柴麗琴 - 原 洪 王立霞 - 盧躍紅 - 田呈瑞 -

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119) (College of Food Engineering and Nutritional Science of Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi 710119, China)

花椒油樹脂酶法提取工藝優(yōu)化及GC-MS分析

柴麗琴CHAILi-qin原 洪YUANHong王立霞WANGLi-xia盧躍紅LUYue-hong田呈瑞TIANCheng-rui

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119) (CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScienceofShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710119,China)

以花椒為原料，采用纖維素酶酶解法結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化花椒油樹脂提取工藝。結(jié)果表明：最佳工藝條件為：50%的乙醇為提取劑、纖維素酶用量62.3 mg/L、酶解時(shí)間2.3 h、酶解溫度50 ℃、液料比47.4∶1 (mL/g)，該條件下花椒油樹脂提取率為 37.22%。采用氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對花椒油樹脂進(jìn)行分析，共鑒定出47種化合物，主要有D-檸檬烯、芳樟醇、月桂酸、檸檬烯二醇、松油醇、驅(qū)蛔萜、檸檬酸月桂酯、花椒素等。

纖維素酶；花椒油樹脂；提取率；GC-MS

花椒(Zanthoxylumbungeanum)系蕓香科花椒屬植物，為傳統(tǒng)調(diào)味料和中藥[1]。具有抗菌[2]、消炎[3]、殺蟲[4]止癢、抑制血小板凝集[5]等藥理作用。目前花椒主要以整?；蚰ニ榈男问绞褂?，具有香味釋放慢、味道不勻、有效成分利用率低等缺陷。花椒油樹脂作為一種重要的花椒產(chǎn)品，除了含有揮發(fā)性精油成分外，還包含可增強(qiáng)麻香味的非揮發(fā)性成分，從而使其具有更厚重的花椒特有的麻香味[6-7]。

目前對油樹脂的提取主要以傳統(tǒng)的溶劑浸提法為主[8]，提取率較低。邵杰等[9]在采用響應(yīng)面法優(yōu)化花椒油樹脂的超聲提取工藝中，只研究了液固比、乙醇濃度和超聲功率對花椒油樹脂提取率的影響，未涉及超聲時(shí)間和超聲溫度對試驗(yàn)結(jié)果的影響，在其最佳試驗(yàn)條件下花椒油樹脂提取率為33.60%。陶志杰等[10]在采用纖維素酶輔助提取花椒油樹脂的試驗(yàn)中只研究了酶用量、酶解時(shí)間和酶解溫度3個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響，花椒油樹脂提取率為30.2%。本試驗(yàn)引入酶法輔助提取技術(shù)[11-13]結(jié)合響應(yīng)面分析法[14-15]更加系統(tǒng)探究提取溶劑及其體積分?jǐn)?shù)、酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度及液料比5個(gè)因素對花椒油樹脂提取率的影響，與前人研究結(jié)果相比更全面系統(tǒng)。通過GC-MS分析更加直觀地體現(xiàn)最佳工藝條件所得花椒油樹脂的主要成分及含量。以期在控制成本節(jié)約能源的前提下，提高花椒油樹脂得率，并能保證產(chǎn)品品質(zhì)，促進(jìn)食品、調(diào)味品領(lǐng)域?qū)ń樊a(chǎn)品的開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大紅袍花椒：購于陜西韓城；

正己烷：色譜純，西安化學(xué)試劑廠；

纖維素酶：10 000 U/g，西安熱默爾生物科技有限公司；

甲醇、無水乙醇、丙酮：分析純，西安化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：PL203型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9146MBE型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

高速萬能粉碎機(jī)：FW400A型，北京科偉永興儀器有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市正基儀器有限公司；

