)計(jì)數(shù)方法定量靶細(xì)胞變化，不用標(biāo)記細(xì)胞，實(shí)際應(yīng)用證明是一個(gè)科學(xué)、實(shí)用的細(xì)胞毒活力實(shí)驗(yàn)方法。

2 遵循藥理學(xué)原理的細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法

2.1LDCIA的基本原理

2.1.1 LDCIA實(shí)驗(yàn)體系近似于體內(nèi)環(huán)境條件 LDCIA是將靶細(xì)胞做極限稀釋?zhuān)鶆蚍峙渲量寺挝粌?nèi)，平均1個(gè)單位內(nèi)1個(gè)靶細(xì)胞；效應(yīng)細(xì)胞按密度大小分成劑量組k，依次加入克隆單位內(nèi)，每一個(gè)劑量組選定一個(gè)克隆單位數(shù)(n)。實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)只有培養(yǎng)基、效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞。不對(duì)細(xì)胞作標(biāo)記修飾。如果效應(yīng)細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性，培養(yǎng)3～5 d后靶細(xì)胞會(huì)生成克隆，如果效應(yīng)細(xì)胞有細(xì)胞毒性，死傷的靶細(xì)胞不會(huì)生成克隆。病態(tài)靶細(xì)胞也不會(huì)生成克隆，能生成克隆都是有增殖能力的靶細(xì)胞，不存在假陽(yáng)性和假性殺傷；選用的培養(yǎng)基不使靶細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰亡，也不產(chǎn)生假陰性。

2.1.2 LDCIA用全或無(wú)計(jì)數(shù)方法定量靶細(xì)胞變化 靶細(xì)胞計(jì)數(shù)方法是細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法的核心技術(shù)。LDCIA成功地解決了靶細(xì)胞計(jì)數(shù)問(wèn)題：1)克隆培養(yǎng)的靶細(xì)胞，如果未被殺傷，經(jīng)過(guò)5 d左右增殖會(huì)形成10多個(gè)克隆細(xì)胞，在檢測(cè)單位內(nèi)容易識(shí)別(圖2)；2)極限稀釋可以使克隆單位內(nèi)平均1個(gè)靶細(xì)胞，但不會(huì)每個(gè)單位內(nèi)都是1個(gè)靶細(xì)胞，有的可能是0、2、3、… x細(xì)胞。概率論證明這種不均勻分布是有規(guī)律的，分配到0、2、3、… x細(xì)胞的單位數(shù)的概率是一定的，服從Poisson分布，可以用Poisson分布函數(shù)處理。見(jiàn)公式1：

圖2 LD細(xì)胞陰性克隆與陽(yáng)性克隆表現(xiàn)

A、B對(duì)照組K562在FBM里生成的陽(yáng)性克隆，B有紅細(xì)胞；C細(xì)胞病理性死亡形態(tài)；D細(xì)胞衰亡形態(tài)；E、F是殺傷實(shí)驗(yàn)組陰性克隆形態(tài)，靶細(xì)胞被化解，周?chē)^多紅細(xì)胞被推開(kāi)形成一片空斑；G陽(yáng)性克隆形態(tài)，克隆的靶細(xì)胞周?chē)^多紅細(xì)胞；H效應(yīng)細(xì)胞形成的簇

2)公式1是Poisson概率分布函數(shù)(x=0)的一種特殊形式，表示陰性克隆單位概率對(duì)數(shù)的負(fù)值等于單位內(nèi)靶細(xì)胞均數(shù)(μ)。根據(jù)這一屬性，實(shí)驗(yàn)只需計(jì)數(shù)克隆陰性單位數(shù)(r0)，由克隆陰性單位概率可以獲得靶細(xì)胞均數(shù)(μ)。陽(yáng)性克隆比較復(fù)雜，單位內(nèi)的陽(yáng)性克隆會(huì)有1、2、3、…x細(xì)胞多種情況，克隆陽(yáng)性單位只用作鑒別陰性單位，而不管單位內(nèi)是幾個(gè)克隆，多少個(gè)細(xì)胞。于是LDA將靶細(xì)胞計(jì)數(shù)變成了全或無(wú)克隆單位計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確。

2.1.3 通過(guò)量-效曲線(xiàn)測(cè)定具有樣本屬性的細(xì)胞毒活力指標(biāo) 效/靶細(xì)胞在檢驗(yàn)單位里隨機(jī)相遇發(fā)生反應(yīng)，檢測(cè)單位內(nèi)的靶細(xì)胞均數(shù)μ決定于Poisson分布和細(xì)胞毒作用兩方面因素。各實(shí)驗(yàn)組加入的靶細(xì)胞都一樣，如果細(xì)胞毒活力為0，檢測(cè)出來(lái)的μi與空白對(duì)照組的μ0相同；如果有細(xì)胞毒作用，μi值會(huì)隨著效應(yīng)細(xì)胞密度(EDi)增加而減少。這與藥物作用于細(xì)胞發(fā)生的藥理效應(yīng)類(lèi)似[18]，量效關(guān)系，即μi和Di(EDi簡(jiǎn)化用Di表示)的關(guān)系為S型曲線(xiàn)，一定劑量范圍區(qū)間對(duì)應(yīng)S型曲線(xiàn)的一部分(圖3)。μi和Di的關(guān)系可用公式3表示：μi=e-bDi(公式3)，兩邊取對(duì)數(shù)，lnμi=a-bDi(公式4)

圖3 μ0與靶細(xì)胞的關(guān)系

其中1)b是斜率，因CCF不同而異。a是截距，與靶細(xì)胞有關(guān)，對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理，使a=1可以消除靶細(xì)胞差異的影響(第3節(jié)詳細(xì)論述)；2)Di是實(shí)驗(yàn)預(yù)置值，μi是根據(jù)公式1計(jì)算得到的，帶入公式4求得常數(shù)項(xiàng)a和b，得到實(shí)際回歸方程。根據(jù)回歸方程，選定Di和μi中任意一個(gè)即可求得另一個(gè)，用于確定細(xì)胞毒活力指標(biāo)。

2.1.4 LDCIA能夠通過(guò)設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件控制實(shí)驗(yàn)誤差和可信度 LDCIA是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度和實(shí)驗(yàn)誤差與樣本數(shù)有關(guān)。公式2表明，靶細(xì)胞均數(shù)μ的誤差決定于μ0，r0和n，根據(jù)Sμ和n應(yīng)用方差分析可以計(jì)算出μi的可信度；反過(guò)來(lái)，確定了置信限和誤差也可以計(jì)算出樣本數(shù)n。靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞稀釋極限值(μ0和Di)與克隆單位數(shù)n可以選定。極限稀釋分析方法原理限定μ0≌1；公式1要求r0必須>1，優(yōu)選值≥10。如果選定克隆單位數(shù)n，Sμ和置信限也就確定。表1是以滿(mǎn)足95%置信限概率P(n’,0.95)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算確定的μ0,n與r0之間的匹配值。應(yīng)用表1根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的r0和置信限，可以選定μ0和n值。表中數(shù)值表明：1)理想的實(shí)驗(yàn)條件要求置信限P(n’,0.05)≥95%，r0≥10，至少需要n>36；2)如果希望n在100以?xún)?nèi)， μ0值應(yīng)小于2.0；3)如果選擇μ0=3，需要n>180。LDCIA根據(jù)表1選定μ0和n，實(shí)驗(yàn)獲得的μi可信度>95%。

2.1.5 細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)指標(biāo)

2.1.5.2 細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)指標(biāo) 本實(shí)驗(yàn)室用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板做載體，用K562細(xì)胞作靶細(xì)胞，健康人PBMC做效應(yīng)細(xì)胞，以靶細(xì)胞μ0=1,效應(yīng)細(xì)胞密度(Di)在(1～4)×104/孔范圍內(nèi)，作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)體系，通過(guò)克隆抑制率曲線(xiàn)檢測(cè)了26例樣本的細(xì)胞毒活力。以D=6.8×104/孔為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算CIR，有50%的檢測(cè)樣本CIR-=100%，均值97%，值域90%～100%；如果以CIR-=100%標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算對(duì)應(yīng)的Di，均值6.8×104/孔，值域(4.5～11.8)×104/孔。這一實(shí)驗(yàn)表明，不同樣本含有的CCF不同，達(dá)到CIR-=100%的細(xì)胞密度不同，CIR-=100%對(duì)應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞密度稱(chēng)為ID100。同樣，不同樣本，以相同的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞密度D=6.8×104/孔為條件，檢測(cè)的克隆抑制率各不相同。標(biāo)準(zhǔn)條件下的CIR值稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)克隆抑制率，為了直觀，用CIR6.8表示。ID100和CIR6.8是在低密度條件下由克隆抑制率曲線(xiàn)測(cè)定，不能直接以D=6.8×104/孔為條件測(cè)定。ID100和CIR6.8是由特定條件界定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，界定條件根據(jù)效應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型與屬性確定。CIR6.8適用于以K562細(xì)胞作靶細(xì)胞，健康人PBMC樣本。

