寧亞維 - 閆愛紅 - 王世杰 - 王志新 - 李興峰 - 朱 宏 賈英民 -

(1. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2. 石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050221；3. 北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 102488) (1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China; 2. Shijiazhuang Junlebao Dairy Co., Ltd., Shijiazhuang, Hebei 050221, China; 3. Beijing Technology and Business University, School of Food and Chemical Engineering, Beijing 102488, China)

苯乳酸與食品防腐劑聯(lián)合抑菌效果

寧亞維1NINGYa-wei1閆愛紅1YANAi-hong1王世杰2WANGShi-jie2王志新1WANGZhi-xin1李興峰1LIXing-feng1朱 宏2ZHUHong2賈英民3JIAYing-min3

(1. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2. 石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050221；3. 北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 102488) (1.CollegeofBioscienceandBioengineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang,Hebei050018,China; 2.ShijiazhuangJunlebaoDairyCo.,Ltd.,Shijiazhuang,Hebei050221,China; 3.BeijingTechnologyandBusinessUniversity,SchoolofFoodandChemicalEngineering,Beijing102488,China)

以食源性病原菌Escherichiacoli和Listeriamonocytogenes為指示菌，研究了苯乳酸與常用食品防腐劑的聯(lián)合抑菌作用。采用微量二倍稀釋法和棋盤法分別測定苯乳酸與6種防腐劑的最小抑菌濃度及聯(lián)合抑菌指數(shù)，并通過時間—?dú)⒕€進(jìn)一步考察復(fù)配較優(yōu)組合的協(xié)同抑菌效果。結(jié)果顯示：苯乳酸與乳酸鏈球菌素聯(lián)用對E.coli和L.monocytogenes分別表現(xiàn)為無關(guān)和相加作用；苯乳酸與對羥基苯甲酸乙酯聯(lián)用對2株指示菌均為相加作用；與EDTA-Na2和ε-聚賴氨酸聯(lián)用對2株指示菌均為無關(guān)作用；苯乳酸分別與苯甲酸鈉和山梨酸鉀聯(lián)用對E.coli均表現(xiàn)為協(xié)同作用，對L.monocytogenes均表現(xiàn)為相加作用。苯乳酸分別與苯甲酸鈉和山梨酸鉀聯(lián)合使用后，苯乳酸使用劑量降低75%，苯甲酸鈉和山梨酸鉀的使用劑量均可以降低50%。

苯乳酸；食品防腐劑；協(xié)同抑菌

苯乳酸(Phenyllactic acid，PLA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型天然抑菌物質(zhì)，存在于蜂蜜[1]、酸面團(tuán)[2]、泡菜[3]等食品中，可由乳酸菌代謝產(chǎn)生[2,4]。苯乳酸具有廣譜抑菌性，不僅能夠抑制革蘭氏陽性菌(如Staphylococcusaureus、Listeriamonocytogenes)和革蘭氏陰性菌[5-6](如Escherichiacoli、Salmoellaenterica、Providenciaatuartii、Klebsiellaoxytoca)，而且能夠有效抑制多種真菌[7](如Colletotrichumgloeosporioides、Aspergillusflavus、Penicilliumexpansum、Botrytiscinerea等)。此外，苯乳酸具有溶解性好、易于在食品體系中擴(kuò)散、酸與熱穩(wěn)定性高[5]等優(yōu)點(diǎn)。然而苯乳酸的抑菌效力較低，如對細(xì)菌的最小抑菌濃度為1.25～5.00 mg/mL，對真菌的最小抑菌濃度為5～10 mg/mL[8]，較Nisin、ε-聚賴氨酸等生物防腐劑對應(yīng)的最小抑菌濃度高數(shù)十倍。因此苯乳酸作為生物防腐劑使用價格相對較高，限制了其商業(yè)化應(yīng)用。

“柵欄技術(shù)”在食品防腐劑的應(yīng)用，通常是通過使用少量、多種防腐劑以達(dá)到良好防腐效果。多項研究表明防腐劑之間存在協(xié)同抑菌效應(yīng)。如Liu等[9]研究了ε-聚賴氨酸與Nisin的聯(lián)合抑菌作用，結(jié)果表明二者聯(lián)合作用于E.coli、B.subtillis和S.aureus均表現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用；Manalh?es等[10]研究了鼠李糖脂與Nisin對L.monocytogenes的協(xié)同作用，研究結(jié)果顯示鼠李糖脂與Nisin聯(lián)用可分別降低2種抑菌劑的使用濃度；高玉榮等[11]研究了納他霉素與山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸、硝酸鈉和脫氫乙酸鈉5種化學(xué)防腐劑的聯(lián)合抑菌效果，發(fā)現(xiàn)納他霉素與除苯甲酸鈉之外的4種防腐劑之間存在協(xié)同抑菌作用；莫樹平等[12]研究了ε-聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素和那他霉素三者復(fù)配對食品中常見的腐敗菌與致病菌的抑制效果，結(jié)果表明生物防腐劑的聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng)ε-聚賴氨酸的抑菌效果。因此，通過多種防腐劑的聯(lián)用可以減少單一防腐劑的添加量，降低成本，提高食品安全性。