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(單四極桿)：QP-2010Ultra型，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花椒油樹脂提取方法 花椒干燥去雜后，粉碎過60目篩，得花椒粉，備用。準(zhǔn)確稱取2.5 g花椒粉于錐形瓶中，加入一定劑量纖維素酶[16]并按一定液料比加水在一定溫度下酶解一定時(shí)間，然后加入不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇和丙酮提取90 min。將提取液真空抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，置于50 ℃烘箱烘干除去多余水分，得浸膏狀花椒油樹脂，稱重?；ń酚蜆渲崛÷拾词?1)計(jì)算：

(1)

式中：

c——花椒油樹脂提取率，%；

m1——花椒油樹脂質(zhì)量，g；

m2——花椒粉末質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

(1) 提取溶劑：在酶用量60 mg/L，酶解時(shí)間2.0 h，酶解溫度50 ℃，液料比40∶1 (mL/g)的條件下，分別考察不同提取溶劑(甲醇、乙醇和丙酮)在不同體積分?jǐn)?shù)(40%，50%，60%，70%，80%)的條件下對花椒油樹脂提取率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

(2) 酶用量：在提取溶劑為50%乙醇，酶解時(shí)間2.0 h，酶解溫度50 ℃，液料比40∶1 (mL/g)的條件下，分別考察酶用量(0，20，40，60，80，100 mg/L)對花椒油樹脂提取率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

(3) 酶解時(shí)間：在提取溶劑為50%乙醇，酶用量60 mg/mL，酶解溫度50 ℃，液料比40∶1 (mL/g)的條件下，分別考察酶解時(shí)間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)對花椒油樹脂提取率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

(4) 酶解溫度：在提取溶劑為50%乙醇，酶用量60 mg/mL，酶解時(shí)間2.0 h，液料比40∶1 (mL/g)的條件下，分別考察酶解溫度(35，40，45，50，55，60 ℃)對花椒油樹脂提取率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

(5) 液料比：在提取溶劑為50%乙醇，酶用量60 mg/mL，酶解時(shí)間2.0 h，酶解溫度50 ℃的條件下，分別考察液料比[20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 (mL/g)]對花椒油樹脂提取率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 響應(yīng)曲面法(RSM)優(yōu)化設(shè)計(jì) 依據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探究酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度及液料比4個(gè)因素對花椒油樹脂提取率的影響，采用4因素3水平響應(yīng)面分析法，得二次回歸方程并確定最佳工藝參數(shù)。

1.2.4 花椒油樹脂GC-MS成分分析 將最佳工藝條件下得到的浸膏狀花椒油樹脂(密封良好)于35 ℃條件下水浴融化后，快速取100 μL按體積比用正己烷稀釋1 000倍后過0.22 μm 微孔濾膜，上機(jī)測定。色譜條件：色譜柱(Rtx-5MS)30 m×0.25 mm×0.25 μm；柱箱溫度100 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃；柱升溫程序：100 ℃以10 ℃/min升至200 ℃，再以5 ℃/min 升至250 ℃保持5 min；載氣為He；流速為1 μL/min；分流比30∶1；柱前壓60 kPa。質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍20～600[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒油樹脂提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1(a)可知，溶劑對花椒油樹脂提取效果為：乙醇>丙酮>甲醇>水。乙醇組中當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)提取率最高，可能是油脂類物質(zhì)溶解度與溶劑極性有較大相關(guān)性，50%乙醇與花椒油樹脂極性相近，使得花椒油樹脂溶解度增大，當(dāng)乙醇濃度持續(xù)升高時(shí)，極性差距增大，導(dǎo)致提取率降低。因此選50%乙醇作為花椒油樹脂最佳提取溶劑。

由圖1(b)可知，當(dāng)酶用量過小時(shí)，組織破碎不完全，花椒油樹脂提取率較低；隨著酶用量升高，酶與底物的接觸面積增大，酶解反應(yīng)速率增大，組織破碎效果增強(qiáng)，提取率增加；當(dāng)酶用量達(dá)到60 mg/L時(shí)，提取率最高；此后隨著酶用量增加，提取率呈稍微下滑趨勢，可能由于酶用量達(dá)過飽和，底物濃度相對較低，酶與底物相互競爭，從而對酶產(chǎn)生抑制作用。由此可知應(yīng)控制酶用量在60 mg/L左右為宜。