表1 極限稀釋法中n與μ0、r0、P(n’0.95)(%)的匹配關(guān)系表

注：P0.5(0)為μ0=0.5時(shí)克隆陰性單位概率，其余類(lèi)同。P(%)為置信限概率。

2.2極限稀釋細(xì)胞克隆抑制實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 儀器設(shè)備和試劑 LDCIA實(shí)驗(yàn)需要標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，主要配置為凈化工作臺(tái)、倒置顯微鏡、離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)板、消毒器具等。主要試劑：細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞分離液等。

2.2.2 細(xì)胞克隆培養(yǎng)體系 根據(jù)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞生活特性選擇適宜的培養(yǎng)基，確保健康的靶細(xì)胞能夠形成克隆。推薦使用適合人淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，克隆培養(yǎng)載體通常選用96或384孔透明細(xì)胞培養(yǎng)板?？寺挝粌?nèi)的細(xì)胞密度因條件而異，靶細(xì)胞極限值為每單位1～2，效應(yīng)細(xì)胞在350～1 400·mm-2，相當(dāng)于96孔板(1～4)×104/孔左右。

2.2.3 靶細(xì)胞處理方法

2.2.3.1 靶細(xì)胞選擇 細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)用的靶細(xì)胞多為傳代培養(yǎng)的癌細(xì)胞，如K562、A549和Raji，也有用病原體感染細(xì)胞的。靶細(xì)胞類(lèi)型構(gòu)成細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)體系，如K562細(xì)胞檢測(cè)體系、Raji細(xì)胞檢測(cè)體系等。靶細(xì)胞性能決定效應(yīng)細(xì)胞毒活力，同一個(gè)效應(yīng)細(xì)胞作用于不同的靶細(xì)胞，細(xì)胞毒活力不同，互相沒(méi)有可比性。

2.2.3.2 靶細(xì)胞處理、計(jì)數(shù)與極限稀釋 實(shí)驗(yàn)前靶細(xì)胞先克隆培養(yǎng)幾代，保證細(xì)胞無(wú)污染，能形成克隆的活性細(xì)胞>95%。實(shí)驗(yàn)用傳代1 d的靶細(xì)胞。LDCIA實(shí)驗(yàn)使用靶細(xì)胞很少，以96孔板為例，一個(gè)標(biāo)本300個(gè)左右。靶細(xì)胞計(jì)數(shù)要求準(zhǔn)確，先將靶細(xì)胞粗劣計(jì)數(shù)，然后取樣直接移至細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)，用帶有網(wǎng)格測(cè)微器的倒置顯微鏡直接計(jì)數(shù)。極限稀釋就是將靶細(xì)胞稀釋至一個(gè)極限值：1個(gè)克隆單位內(nèi)平均1～2個(gè)細(xì)胞，可以是非整數(shù)，但要準(zhǔn)確。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，用培養(yǎng)液稀釋至終濃度為10×μ0·mL-1，然后按每個(gè)克隆單位0.1 mL均勻分配至所有克隆單位內(nèi)。

2.2.4 效應(yīng)細(xì)胞處理方法

2.2.4.1 外周血細(xì)胞計(jì)數(shù) 外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)獲得白細(xì)胞濃度，為計(jì)算CCF提供依據(jù)。

2.2.4.2 外周血細(xì)胞分離 選擇常規(guī)密度梯度分離方法，操作方法可查閱有關(guān)文獻(xiàn)。

2.2.4.3 效應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法 效應(yīng)細(xì)胞密度的準(zhǔn)確性決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞操作簡(jiǎn)單，但要計(jì)數(shù)準(zhǔn)確并不容易，需要掌握正確的方法，盡量消除影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性的因素：1)計(jì)數(shù)前顯微鏡載物臺(tái)要調(diào)水平；2)計(jì)數(shù)的細(xì)胞樣品內(nèi)如果帶有紅細(xì)胞，要用帶有染液的紅細(xì)胞裂解液稀釋細(xì)胞；3)取樣時(shí)細(xì)胞懸液要混勻；4)向計(jì)數(shù)池內(nèi)加樣時(shí)要滴在蓋玻片邊緣的中央，不能吹向池內(nèi)；5)細(xì)胞樣品濃度在1.0×106·mL-1左右計(jì)數(shù)誤差較?。?)計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)越多誤差越小。

2.2.4.4 效應(yīng)細(xì)胞稀釋方法 效應(yīng)細(xì)胞稀釋和分配是影響細(xì)胞密度準(zhǔn)確性的另一個(gè)重要環(huán)節(jié)。稀釋是將計(jì)數(shù)好的細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)紫扔?jì)算總細(xì)胞數(shù)，用計(jì)數(shù)值乘以樣品量，樣品量必須計(jì)量準(zhǔn)確，如果樣品量為1 mL左右，計(jì)數(shù)前稀釋的細(xì)胞壓積和計(jì)數(shù)取樣量都不能忽略。效應(yīng)細(xì)胞稀釋分為4個(gè)密度點(diǎn)：1.0、2.0、3.0、4.0(×104)·mL-1，先將細(xì)胞稀釋成5.0×105·mL-1?？寺挝粩?shù)一般是n=48，一個(gè)密度點(diǎn)的樣品量至少10 mL。稀釋從低密度做起：第1個(gè)密度點(diǎn)，先在稀釋槽里放5.0 mL培養(yǎng)液，取出1.0 mL棄之，然后取細(xì)胞液1.0 mL放入混勻，按每孔0.1 mL均勻分配至48個(gè)克隆單位內(nèi)。第2和第3密度點(diǎn)分別取2.0 mL和3.0 mL細(xì)胞樣品，按同樣方法操作，剩余的細(xì)胞樣品補(bǔ)加1.0 mL稀釋液作為第4個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)樣品，加入培養(yǎng)池內(nèi)。如果效應(yīng)細(xì)胞是誘導(dǎo)培養(yǎng)的各類(lèi)免疫細(xì)胞，直接稀釋分配。

2.2.4.5 滋養(yǎng)細(xì)胞制備方法 取血細(xì)胞分離的底層純紅細(xì)胞，洗滌2次用培養(yǎng)液稀釋成4.0×105·mL-1，按每孔0.1 mL加入對(duì)照組的克隆單位內(nèi)。

2.5細(xì)胞克隆培養(yǎng)與克隆單位計(jì)數(shù)處理好的克隆培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)?？寺∨囵B(yǎng)3～5 d，在倒置顯微鏡下記錄陰性克隆和陽(yáng)性克隆單位數(shù)，必要時(shí)可延至7 d，超過(guò)5 d需更換培養(yǎng)液。

表2 LDCIA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算用表

圖4 克隆抑制率曲線(xiàn)

3 LDCIA可行性檢驗(yàn)

3.1穩(wěn)定的LDCIA培養(yǎng)體系是細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)成功的必要條件極限稀釋細(xì)胞克隆培養(yǎng)，一個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)平均只有1～2個(gè)靶細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)很難存活和生長(zhǎng)，生成克隆更不容易。實(shí)驗(yàn)證明，含有活力正常的15% FBS-DMEM,15% FBS-RPMI-1640培養(yǎng)基都能使健康的K562細(xì)胞生成克隆，克隆率達(dá)到90%以上，血清活力高克隆率也高，但是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有細(xì)胞分化衰亡。不含血清的DMEM、RPMI-1640及無(wú)血清培養(yǎng)基SFM都不能使K562細(xì)胞生成克隆，但是K562細(xì)胞也不分化衰亡。無(wú)血清培養(yǎng)基GT-T551既能使K562形成克隆又無(wú)細(xì)胞分化衰亡。見(jiàn)表3。