本研究擬以常見食源性病原菌大腸桿菌(E.coliATCC 44752)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes10403s)為指示菌，考察了苯乳酸與常用食品防腐劑山梨酸鉀、苯甲酸鈉等的聯(lián)合抑菌效果，以期為苯乳酸與防腐劑在食品防腐中的聯(lián)合使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

E.coliATCC 44752和L.monocytogenes10403s：河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實驗室保藏。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

苯乳酸：純度98%，美國Sigma公司；

苯甲酸鈉：純度99.9%，西隴化工股份有限公司；

山梨酸鉀：純度99.9%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

EDTA-Na2：純度99%，天津博迪化工股份有限公司；

對羥基苯甲酸乙酯：純度99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

Nisin：≥900 IU/mg，上海麥克林生化科技有限公司；

ε-聚賴氨酸：生物試劑，美國AMRESCO公司；

TSB：生物試劑，北京索萊寶科技有限公司；

NB：生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計：Evolution 220型，美國Thermo公司；

酶標(biāo)儀：SpectraMax Plus 384型，美國Molecular Devices公司；

恒溫?fù)u床：ZHWY型，上海智城分析儀器制造公司；

恒溫培養(yǎng)箱：ZSD-A1160型，上海智城分析儀器制造公司；

超凈臺：ZHJH-C110913型，上海智城分析儀器制造公司。

1.4 方法

1.4.1 最小抑菌濃度 參照Wiegand等[13]的方法采用二倍稀釋法測定苯乳酸及6種食品防腐劑的最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。向無菌96孔板的前11列中加入滅菌培養(yǎng)基，食品防腐劑從第1～10列依次進(jìn)行二倍梯度稀釋；第11列不加入食品防腐劑，作為陽性對照；第12列只加入培養(yǎng)基，作為陰性對照；最后每孔加入等體積的指示菌，終濃度約為5×105CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h，用SpectraMax Plus 384酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

1.4.2 聯(lián)合抑菌作用 根據(jù)各防腐劑的MIC值，參考Segal等[14]的方法略作修改進(jìn)行聯(lián)合抑菌活性測定。用微量移液器沿?zé)o菌96孔微孔板的X軸方向(從左到右)在第2～8列每列孔中依次加入8倍 MIC至1/8 MIC的苯乳酸(A)；同樣，沿Y軸方向(從上到下)在第B～F行每行孔中加入8倍MIC至1/8 MIC的食品防腐劑(B)；最終得到A(2倍MIC至1/32 MIC)× B(1/32 MIC至2倍MIC)49種聯(lián)用組合，第1列和第A行分別為單獨(dú)加入A/B的對照組；然后加入1.0×106CFU/mL的菌懸液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

通過計算部分抑菌濃度指數(shù)(Fractional Inhibitory Concentration Index，F(xiàn)ICI)判斷協(xié)同作用效果，計算方法為：

FICI=FICA+FICB=MICA聯(lián)用/MICA單獨(dú)+MICB聯(lián)用/MICB單獨(dú)，

(1)

式中：

FICI——苯乳酸與食品防腐劑聯(lián)用時的部分抑菌濃度指數(shù)；

FICA——苯乳酸和食品防腐劑聯(lián)合使用時苯乳酸的部分抑菌濃度指數(shù)；

FICB——苯乳酸和食品防腐劑聯(lián)合使用時食品防腐劑的部分抑菌濃度指數(shù)；

MICA聯(lián)用——苯乳酸和食品防腐劑聯(lián)合使用時苯乳酸的MIC，mg/mL；

MICA單獨(dú)——苯乳酸單獨(dú)使用時的MIC，mg/mL；

MICB聯(lián)用——苯乳酸和食品防腐劑聯(lián)合使用時食品防腐劑的MIC，mg/mL；

MICB單獨(dú)——食品防腐劑單獨(dú)使用時的MIC，mg/mL。

當(dāng)FICI≤0.5時，為協(xié)同作用；當(dāng)0.52時，為拮抗作用。

1.4.3 時間—?dú)⒕€ 以棋盤法試驗結(jié)果作為參考，進(jìn)一步考察了苯乳酸與苯甲酸鈉和山梨酸鉀較優(yōu)組合下的聯(lián)合抑菌效果。將菌懸液濃度調(diào)至1.0×106CFU/mL分別加入含有苯乳酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀以及苯乳酸和苯甲酸鈉、山梨酸鉀兩兩混合培養(yǎng)液的試管中，使菌懸液終濃度為5×105CFU/mL。將上述含有防腐劑的菌懸液于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0，2，4，6，9，12，24 h取樣，并采用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。以時間為橫坐標(biāo)，lg CFU/mL為縱坐標(biāo)繪制時間—?dú)⒕€。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度