由圖1(c)可知，酶解時(shí)間在2.0 h內(nèi)隨著酶解時(shí)間的延長，花椒油樹脂提取率逐漸增大，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到2.0 h時(shí)酶活力被充分利用提取率達(dá)最大，此后隨著時(shí)間的延長提取率趨于平穩(wěn)。可見過長時(shí)間的提取并不能增加花椒油樹脂的提取率，還會增加成本[18]，因此應(yīng)控制酶解時(shí)間2.0 h左右為宜。

由圖1(d)可知，當(dāng)酶解溫度在35～50 ℃時(shí)，隨著酶解溫度的增加，花椒油樹脂提取率逐漸增大，當(dāng)酶解溫度達(dá)50 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大。此后隨著溫度的增加花椒油樹脂提取率呈下降趨勢。原因可能與纖維素酶的最適溫度有關(guān)，在一定范圍內(nèi)隨著溫度升高，酶的活性增強(qiáng)，反應(yīng)速度加快；當(dāng)達(dá)到最適溫度后隨著溫度繼續(xù)升高，酶的穩(wěn)定性降低，酶活性減弱，使花椒油樹脂提取率下降。因此，50 ℃為花椒油樹脂提取的較適宜溫度。

由圖1(e)可知，花椒油樹脂提取率在試驗(yàn)范圍內(nèi)隨著液料比的增加均有所增大。當(dāng)液料比較小[20∶1 (mL/g)]時(shí)，花椒油樹脂提取率較低；隨著液料比的增大，固液兩相接觸面增大，有利于加快提取速率使花椒油樹脂提取率增加；當(dāng)液料比為40∶1 (mL/g)時(shí)花椒油樹脂提取率達(dá)到較高狀態(tài)，此后隨著液料比的增大，花椒油樹脂提取率雖呈增加趨勢，但增幅極緩。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)中的能耗和成本問題，選40∶1 (mL/g)為花椒油樹脂提取的較適宜液料比。

2.2 花椒油樹脂提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 花椒油樹脂提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

圖1 各單因素對花椒油樹脂提取效果的影響Figure 1 Effect of each single factor on extraction efficiency of Zanthoxylum oleoresin

2.2.2 二次回歸方程及方差分析 利用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到花椒油樹脂提取率的回歸方程模型：

(2)

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 The table of variables and levels of Box-Behnken

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.3 兩因素間交互作用對花椒油樹脂提取率的影響 由圖2可知，6個(gè)響應(yīng)面都有一定陡峭程度，總趨勢大致相同，結(jié)合方差分析表(因素交互作用的P值均>0.05)可知各因素交互作用對花椒油樹脂提取率影響不顯著。但圖2(e)曲面相對最陡，說明液料比與酶解時(shí)間的交互作用對花椒油樹脂提取率有一定影響(可能與液料比和酶解時(shí)間的顯著影響有關(guān))，但影響不顯著(P>0.05)；圖2(a)、(c)、(d)、(f)曲面相對較陡，說明酶用量和酶解時(shí)間、酶用量和液料比、酶解溫度和液料比的交互作用對花椒油樹脂提取率有影響，但影響較??；圖2(b)曲面相對最緩，說明酶用量和酶解溫度的交互作用對花椒油樹脂提取率影響很小[20]。

2.2.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證 通過響應(yīng)面分析得花椒油樹脂提取最佳工藝條件為：酶用量62.3 mg/L、酶解時(shí)間2.32 h、酶解溫度50.12 ℃、液料比47.36∶1 (mL/g)，此條件下花椒油樹脂理論提取率為37.35%。