3.2LDCIA克隆單位計(jì)數(shù)的可行性與準(zhǔn)確性Poisson概率分布函數(shù)從理論上把復(fù)雜的靶細(xì)胞計(jì)數(shù)變成全或無(wú)計(jì)數(shù)?？寺挝粌?nèi)只要有克隆的靶細(xì)胞，不管多少均為克隆陽(yáng)性單位，無(wú)靶細(xì)胞克隆的為克隆陰性單位。靶細(xì)胞克隆是指聚集的多個(gè)靶細(xì)胞，克隆細(xì)胞多少與培養(yǎng)液活力、克隆時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)系。陰性克隆單位是指沒(méi)有靶細(xì)胞，或靶細(xì)胞已經(jīng)死亡。死亡的靶細(xì)胞膜破裂，或細(xì)胞收縮，外觀灰暗、無(wú)光澤。在LDCIA克隆單位里靶細(xì)胞很少，而且細(xì)胞形態(tài)、大小、活力狀況外貌特征與效應(yīng)細(xì)胞差別明顯。陽(yáng)性克隆單位里的靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞，差別明顯，容易區(qū)別。用紅細(xì)胞做滋養(yǎng)細(xì)胞的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，紅細(xì)胞與靶細(xì)胞明顯不同。有些效應(yīng)細(xì)胞聚集形成的簇，與靶細(xì)胞克隆也明顯不同。因此陰性單位與陽(yáng)性單位容易分辨，克隆單位計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率很高，誤差一般不超過(guò)1或2個(gè)克隆單位。如果靶細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，計(jì)數(shù)克隆單位前將非貼壁細(xì)胞洗去，計(jì)數(shù)會(huì)更快捷、準(zhǔn)確。見(jiàn)圖2。

表3 不同培養(yǎng)基的極限稀釋細(xì)胞克隆形成率與細(xì)胞衰亡率

3.3靶細(xì)胞分化衰亡是影響細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)的重要因素細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化一定時(shí)期以后都會(huì)衰老死亡。衰亡是細(xì)胞衰老死亡的過(guò)程，凋亡是細(xì)胞程序死亡的形式。靶細(xì)胞衰亡在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組里表現(xiàn)一樣，與細(xì)胞毒作用無(wú)關(guān)，但是與生活環(huán)境有關(guān)，在無(wú)血清培養(yǎng)基里看不到細(xì)胞衰亡，加入血清以后細(xì)胞出現(xiàn)衰亡。在密度很低，細(xì)胞互不依附情況下，細(xì)胞凋亡形式完整可見(jiàn)。光鏡下細(xì)胞衰亡首先是停止增殖和分化，然后變圓和膨大，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，大空泡或破滅或分解成小空泡，胞質(zhì)和核變化看不清，最后胞膜破裂，胞質(zhì)蛋白攤開(kāi)成一片，上面黏附聚集空泡小體，有的小泡可分散到培養(yǎng)基里。衰亡的細(xì)胞不具有完整的細(xì)胞特征(圖2)。密集培養(yǎng)的細(xì)胞，眾多衰亡細(xì)胞產(chǎn)生的膠原黏附在一起漂浮在培養(yǎng)基內(nèi)，看不到完整的細(xì)胞凋亡形態(tài)。在無(wú)血清或血清活力低的培養(yǎng)基里細(xì)胞不表現(xiàn)衰亡，而是呈現(xiàn)病理性死亡，是由饑餓、理化因素和免疫殺傷引起的死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞收縮，胞膜和胞質(zhì)化解，進(jìn)而成碎片消失(圖2)。細(xì)胞衰亡發(fā)生在細(xì)胞有增殖分化能力的培養(yǎng)基里，如果不是衰亡就會(huì)形成克隆，因此在LDCIA實(shí)驗(yàn)中有衰亡細(xì)胞的克隆單位是陽(yáng)性單位。

衰亡是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的普遍現(xiàn)象，我們檢查了懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞K562、NS/1和貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞A549，在克隆培養(yǎng)過(guò)程中都有細(xì)胞衰亡，形態(tài)相同。51Cr釋放法等也存在細(xì)胞衰亡的問(wèn)題，細(xì)胞衰亡，膜破裂標(biāo)記物釋放造成假性殺傷。衰亡的靶細(xì)胞在有效應(yīng)細(xì)胞的克隆單位內(nèi)不易識(shí)別，影響克隆單位的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)必須解決好細(xì)胞衰亡的問(wèn)題。解決辦法是使用具有細(xì)胞克隆活力的無(wú)血清培養(yǎng)基，如GT-T551培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)室檢查了1個(gè)批次樣品，K562細(xì)胞克隆率94.5%(表3)，新配制的GT-T551克隆率達(dá)到95%以上。

3.4細(xì)胞毒活力決定于效應(yīng)細(xì)胞密度與含有的活性細(xì)胞頻率

3.4.1 效靶細(xì)胞互相接觸是發(fā)生細(xì)胞毒反應(yīng)的必要條件 具有細(xì)胞毒作用的免疫細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用都需要與靶細(xì)胞接觸。體外條件下細(xì)胞不會(huì)自主運(yùn)動(dòng)，即使有趨化能力也是范圍有限，因此一般情況下，在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)，效靶細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)是隨機(jī)的。如果克隆培養(yǎng)單位內(nèi)的細(xì)胞密度很低，效靶細(xì)胞沒(méi)有接觸機(jī)會(huì)，即使有細(xì)胞毒活力也表現(xiàn)不出來(lái)。隨著細(xì)胞密度增大，效應(yīng)細(xì)胞有了接觸靶細(xì)胞的機(jī)會(huì)，才有殺傷靶細(xì)胞的可能，當(dāng)細(xì)胞密度大到一定程度時(shí)，每一個(gè)靶細(xì)胞至少會(huì)接觸到一個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，這時(shí)，如果每一個(gè)效應(yīng)細(xì)胞都具有殺傷活力，靶細(xì)胞全部被殺傷，檢測(cè)到的細(xì)胞毒活力就是100%；如果效應(yīng)細(xì)胞有一部分沒(méi)有殺傷活力，靶細(xì)胞不會(huì)被全部殺傷，檢測(cè)到的細(xì)胞毒活力低于100%。這就是說(shuō)，在低密度條件下測(cè)定的細(xì)胞毒活力，有時(shí)測(cè)定值低，或等于0，不表示細(xì)胞毒活力低，或沒(méi)有活力，而是條件不具備。

3.4.2 效靶細(xì)胞在細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)體系中的分布狀態(tài)決定細(xì)胞毒反應(yīng)發(fā)生的概率 效靶細(xì)胞的形態(tài)特征和在細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)體系中的分布狀態(tài)。以K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，PBMC作效應(yīng)細(xì)胞為例，K562細(xì)胞直徑18～23 μm，均值21 μm；效應(yīng)細(xì)胞有大有小(大型細(xì)胞群：?jiǎn)魏思?xì)胞，直徑15～20 μm，所占比率3%～5%；中型細(xì)胞群：中性粒細(xì)胞、嗜酸、嗜堿粒細(xì)胞，直徑12 μm左右，所占比率55%～75%；小型細(xì)胞群：淋巴細(xì)胞，直徑7 μm左右，所占比率20%～40%)，兼顧細(xì)胞群的比例和直徑大小，取平均直徑11 μm。效-靶細(xì)胞直徑合計(jì)32 μm。要滿(mǎn)足一個(gè)靶細(xì)胞平均接觸2個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，2個(gè)效應(yīng)細(xì)胞之間的距離≤32 μm，1 mm2面積上有效應(yīng)細(xì)胞977個(gè)。要滿(mǎn)足一個(gè)靶細(xì)胞平均接觸3個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，2個(gè)效應(yīng)細(xì)胞之間的距離≤28 μm，1 mm2面積上有效應(yīng)細(xì)胞1 302個(gè)。以此類(lèi)推。96孔和384孔培養(yǎng)板底面直徑分別為6 mm和2.7 mm，表面積分別為28.274 3 mm2和5.725 6 mm2。表4列出不同細(xì)胞密度條件下效靶細(xì)胞接觸類(lèi)型、細(xì)胞間距以及在96孔或384孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞數(shù)。