分別測定了苯乳酸和6種常見食品防腐劑對E.coli和L.monocytogenes的最小抑菌濃度。結(jié)果表明，苯乳酸對E.coli的MIC值為1.25 mg/mL，對L.monocytogenes的MIC值為2.25 mg/mL，與袁景環(huán)等[8]的研究結(jié)果一致；ε-聚賴氨酸對2株指示菌的抑菌效果強(qiáng)于苯乳酸等其余6種防腐劑，其對E.coli和L.monocytogenes的MIC值分別為0.156 0，0.007 8 mg/mL，ε-聚賴氨酸對L.monocytogenes的MIC值顯著低于對E.coli的，與Geornaras等[15]的研究結(jié)果一致；其次是Nisin，但其只能夠抑制革蘭氏菌L.monocytogenes，其MIC值為0.25 mg/mL，而對革蘭氏陰性菌E.coli無抑菌作用；EDTA-Na2對2株指示菌的MIC值相同均為0.625 mg/mL；對羥基苯甲酸乙酯對E.coli和L.monocytogenes的MIC值分別為0.625，1.000 mg/mL；山梨酸鉀對E.coli和L.monocytogenes的MIC值分別為12.5，28.0 mg/mL；苯甲酸鈉對E.coli和L.monocytogenes的MIC值分別為10.5，25.0 mg/mL。上述結(jié)果表明，各防腐劑間抑菌效應(yīng)差異顯著，ε-聚賴氨酸和EDTA-Na2對2株指示菌抑制效果均較好；而食品中常用的化學(xué)防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀對細(xì)菌的抑制效果則較差。防腐劑的抑菌效果差異同其抑菌作用機(jī)制相關(guān)，而不同作用機(jī)制的防腐劑間聯(lián)合使用，更易于發(fā)揮協(xié)同增效抑菌作用。因此，有必要考察苯乳酸與上述防腐劑的聯(lián)合使用效應(yīng)，以篩選能同苯乳酸發(fā)揮協(xié)同抑菌作用的防腐劑。

2.2 聯(lián)合抑菌作用

通過微量棋盤法考察了苯乳酸與食品防腐劑的聯(lián)合抑菌效應(yīng)，結(jié)果見表1。對于L.monocytogenes本研究所選防腐劑均不能與苯乳酸聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同抑菌作用，對于E.coli苯乳酸分別與苯甲酸鈉和山梨酸鉀聯(lián)用具有協(xié)同抑菌作用。山梨酸鉀和苯甲酸鈉主要用于抑制霉菌和酵母菌，對細(xì)菌抑制作用相對較弱。而苯乳酸與苯甲酸鈉聯(lián)用后，苯乳酸的濃度降為單獨(dú)使用時的1/2～1/4，苯甲酸鈉的濃度則降為單獨(dú)使用時的1/2～1/16，苯甲酸鈉的使用量由單獨(dú)使用時的10.50 mg/mL 降為0.65 mg/mL，使其使用量低于食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)最大使用量1 g/kg(GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》)，可作為抑制細(xì)菌的防腐劑用于食品加工中。因此，苯乳酸與苯甲酸鈉聯(lián)用可以擴(kuò)大苯甲酸鈉的抑菌譜，降低兩者的使用劑量。同樣，山梨酸鉀與苯乳酸聯(lián)用后，苯乳酸使用量降為單獨(dú)使用時的1/2～1/4，山梨酸鉀使用量降為單獨(dú)使用時的1/2～1/8。上述結(jié)果表明苯乳酸分別與山梨酸鉀和苯甲酸鈉聯(lián)用后，生物防腐劑苯乳酸和化學(xué)防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀使用劑量均顯著降低，因此若將其作為復(fù)合食品防腐劑可顯著降低使用成本，提高使用安全性。

表1 苯乳酸與食品防腐劑聯(lián)合抑菌活性Table 1 Determination of the antibacterial activity of PLA in combination with preservatives

2.3 時間—?dú)⒕€

通過時間—?dú)⒕€對棋盤法選出的復(fù)配較優(yōu)組合的聯(lián)合抑菌效果進(jìn)行考察。由圖1可知，1/4 MIC濃度苯乳酸對E.coli沒有抑菌作用，1/2 MIC濃度苯甲酸鈉作用E.coli24 h后，與對照組相比活菌數(shù)降低了1.69個對數(shù)值，然而二者聯(lián)合作用6 h后，菌落數(shù)降低了3.41個對數(shù)值，表現(xiàn)出顯著抑菌作用；作用9 h后，聯(lián)用組與MIC濃度苯甲酸鈉對E.coli抑菌趨勢基本相同，表明苯乳酸與苯甲酸鈉具有顯著協(xié)同抑菌作用。