在實(shí)際操作中對上述條件稍作調(diào)整并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定最佳工藝條件為：酶用量62.3 mg/L、酶解時(shí)間2.3 h、酶解溫度50 ℃、液料比47.4∶1 (mL/g)，此時(shí)花椒油樹脂提取率為37.22%，與理論預(yù)測值(37.35%)相比相對誤差為0.35%<1%。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的條件參數(shù)較為可靠。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析?Table 3 Analysis of variance for the response surface regression model

圖2 兩因素交互作用對花椒油樹脂得率影響的響應(yīng)面圖

2.3 花椒油樹脂GC-MS分析結(jié)果

對酶解法提取的花椒油樹脂進(jìn)行GC-MS分析，共鑒定出47種化合物，占總化合物的97.7%，其中含量較多的有：花椒素(10.85%)、檸檬烯二醇(5.94%)、檸檬酸月桂酯(5.38%)、月桂酸(4.98%)、驅(qū)蛔萜(4.68%)、松油醇(4.59%)、D-檸檬烯(4.43%)、芳樟醇(4.21%)、香草酸甲酯(3.71%)、月桂醇(3.33%)、香葉酸甲酯(3.20%)、乙酸松油酯(3.20%)，其中含量最高的花椒素是決定花椒麻味的主要成分。

3 結(jié)論

(1) 本試驗(yàn)采用纖維素酶輔助乙醇提取花椒油樹脂，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提法相比不僅可以縮短提取時(shí)間，而且能夠提高花椒油樹脂提取率。結(jié)果表明，花椒油樹脂提取最佳工藝條件為：酶用量62.3 mg/L、酶解時(shí)間2.3 h、酶解溫度50 ℃、液料比47.4∶1 (mL/g)，此工藝條件下所得花椒油樹脂提取率為37.22%，與李國強(qiáng)[8]采用溶劑浸提法所得花椒油樹脂提取率32.50%相比增長了14.5%，因此采用纖維素酶輔助提取技術(shù)可以較高程度地提高花椒油樹脂的提取率。

(2) 由GC-MS分析結(jié)果可知，花椒油樹脂中花椒主要麻味成分花椒素含量高達(dá)10.85%，對花椒油樹脂產(chǎn)品麻味具有重要決定作用，對工業(yè)化生產(chǎn)花椒油樹脂具有一定指導(dǎo)意義，并能夠促進(jìn)食品、調(diào)味品領(lǐng)域?qū)ń沸庐a(chǎn)品的開發(fā)與利用。

(3) 本試驗(yàn)只研究了一種酶對花椒油樹脂提取的促進(jìn)作用，后期將繼續(xù)考察多種酶復(fù)合后的作用效果，以及所得產(chǎn)物的品質(zhì)及活性。

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ExtractionoptimizationofenzymehydrolysismethodandGC-MSanalysisonoleoresinfromZanthoxylum

Zanthoxylum was used as the material. Combined cellulase hydrolysis with response surface method to optimize the Zanthoxylum oleoresin (Zoleoresin) extraction process. Results showed that the optimum extraction conditions of Zoleoresin as follows: 50% ethanol as extractant, cellulase dosage was 62.3 mg/L, enzymolysis time was 2.3 h, enzymolysis temperature was 50 ℃, liquid ratio was 47.4∶1(mL/g). In this condition, the extraction efficiency of Zoleoresin was 37.22%. A total of 47 compounds were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Main ingredients wereD-limonene, linalool, lauricacid, limonene glycol, alpha-terpineol, ascaridole, citronellyl myristate, xanthoxylin, etc.

cellulase; zanthoxylum oleoresi; extraction efficiency; GC-MS

陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號：2017NY-142)

柴麗琴，女，陜西師范大學(xué)在讀碩士研究生。

田呈瑞(1955—)，男，陜西師范大學(xué)教授，博士。

E-mail：chrtian@snnu.edu.cn

2017—05—24

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.034