表4 不同效-靶細(xì)胞接觸類(lèi)型對(duì)應(yīng)的細(xì)胞間距與細(xì)胞密度

3.4.3 效應(yīng)細(xì)胞密度決定細(xì)胞毒性反應(yīng)發(fā)生的概率 體外細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)，細(xì)胞是排列在一個(gè)平面上，一般情況下細(xì)胞是平面靠近，出現(xiàn)疊加機(jī)會(huì)很少。假如一個(gè)靶細(xì)胞平均接觸2個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，有時(shí)可能只接觸到1個(gè)或0個(gè)效應(yīng)細(xì)胞；一個(gè)靶細(xì)胞平均接觸3個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，有時(shí)可能接觸4個(gè)或2個(gè)或1個(gè)或0個(gè)效應(yīng)細(xì)胞。這相當(dāng)于將效應(yīng)細(xì)胞分到許多個(gè)小單位里，平均每個(gè)單位里有n細(xì)胞，但不會(huì)每個(gè)單位里都是n細(xì)胞；可能會(huì)有0、1、2、…細(xì)胞的情況。隨著n增大，即效應(yīng)細(xì)胞密度增大，效靶細(xì)胞接觸機(jī)會(huì)也增加，發(fā)生反應(yīng)的概率也增大。效應(yīng)細(xì)胞中會(huì)有一部分不具有細(xì)胞毒活性，只有細(xì)胞毒性細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸才能發(fā)生細(xì)胞毒性。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一個(gè)靶細(xì)胞平均接觸5個(gè)以上效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，情況比較復(fù)雜，理論上1個(gè)靶細(xì)胞可以接觸5個(gè)以上效應(yīng)細(xì)胞，實(shí)際上只能接觸4個(gè)或5個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，幾乎沒(méi)有機(jī)會(huì)能同時(shí)接觸5個(gè)以上效應(yīng)細(xì)胞。這是由于細(xì)胞密度過(guò)大時(shí)，靶細(xì)胞接觸遠(yuǎn)處細(xì)胞的機(jī)會(huì)受到限制(圖5)。這相當(dāng)于太多細(xì)胞擠在1個(gè)小單位里，靶細(xì)胞放入以后接觸不到下層的細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞達(dá)到一定密度以后，再提高細(xì)胞密度不增加效-靶細(xì)胞接觸機(jī)會(huì)，稱(chēng)為飽和密度效應(yīng)。飽和密度條件下，細(xì)胞毒性反應(yīng)發(fā)生的幾率決定于表層細(xì)胞毒性細(xì)胞比率，與細(xì)胞密度沒(méi)有關(guān)系。非飽和密度條件下，細(xì)胞毒活力既與細(xì)胞密度有關(guān)，也與細(xì)胞毒性細(xì)胞頻率有關(guān)。

圖5 2個(gè)細(xì)胞相對(duì)距離模式圖

3.4.4 克隆抑制率與效應(yīng)細(xì)胞密度的關(guān)系 圖6是LDCIA以96孔培養(yǎng)板為載體，用PBMC作效應(yīng)細(xì)胞，K562細(xì)胞做靶細(xì)胞μ0=1，改變效應(yīng)細(xì)胞密度(Di)，測(cè)得的克隆抑制率(CIR-)與效應(yīng)細(xì)胞密度之間的關(guān)系。3條曲線(xiàn)都是CIR-隨效應(yīng)細(xì)胞密度增大而升高，在低密度區(qū)，CIR-隨細(xì)胞密度增加升高很快，以后變慢，逐漸達(dá)到最大值，隨后效應(yīng)細(xì)胞密度再增大，CIR-不再明顯升高。各實(shí)驗(yàn)組每個(gè)克隆單位內(nèi)加入的靶細(xì)胞數(shù)都一樣，如果效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞沒(méi)有作用，根據(jù)極限稀釋法原理各實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的陰性單位數(shù)都相同μi=μ0,CIR-與細(xì)胞密度應(yīng)該是CIR-=0的一條直線(xiàn)。實(shí)際測(cè)得的是曲線(xiàn)，表明是效應(yīng)細(xì)胞作用減少了靶細(xì)胞，細(xì)胞密度越大效應(yīng)越強(qiáng)，μi值越低。細(xì)胞樣本不同，即使細(xì)胞密度相同，細(xì)胞毒活力也不一樣。細(xì)胞毒活力決定于效應(yīng)細(xì)胞中的CCF，CCF高， CIR-升高快，飽和的CIR-值也高，但是飽和CIR-對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度值基本都在同一個(gè)效應(yīng)細(xì)胞密度位置。圖6是以96孔板為載體，飽和CIR-對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度值為每孔 4×104細(xì)胞(1 415·mm-2)左右。樣本的細(xì)胞毒活性細(xì)胞頻率是一定的，在非飽和密度條件下，克隆單位內(nèi)細(xì)胞毒活性細(xì)胞數(shù)隨細(xì)胞密度增大而增多，效靶細(xì)胞接觸的機(jī)會(huì)也隨之增大，所以CIR-升高。飽和密度條件下，效靶細(xì)胞接觸的機(jī)會(huì)達(dá)到飽和值，此時(shí)CIR-只與效應(yīng)細(xì)胞中細(xì)胞毒活性細(xì)胞頻率有關(guān)，CCF高，CIR-也高。圖6中CIR-1>CIR-2>CIR-3，反映效應(yīng)細(xì)胞中細(xì)胞毒活性細(xì)胞頻率依次降低。表明CIR是細(xì)胞密度的函數(shù)。

圖6 CIR-與細(xì)胞密度關(guān)系曲線(xiàn)

圖7是用實(shí)驗(yàn)值表示的μi、CIRi和lnCIR與Di之間的關(guān)系。圖7中乘以5、10和100是為了圖示直觀，把不同量值的數(shù)放在一個(gè)圖上，不改變參數(shù)屬性。μi和CIRi與Di是曲線(xiàn)關(guān)系，可用指數(shù)函數(shù)CIR+=ae-bD表示，μi和CIRi+是降函數(shù)，CIRi-是升函數(shù)，指數(shù)曲線(xiàn)是s型曲線(xiàn)中的一部分。指數(shù)曲線(xiàn)方程兩邊取對(duì)數(shù)即為線(xiàn)性方程，圖7表示lnCIR與Di之間為線(xiàn)性關(guān)系，前4個(gè)點(diǎn)在直線(xiàn)上，第5個(gè)點(diǎn)在飽和密度區(qū)，CIR+偏高不在直線(xiàn)上。

藥理學(xué)研究常用半致死劑量LD50表示藥物性能，LD50通過(guò)藥物反應(yīng)量效曲線(xiàn)測(cè)定。細(xì)胞毒活力用全抑制率細(xì)胞密度ID100或半抑制率細(xì)胞密度ID50作為指標(biāo)，能準(zhǔn)確地體現(xiàn)細(xì)胞毒活力。

3.5飽和密度概念與CCF檢測(cè)方法細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)中的細(xì)胞密度一般是指效應(yīng)細(xì)胞密度。飽和密度是指克隆抑制率達(dá)到最大值對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度。飽和密度有2種：1)表觀飽和密度(modal saturated density,mSD)，LDCIA在細(xì)胞密度達(dá)到mSD以后克隆抑制率不再升高，而CIR-不一定是100%；2)實(shí)際飽和密度 (practical saturated density,pSD)，克隆抑制率CIR-=100%對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度值，也稱(chēng)為全克隆抑制率密度，用ID100表示。

圖7 CIR與mD的關(guān)系曲線(xiàn)

3.5.1 表觀密度與表觀飽和密度 效應(yīng)細(xì)胞排列分布在載體平面上構(gòu)成的細(xì)胞密度稱(chēng)為表觀密度(modal density,mD)，用單位面積上的細(xì)胞數(shù)表示。以mSD為條件檢測(cè)細(xì)胞毒活力CIR-已達(dá)到最大，但CIR-不一定達(dá)到100%。效-靶細(xì)胞空間距離與細(xì)胞密度關(guān)系的論述表明，1個(gè)靶細(xì)胞平均接觸4個(gè)效應(yīng)細(xì)胞一般可以達(dá)到飽和，密度再增大，效靶細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)不再明顯增加。這是一個(gè)理論推算值，實(shí)際情況可能是細(xì)胞有大有小，形狀也不全是圓形，免疫細(xì)胞還有趨化、聚集能力。真實(shí)的mSD以實(shí)際檢測(cè)值為準(zhǔn)。前面一節(jié)，以96孔板為載體檢測(cè)細(xì)胞毒活力，mD在4×104/孔左右CIR-達(dá)到最大值，細(xì)胞密度再增大CIR-升高不多或不再升高。實(shí)際驗(yàn)證的mSD與推算值基本一致。mSD與檢驗(yàn)體系有關(guān)，同一個(gè)體系內(nèi)的mSD是一個(gè)定值，不隨細(xì)胞樣本而變。