由圖2可知，1/4 MIC濃度苯乳酸和1/2 MIC濃度山梨酸鉀分別作用于E.coli均不能抑制其生長。然而1/4 MIC濃度苯乳酸與1/2 MIC濃度山梨酸鉀聯(lián)合作用6 h后，活菌數(shù)降低了3.63個對數(shù)值；聯(lián)合作用24 h后，菌落總數(shù)較初始值沒有顯著增加，表明苯乳酸與山梨酸鉀聯(lián)用可以有效抑制E.coli的生長繁殖。

苯乳酸可增加環(huán)境中氫離子的濃度，山梨酸鉀和苯甲酸鈉的抑菌活性會隨介質(zhì)pH降低而增加，因此苯乳酸可以增強(qiáng)苯甲酸鈉和山梨酸鉀的抑菌作用效果；此外，苯甲酸鈉的作用機(jī)理是抑制微生物細(xì)胞呼吸酶系的活性，尤其能夠阻礙乙酰輔酶A縮合反應(yīng)，從而起到抑菌作用；山梨酸鉀的抑菌機(jī)制在于它能與微生物細(xì)胞中酶的巰基形成共價鍵，使酶喪失活性，破壞許多重要酶系[16]；苯甲酸鈉和山梨酸鉀順利進(jìn)入微生物細(xì)胞是發(fā)揮抑菌作用的前提，苯乳酸能夠破壞細(xì)菌的屏障結(jié)構(gòu)——細(xì)胞壁[5]，從而有利于苯甲酸鈉和山梨酸鉀進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑菌作用。因此，苯乳酸與山梨酸鉀和苯甲酸鈉聯(lián)合使用具有協(xié)同抑菌作用。

圖1 苯乳酸與苯甲酸鈉聯(lián)用對E. coli的時間—?dú)⒕€

Figure 1 Time-kill curve of PLA in combination with sodium benzoate againstE.coli

圖2 苯乳酸與山梨酸鉀聯(lián)用對E. coli的時間—?dú)⒕€

Figure 2 Time-kill curve of PLA in combination with potassium sorbate againstE.coli

3 結(jié)論

本試驗研究了苯乳酸與常用食品防腐劑的聯(lián)合抑菌效果，其中苯乳酸與所選用的6種防腐劑聯(lián)用對L.monocytogenens均不產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用，而苯乳酸與2種化學(xué)防腐劑——苯甲酸鈉和山梨酸鉀聯(lián)用對E.coli具有協(xié)同增效作用，F(xiàn)ICI分別為0.312，0.375；聯(lián)用后，苯乳酸使用劑量降低75%，苯甲酸鈉和山梨酸鉀均降低50%。本研究篩選了能與苯乳酸聯(lián)合使用發(fā)揮協(xié)同抑菌作用的食品防腐劑，可為苯乳酸在食品防腐中的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)；下一步工作將考察苯乳酸與常用食品防腐劑聯(lián)用對食品基質(zhì)的保鮮防腐效應(yīng)。

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Studyonantibacterialactivityofphenyllacticacidcombined
withfoodpreservatives

The antibacterial activity of phenyllactic acid (PLA) combined with food preservatives against foodborne pathogensEscherichiacoliandListeriamonocytogeneswas studied. The minimal inhibitory concentrations were determined by broth micro-dilution method and the interaction of PLA with food preservatives was determined using the checkerboard test. Furthermore, the synergistic effect of the optimized combination was evaluated through the time-kill assay. Results showed that PLA combined with nisin showed indifference effect againstE.coliand additive effect againstL.monocytogenes. The interaction of PLA and ethylp-hydroxybenzoate showed an additive effect againstE.coliandL.monocytogenes. PLA combined with EDTA-Na2orε-poly-L-lysine was observed indifference againstE.coliandL.monocytogenes. PLA combined with sodium benzoate or potassium sorbate exhibited synergistic effect againstE.coli, and additive effect againstL.monocytogenes. The dosage of PLA was decreased 75%, and that of sodium benzoate or potassium sorbate reduced 50%, when PLA combined with sodium benzoate or potassium sorbate againstE.coli.

phenyllactic acid; food preservatives; synergistic antibacterial effect

河北省杰出青年基金(編號：C2016208142)；河北省自然科學(xué)基金(編號：C2016208150)；國家自然科學(xué)基金(編號：31401653)

寧亞維，女，河北科技大學(xué)副教授，博士。

賈英民(1961—)，男，北京工商大學(xué)教授，博士。

E-mail: jiayingmin@btbu.edu.cn

2017—03—23

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.025