3.5.2 實(shí)際飽和密度 pSD是克隆抑制率CIR-=100%對(duì)應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞密度，pSD就是ID100。一般效應(yīng)細(xì)胞中CCF都比較低，能直接測(cè)出ID100的很少。一般是以mD為變量，在低密度區(qū)設(shè)置幾個(gè)密度點(diǎn)檢測(cè)同一個(gè)樣本的CIR-，密度越高CIR-越大，CIR-與細(xì)胞密度在二維坐標(biāo)圖上構(gòu)成一條曲線(xiàn)，將曲線(xiàn)外推至CIR-=100%(CIR100)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度就是ID100。ID100因樣本不同而異，體現(xiàn)效應(yīng)細(xì)胞的性能。效應(yīng)細(xì)胞CIR100對(duì)應(yīng)的ID100值低，表示殺傷全部靶細(xì)胞需要較少細(xì)胞數(shù)，表示CCF高，CCF與ID100呈反比例關(guān)系。

3.5.3 表觀克隆抑制率、標(biāo)準(zhǔn)克隆抑制率與細(xì)胞毒活性細(xì)胞頻率 mD和mSD是細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)條件預(yù)置參數(shù)。在飽和與非飽和密度條件下檢驗(yàn)的細(xì)胞毒活力意義不同。細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)，細(xì)胞以mD限定在平面上，不能自主運(yùn)動(dòng)，可以稀疏也可以密集，密集情況下細(xì)胞互相之間的阻礙作用會(huì)降低效靶細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)。平面、密集、細(xì)胞之間的阻礙現(xiàn)象是體外檢驗(yàn)體系特有的，與體內(nèi)情況不同。體內(nèi)生活的細(xì)胞，特別是血液體系內(nèi)的流動(dòng)細(xì)胞，處于三維立體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，細(xì)胞不會(huì)過(guò)于密集，細(xì)胞之間互相接觸是隨機(jī)相遇，機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于體外平面狀態(tài)。如果mD=977·mm-2，立體狀態(tài)時(shí)可以達(dá)到為3.05×104·mm-3。在飽和密度條件下檢測(cè)細(xì)胞毒活力，CIR-值比實(shí)際偏低，細(xì)胞毒活力越低差別越大。在mSD條件下測(cè)定的CIR稱(chēng)為表觀克隆抑制率(modal cloning inhibited rate,mCIR)。mCIR一般指以mSD≥1 600·mm-2(96孔板4.5×104/孔，表示為mCIR4.5)為條件的測(cè)定值。mCIR具有效應(yīng)細(xì)胞樣本特異性，體現(xiàn)效應(yīng)細(xì)胞中CCF不同，但是反映的只是CCF相對(duì)比例高低，不能準(zhǔn)確定量CCF,不是真實(shí)的細(xì)胞毒活力，因此不能用作細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)指標(biāo)。

在低密度條件下，效靶細(xì)胞接觸是隨機(jī)相遇，與體內(nèi)細(xì)胞活動(dòng)狀態(tài)近似，檢測(cè)的細(xì)胞毒活力接近于體內(nèi)情況。但是，由于體內(nèi)細(xì)胞密度隨飲食和生活狀況變化，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的mD不可能與體內(nèi)情況一致，由一個(gè)密度點(diǎn)獲得的檢驗(yàn)結(jié)果只是細(xì)胞毒活力在該密度點(diǎn)的表現(xiàn)。因此，細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)選擇多點(diǎn)實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定CIR-mD關(guān)系曲線(xiàn)，由曲線(xiàn)可以確定任意密度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的CIR值或CIR對(duì)應(yīng)的mD值。

在mSD條件下可以測(cè)定一個(gè)CIR，在mD條件下可以測(cè)定很多個(gè)CIR，任意條件下測(cè)定一個(gè)CIR是沒(méi)有意義的。細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)的目的是了解不同人群、不同個(gè)體的細(xì)胞毒活力狀態(tài)，不同樣本的細(xì)胞毒活力，有比較才有高低，比較應(yīng)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，條件相同，比較才有意義。細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)用于病因分析和療效評(píng)價(jià)，應(yīng)該以健康人檢驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，以50%的樣本CIR達(dá)到最大值為條件，建立比較標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用LDCIA檢測(cè)26例次健康人標(biāo)本，以mD=6.8×104/孔作標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算CIR值，有50%以上的標(biāo)本達(dá)到或接近CIR100,均值(97.3%±1.7)%，下限值90%。如果以mD=5.0×104/孔作標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算CIR值，只有少數(shù)標(biāo)本達(dá)到CIR100,下限值低于70%。顯然以mD=6.8×104/孔為條件測(cè)得的CIR做標(biāo)準(zhǔn)比較合適。標(biāo)準(zhǔn)條件下的CIR值稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)克隆抑制率(standard cloning inhibited rate,sCIR),為了直觀，用CIR6.8表示。CIR6.8在低密度條件下由克隆抑制率曲線(xiàn)確定，有CIR100和ID100=6.8×104/孔等2個(gè)限定條件，能真實(shí)反映效應(yīng)細(xì)胞殺傷活力，用作比標(biāo)準(zhǔn)意義明確，有一定實(shí)用性。

CCF是一個(gè)功能概念，與以表型特征分類(lèi)的細(xì)胞概念不同。CCF可以是某一種類(lèi)型細(xì)胞的一部分，也可以是幾種類(lèi)型細(xì)胞的一部分，是效應(yīng)細(xì)胞質(zhì)量效應(yīng)和數(shù)量效應(yīng)的綜合體現(xiàn)。質(zhì)量是指效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力，通常1個(gè)效應(yīng)細(xì)胞殺傷1個(gè)靶細(xì)胞，有時(shí)也可以殺傷幾個(gè)靶細(xì)胞，或幾個(gè)效應(yīng)細(xì)胞殺傷1個(gè)靶細(xì)胞。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中將同一個(gè)細(xì)胞樣本分成幾份，用紅細(xì)胞裂解液處理，時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的損傷越大，然后在同樣條件下測(cè)定細(xì)胞毒活力。結(jié)果裂解液處理過(guò)的樣本，細(xì)胞毒活力明顯降低(見(jiàn)應(yīng)用舉例)。細(xì)胞密度和組成沒(méi)有變，殺傷活力降低表明細(xì)胞質(zhì)量出現(xiàn)了問(wèn)題。細(xì)胞質(zhì)量問(wèn)題可以轉(zhuǎn)化為數(shù)量問(wèn)題,原來(lái)具有細(xì)胞毒活性的細(xì)胞因?yàn)閾p傷失去了殺傷能力,細(xì)胞屬性沒(méi)有變,但功能上變成了無(wú)活性細(xì)胞,有活性的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少。CCF是影響細(xì)胞毒活力的主要因素，在檢測(cè)樣本內(nèi)是恒定的，不隨細(xì)胞密度變化，具有樣本特異性。因?yàn)槭窃谛О屑?xì)胞隨機(jī)相遇條件下檢測(cè)得到的，能比較真實(shí)地反映細(xì)胞毒活力情況。因此CCF是反映細(xì)胞毒活力的特異性指標(biāo)。

3.5.4 細(xì)胞毒活性細(xì)胞頻率測(cè)定方法 LDCIA定量CCF值的基本原理是，選擇一種或一類(lèi)效應(yīng)細(xì)胞樣品，檢測(cè)CIR-mD曲線(xiàn)，計(jì)算CIR-達(dá)到100%的樣本概率(probability of specimen-CIR100,PS-CIR100)。如果一個(gè)靶細(xì)胞接觸一個(gè)效應(yīng)細(xì)胞即被殺傷，在飽和密度條件下，CCF為100%時(shí)，檢測(cè)到的CIR-應(yīng)該是100%，由于LDCIA實(shí)驗(yàn)是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，不會(huì)每次都檢測(cè)到CIR-=100%.LDCIA相當(dāng)于將效應(yīng)細(xì)胞分隔成許多個(gè)小單位，平均每個(gè)單位里n細(xì)胞，但不會(huì)每個(gè)單位里都是n細(xì)胞，可能會(huì)有0、1、2、3、…n細(xì)胞。靶細(xì)胞隨機(jī)放到1個(gè)單位里可能會(huì)遇到單位里有0、1、2、3、…或n細(xì)胞的情況。如果遇到0個(gè)細(xì)胞就不會(huì)被殺傷。零殺傷概率由Poisson分布函數(shù)確定。根據(jù)極限稀釋方法原理，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1個(gè)靶細(xì)胞平均接觸4個(gè)效應(yīng)細(xì)胞(1 953·mm-2)時(shí)，如果效應(yīng)細(xì)胞全是細(xì)胞毒活性細(xì)胞，檢測(cè)到的CIR100的概率是98.2%；如果細(xì)胞毒活性細(xì)胞是1/4(Ac=1)，檢測(cè)到的CIR100的概率是63.2%；如果活性細(xì)胞是1/8(Ac=0.5)，檢測(cè)到的CIR100的概率低于 40%；1個(gè)靶細(xì)胞平均接觸1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或5個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的情況類(lèi)似。表5列出不同的效靶細(xì)胞接觸類(lèi)型與不同細(xì)胞毒活性細(xì)胞比率檢測(cè)到CIR100的概率(PS-CIR100)。在mD一定條件下，PS-CIR100決定于效應(yīng)細(xì)胞中的活性細(xì)胞比率，比率越高PS-CIR100越大。PS-CIR100是一個(gè)測(cè)定值，用PS-CIR100可以計(jì)算活性細(xì)胞比率。例如mD=1 953·mm-2，1個(gè)靶細(xì)胞平均接觸4個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，如果PS-CIR100為63.2%，表示4個(gè)效應(yīng)細(xì)胞中有1個(gè)是活性細(xì)胞，CCF=1/4=25%。

表5 不同效-靶細(xì)胞接觸類(lèi)型、活性細(xì)胞比率與檢測(cè)到CIR100的樣本概率

我們應(yīng)用LDCIA方法，以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為載體檢測(cè)了34例效應(yīng)細(xì)胞樣品的克隆抑制率CIR。26例健康人外周血細(xì)胞，在密度mD=6.8×104/孔(相當(dāng)于2 402/孔)條件下檢測(cè)細(xì)胞毒活力，其中14例為CIR100,PS-CIR100為54%，表示1個(gè)靶細(xì)胞平均接觸4.5個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，其中有0.807 5個(gè)活性細(xì)胞，CCF=0.807 5/4.5=18.0%。8例CIK細(xì)胞，有7例在4×104/孔條件下CIR-達(dá)到100%，PS-CIR100為87.5%。mD=4×104/孔相當(dāng)于1個(gè)靶細(xì)胞平均接觸3.08個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，表示其中有2.11個(gè)活性細(xì)胞，CCF=2.11/3.08=68.5%。

以CIR6.8為參照標(biāo)準(zhǔn)，RPSD的正常值范圍為0.56～1.50。實(shí)際上CCF值就是用RPSD與標(biāo)準(zhǔn)CCF值相乘計(jì)算出來(lái)的。不過(guò)RPSD只是一個(gè)比值，沒(méi)有CCF意義不明確。CCF的重要意義不僅僅是提供一個(gè)細(xì)胞毒活性細(xì)胞頻率及其正常值范圍，另一個(gè)用處是計(jì)算外周血中細(xì)胞毒活性細(xì)胞的數(shù)量，為評(píng)價(jià)免疫功能狀態(tài)提供重要信息。例如，患者體檢，1例白細(xì)胞是9×109·L-1，另1例是3×109·L-1，兩者CCF相同，都是15%，他們外周血中的細(xì)胞毒活性細(xì)胞數(shù)量是不一樣的，前者為1.35×109·L-1,后者為0.45×109·L-1。反過(guò)來(lái)，白細(xì)胞相同，CCF不同，外周血中細(xì)胞毒活性細(xì)胞數(shù)量還是不一樣。

細(xì)胞毒活力高低是相對(duì)于參照標(biāo)準(zhǔn)的比較值。參照標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)檢驗(yàn)對(duì)象和檢驗(yàn)?zāi)康?，?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)樣本通過(guò)實(shí)際檢驗(yàn)確定。靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞不同，標(biāo)準(zhǔn)不相同。如上述細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)是用LDCIA實(shí)驗(yàn)方法，以K562細(xì)胞作靶細(xì)胞，以CIK細(xì)胞和外周血細(xì)胞為檢測(cè)對(duì)象建立的檢驗(yàn)體系。檢驗(yàn)結(jié)果只適用于該體系，如果換了靶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞，就不適用。上述檢驗(yàn)得到的CCF值，因?yàn)闃?biāo)本數(shù)少，可信度可能不夠高，希望有條件的實(shí)驗(yàn)室能檢測(cè)更多的標(biāo)本建立更實(shí)用的參照標(biāo)準(zhǔn)。

3.6細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)條件標(biāo)準(zhǔn)化

3.6.1 細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化 細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化，是選取4個(gè)mD實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，前幾個(gè)在非飽和密度區(qū)，最后一個(gè)在飽和密度區(qū)(mD≥4.5×104/孔)用于測(cè)定mCIR4.5。靶細(xì)胞做極限稀釋?zhuān)鲗?shí)驗(yàn)點(diǎn)相同。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)測(cè)得1個(gè)μi，細(xì)胞毒活力越大，μi越小。μi=0或CIR-=100%，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度即ID100值。靶細(xì)胞極限稀釋值μ0是一個(gè)預(yù)置值，由于操作誤差或克隆培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞自然死亡，預(yù)置的μ0值和實(shí)測(cè)值不一定相等，數(shù)據(jù)處理以對(duì)照組實(shí)測(cè)值為準(zhǔn)。測(cè)定mCIR4.5的目的是建立一個(gè)參照標(biāo)準(zhǔn)， mCIR4.5直接測(cè)定值，一般低于曲線(xiàn)計(jì)算值，如果曲線(xiàn)計(jì)算值低于測(cè)定值，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有問(wèn)題。見(jiàn)圖6。

LDCIA實(shí)驗(yàn)以96孔板做克隆載體需要效應(yīng)細(xì)胞5.5×106。如果檢測(cè)樣本細(xì)胞數(shù)不夠可以減少實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，首先減掉一個(gè)非飽和密度點(diǎn)；如果細(xì)胞數(shù)還不夠，應(yīng)該去掉mSD密度點(diǎn)；如果不足1.0×106細(xì)胞，可以按實(shí)際細(xì)胞數(shù)作1個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，與對(duì)照組構(gòu)成2個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，用兩點(diǎn)形成的一條直線(xiàn)代替多點(diǎn)曲線(xiàn)計(jì)算相關(guān)參數(shù)。單點(diǎn)法需要注意：1)效應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和取樣分配要非常準(zhǔn)確；2)數(shù)據(jù)處理必須按曲線(xiàn)條件轉(zhuǎn)換，不能直接用μi計(jì)算CIR。正常情況下不用單劑量點(diǎn)方法。

3.6.2 細(xì)胞毒活力實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化 效應(yīng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化。關(guān)于表觀飽和密度的論述，驗(yàn)證在mSD條件下檢測(cè)到的CIR不反映真實(shí)的細(xì)胞毒活力。為了真實(shí)反映細(xì)胞毒活力，應(yīng)該在低密度區(qū)選擇多個(gè)密度點(diǎn)，通過(guò)克隆抑制率曲線(xiàn)測(cè)定細(xì)胞毒活力指標(biāo)。效應(yīng)細(xì)胞密度不同，殺傷率不同。不同樣本，用相同的效應(yīng)細(xì)胞密度為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較才有意義。選擇什么樣的細(xì)胞密度做標(biāo)準(zhǔn)由樣本屬性決定。健康人PBMC以mD=6.8×104為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)CIR，用CIR6.8做標(biāo)準(zhǔn)。

靶細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化。靶細(xì)胞對(duì)殺傷率有影響，為了消除靶細(xì)胞的影響，LDCIA設(shè)定用同樣的靶細(xì)胞密度，但操作總會(huì)有失誤，要做到每次實(shí)驗(yàn)條件(μ0和mDi)都完全相同不太可能。表6是同一個(gè)細(xì)胞樣本，用不同的靶細(xì)胞預(yù)置值μ0，相對(duì)于同樣的mD，檢測(cè)到的μi.。預(yù)置μ0項(xiàng)是加在克隆單位內(nèi)的靶細(xì)胞數(shù)，0.0項(xiàng)下的μi是實(shí)際檢測(cè)值，兩者會(huì)有差異，數(shù)據(jù)處理以檢測(cè)值為準(zhǔn)。圖3是根據(jù)表6中的數(shù)據(jù)，通過(guò)ln100μi對(duì)mD作圖。取前4個(gè)點(diǎn)作圖呈直線(xiàn)(第5個(gè)點(diǎn)屬于飽和密度值，不在直線(xiàn)上)。3個(gè)預(yù)置的μ0，3條線(xiàn)平行，其與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)不同。因此，pSD值不同。表明同一個(gè)檢測(cè)樣本，靶細(xì)胞預(yù)置μ0值不同，檢驗(yàn)結(jié)果不同。

靶細(xì)胞μ0標(biāo)準(zhǔn)化是以μ0=1做標(biāo)準(zhǔn)，將μ0不等于1的實(shí)驗(yàn)值μi按比例放大或縮小，即對(duì)實(shí)驗(yàn)值μ0和μi都除以μ0，表6中μ0=1.0一行是上面3組數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理后的結(jié)果。同一個(gè)檢測(cè)樣本，3個(gè)預(yù)置μ0獲得3組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)化處理后都與μ0=1.0相同。線(xiàn)性擬合前后的斜率b都一樣，不受預(yù)置條件影響，由樣本性質(zhì)決定；常數(shù)項(xiàng)a受預(yù)置條件影響；3組數(shù)據(jù)CIR4.5、CIR6.8相同是因?yàn)镃IR計(jì)算時(shí)已經(jīng)除以μ0，等于做了標(biāo)準(zhǔn)化處理。

標(biāo)準(zhǔn)化處理將條件不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化為條件相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，消除了條件差異，使檢驗(yàn)結(jié)果有了可比性。

3.6.3 細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)成功的基本條件 標(biāo)準(zhǔn)化處理將條件不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化為條件相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是以實(shí)驗(yàn)條件真實(shí)、準(zhǔn)確為基礎(chǔ)。如果實(shí)驗(yàn)條件不真實(shí)或不準(zhǔn)確，標(biāo)準(zhǔn)化處理也沒(méi)有意義。圖8中3條曲線(xiàn)是同一個(gè)實(shí)驗(yàn)因條件不同得到的結(jié)果。曲線(xiàn)a是效應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，稀釋無(wú)誤獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，預(yù)置細(xì)胞密度值mD=0.6、2.4、3.6、5.0(×104)。曲線(xiàn)b是第1個(gè)密度點(diǎn)稀釋操作有誤，0.6×104誤計(jì)為1.2×104，其他計(jì)數(shù)值準(zhǔn)確。曲線(xiàn)c是計(jì)數(shù)不準(zhǔn)，稀釋操作無(wú)誤，各點(diǎn)數(shù)值偏高，造成曲線(xiàn)平移。由3條曲線(xiàn)計(jì)算出來(lái)的參數(shù)列在表7中。計(jì)數(shù)不準(zhǔn)和曲線(xiàn)平移對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大；單點(diǎn)計(jì)數(shù)錯(cuò)誤影響較小，是其他各點(diǎn)計(jì)數(shù)準(zhǔn)確給予了糾正。

表6 細(xì)胞毒活力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化舉例

圖8 計(jì)數(shù)誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

LDCIA實(shí)驗(yàn)參數(shù)的計(jì)算值都與效應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)值有關(guān)，效應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)值是回歸計(jì)算自變量，回歸計(jì)算以自變量無(wú)誤差為條件。因此，效應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)值是影響LDCIA實(shí)驗(yàn)結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度的主要因素，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)效應(yīng)細(xì)胞是細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)成功的基本條件。

表7 效應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響

注：1)取4個(gè)點(diǎn)數(shù)值計(jì)算；2)取前3個(gè)點(diǎn)數(shù)值計(jì)算。

3.7細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)指標(biāo)的選擇與應(yīng)用LDCIA檢測(cè)細(xì)胞毒活力，既計(jì)量靶細(xì)胞變化，又計(jì)量效應(yīng)細(xì)胞變化，導(dǎo)出多個(gè)細(xì)胞毒活力指標(biāo)，為不同檢驗(yàn)?zāi)康奶峁┻x擇參考。CIR是靶細(xì)胞變化參數(shù)，與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，不具有樣本屬性。但是以靶細(xì)胞單位均數(shù)μ0=1，效應(yīng)細(xì)胞密度mD=6.8×104/孔為條件，檢測(cè)健康人PBMC的CIR6.8.，是一個(gè)限定條件殺傷率。限定條件不是隨意選定，由樣本屬性確定，可以用作細(xì)胞毒活力指標(biāo)；ID100和CCF是效應(yīng)細(xì)胞變化參數(shù)，具有樣本屬性。兩者可以獨(dú)立作為細(xì)胞毒活力指標(biāo)；3)CIR-mD回歸系數(shù)b，是殺傷率隨效應(yīng)細(xì)胞密度變化率，具有樣本屬性，是一個(gè)隱形參數(shù)，意義不太明顯。

3組細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)參數(shù)，是由同一組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算出來(lái)的，有內(nèi)在聯(lián)系，可以互相替代，實(shí)際應(yīng)用選擇一個(gè)即可。一般選擇CIR6.8和CCF,如果沒(méi)有CCF標(biāo)準(zhǔn)值，可以直接用ID100。用ID50也可以。

4 LDCIA實(shí)驗(yàn)方法的實(shí)際應(yīng)用

應(yīng)用LDCIA方法，以限定條件的CIR6.8為指標(biāo)，檢驗(yàn)不同樣本的細(xì)胞毒活力。考查L(zhǎng)DCIA方法的靈敏性、穩(wěn)定性與檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性。

4.1LDCIA實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，經(jīng)濟(jì)實(shí)用LDCIA實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)施條件簡(jiǎn)便，一般細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室即可滿(mǎn)足要求。實(shí)驗(yàn)程序只需分離細(xì)胞、計(jì)數(shù)、稀釋和分樣處理。因?yàn)橹挥?jì)數(shù)陰性克隆單位而不計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)數(shù)簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確。因?yàn)椴挥脴?biāo)記和染色細(xì)胞，不用多次轉(zhuǎn)移和洗滌細(xì)胞，減少了操作程序，降低了操作誤差。因此該方法安全，經(jīng)濟(jì)，實(shí)用。

4.2用LDCIA檢測(cè)不同類(lèi)型效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活力表8是用LDCIA方法對(duì)4種效應(yīng)細(xì)胞做的檢驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為載體，用K562細(xì)胞作靶細(xì)胞。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 (cytokine inducing killer，CIK)是一類(lèi)用細(xì)胞因子在體外誘導(dǎo)生成的免疫細(xì)胞。CIK細(xì)胞毒活力很高，一般在mD =3.5×104/孔，CIR-可達(dá)到100%，故檢測(cè) CIK 細(xì)胞毒活力選擇mD=4.0×104/孔。PBMC是用外周血分離的單核細(xì)胞，健康人PBMC以mD =5.0×104條件，檢測(cè)到的CIR5.0只有1例接近70%，其余都在90%以上；以mD =6.8×104為條件檢測(cè)CIR6.8有14/26達(dá)到或接近100%。健康人外周血分離的紅細(xì)胞是無(wú)核細(xì)胞，沒(méi)有細(xì)胞毒作用，以空白實(shí)驗(yàn)組作對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果CIR-為負(fù)值，表明紅細(xì)胞不僅無(wú)細(xì)胞毒作用，而且還能滋養(yǎng)靶細(xì)胞生長(zhǎng)。這也是本方法用紅細(xì)胞做滋養(yǎng)細(xì)胞的依據(jù)。這表明LDCIA實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠反映不同類(lèi)型效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒活力。

4.3LDCIA的靈敏性我們用幾個(gè)有代表性的CIK誘導(dǎo)條件制備CIK細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果(表9)表明，F(xiàn)BS和IL-2是影響細(xì)胞毒活力主要因素。血清活力因子是支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的基本條件。IL-2能促進(jìn)細(xì)胞增殖和獲得免疫殺傷活性，但以細(xì)胞能正常生長(zhǎng)為條件。CD3+抗體和IFN-γ對(duì)細(xì)胞毒活力作用不明顯。植物凝集素PHA也有誘導(dǎo)細(xì)胞毒活力的作用，在該實(shí)驗(yàn)條件下，沒(méi)有IL-2作用力強(qiáng)。

表8 LDCIA檢測(cè)不同人群PBMC的細(xì)胞毒活力

注：1)是回歸方法計(jì)算的CIR-誤差

表9 LDCIA檢測(cè)不同條件下制備的CIK殺傷活力

注：CIR4.0是以效應(yīng)細(xì)胞4.0×104/孔為條件檢測(cè)的CIR-；Sreg是用回歸計(jì)算的CIR誤差

表10是兩類(lèi)受損傷效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)。一類(lèi)效應(yīng)細(xì)胞是健康人PBMC，用紅細(xì)胞裂解液(0.16 mol·L-1，NH4CL×0.17 mol·L-1Tris-HCL,pH7.2)處理，然后用PBS(0.05 mol·L-1pH7.3)洗滌1次，再用培養(yǎng)液稀釋做效應(yīng)細(xì)胞。紅細(xì)胞裂解液能裂解紅細(xì)胞，也能損傷有核細(xì)胞。細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)表明，裂解液作用效應(yīng)細(xì)胞后殺傷活力明顯降低，處理時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞毒活力越低。另一類(lèi)效應(yīng)細(xì)胞是用IL-和CD3+抗體聯(lián)合誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞，體外培養(yǎng)的CIK能強(qiáng)力殺傷K562細(xì)胞，大部分CIK的ID100為3.5×104/孔，CIR4.0全部達(dá)到100%。但是改變環(huán)境條件，如放回自體血漿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，失去了血清和細(xì)胞因子的支持，CIK的殺傷活力很快喪失殆盡CIR4.0=0。LDCIA對(duì)不同條件下生成的免疫細(xì)胞與細(xì)胞損傷前后細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)結(jié)果表明，LDCIA方法對(duì)效應(yīng)細(xì)胞性能變化有靈敏的反應(yīng)性。

4.4LDCIA的穩(wěn)定性表11是對(duì)4個(gè)自愿者PBMC進(jìn)行的重復(fù)細(xì)胞毒檢驗(yàn)。1號(hào)受試者在7個(gè)月期間進(jìn)行了9次檢驗(yàn)；2號(hào)受試者在1個(gè)月期間進(jìn)行了2次檢驗(yàn)；3號(hào)受試者是1例年輕人，不相信較低的結(jié)果，要求重復(fù)檢驗(yàn)，2次檢驗(yàn)結(jié)果差別不大。4例外周血PBMC殺傷活力檢驗(yàn)結(jié)果變異都不大于5%，表明穩(wěn)定性比較好。

表10 LDCIA檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞損傷前后的殺傷活力

注：CIR5.8和CIR4.0是以效應(yīng)細(xì)胞5.81×104/孔和4.0×104/孔為條件檢測(cè)的CIR-

表11 LDCIA實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性

5 LDCIA方法討論

細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)是評(píng)價(jià)免疫功能的重要方法。51Cr釋放法是建立較早、被視為經(jīng)典的檢驗(yàn)方法，實(shí)際上是一個(gè)錯(cuò)誤方法，輻射防護(hù)、污物處理和檢測(cè)儀器昂貴，只是使用難易問(wèn)題；以效靶細(xì)胞比為條件檢測(cè)殺傷率，用殺傷率做細(xì)胞毒活力指標(biāo)是原則性錯(cuò)誤，違背毒理學(xué)原理[16,19-21]，是檢驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，無(wú)法建立檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，不反映細(xì)胞毒活力的主要原因。為解決實(shí)用問(wèn)題，先后建立了10多種替代方法，都沒(méi)有觸及基本原理和方法條件。51Cr釋放法的錯(cuò)誤理念影響細(xì)胞免疫學(xué)半個(gè)多世紀(jì)，要想建立實(shí)用的細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)方法，必須正確認(rèn)識(shí)和消除51Cr釋放法的影響。

LDCIA用于細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)遵循藥理學(xué)原理：1)用CCF或ID100做細(xì)胞毒活力指標(biāo)，以效應(yīng)細(xì)胞密度為變量測(cè)定殺傷率，體現(xiàn)了細(xì)胞毒性反應(yīng)規(guī)律，反映真實(shí)的殺傷活力；2)通過(guò)量-效曲線(xiàn)測(cè)定CCF或ID100，避免了單劑量點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不確定性；3)不對(duì)靶細(xì)胞作標(biāo)記或修飾，用紅細(xì)胞做滋養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞毒性反應(yīng)條件接近于體內(nèi)環(huán)境。靶細(xì)胞能增殖才能形成克隆，死傷細(xì)胞不會(huì)形成克隆，沒(méi)有假性殺傷，應(yīng)用特殊培養(yǎng)基消除細(xì)胞衰亡，避免了假陰性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具真實(shí)性；4)LDCIA將靶細(xì)胞計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換成克隆單位計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方便、快捷、準(zhǔn)確；可以預(yù)置實(shí)驗(yàn)可信度。我們對(duì)LDCIA方法的可行性和實(shí)用性進(jìn)行了驗(yàn)證，由于能力和條件所限，檢測(cè)樣本例數(shù)不夠多，像健康人PBMC的CIR6.8正常值檢測(cè)樣本只有36例，CCF正常值只有26例，可信度不是很高，僅供參考。希望同行們進(jìn)一步檢驗(yàn)認(rèn)證。

LDCIA用于細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)，需要解決好3個(gè)問(wèn)題：1)做好細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性是LDCIA成功的決定性因素。效應(yīng)細(xì)胞密度準(zhǔn)確，獲得的量效曲線(xiàn)才能規(guī)則、平滑、誤差小、可信度高；2)解決好細(xì)胞衰亡問(wèn)題。消除細(xì)胞衰亡的辦法是選擇適宜的培養(yǎng)基；3)正確認(rèn)識(shí)LDCIA中的靶細(xì)胞變化規(guī)律。靶細(xì)胞作極限稀釋?zhuān)植荚跈z測(cè)單位內(nèi)的靶細(xì)胞均數(shù)與克隆陰性單位概率呈指數(shù)關(guān)系；由于細(xì)胞毒性作用，單位內(nèi)靶細(xì)胞因被殺傷而減少，殺傷率與單位內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞密度為非線(xiàn)性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，需要先按Piosson分布函數(shù)計(jì)算靶細(xì)胞均數(shù)，然后將靶細(xì)胞計(jì)數(shù)與效應(yīng)細(xì)胞密度再做一次非線(xiàn)性轉(zhuǎn)換。從克隆單位計(jì)數(shù)到克隆抑制率曲線(xiàn)，經(jīng)過(guò)兩次非線(xiàn)性轉(zhuǎn)換。有人用LDA檢測(cè)細(xì)胞毒活力沒(méi)有成功[22-23]，原因是：1)當(dāng)時(shí)的LDA體系還不成熟，不完善；2)受51Cr釋放法的錯(cuò)誤理念影響，仍以效靶細(xì)胞比為條件檢測(cè)殺傷率，只是用克隆陰性單位概率計(jì)算靶細(xì)胞均數(shù)；3)沒(méi)有處理細(xì)胞衰亡的問(wèn)題。

總之，LDCIA方法遵循藥理學(xué)原理，改變細(xì)胞毒檢驗(yàn)方法理念，是細(xì)胞毒活力檢驗(yàn)方法的一次革命。

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趙承彥(1938-)，男，碩士，研究員，主要從事細(xì)胞免疫與腫瘤免疫治療相關(guān)研究。E-mail:cyzhao.01@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.05.025

Q2-33;R73-36

A

1673-5412(2017)05-0446-16

2016-10-26)