李人宇 - 黃金狀 - 李詠梅 - 周家宏 -

(1. 連云港師范高等專科學校，江蘇 連云港 222006；2. 淮海工學院化學工程學院，江蘇 連云港 222005;3. 南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210023) (1. Lianyungang Teachers College, Lianyungang, Jiangsu 222006, China; 2. School of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang, Jiangsu 222005, China; 3. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210023, China)

番紅花紅T分光光度法測定啤酒酵母中鉻含量

李人宇1LIRen-yu1黃金狀1HUANGJin-zhuang1李詠梅2LIYong-mei2周家宏3ZHOUJia-hong3

(1. 連云港師范高等專科學校，江蘇 連云港 222006；2. 淮海工學院化學工程學院，江蘇 連云港 222005;3. 南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210023) (1.LianyungangTeachersCollege,Lianyungang,Jiangsu222006,China; 2.SchoolofChemicalEngineering,HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang,Jiangsu222005,China; 3.CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing,Jiangsu210023,China)

采用微波消解樣品，在堿性條件下用高錳酸鉀將鉻(Ⅲ)轉(zhuǎn)化為鉻(VI)，并利用在聚乙烯醇與磷酸介質(zhì)中，鉻(VI)與碘化鉀、番紅花紅T室溫下會發(fā)生顯色反應的原理，建立了一種測定啤酒酵母中鉻含量的新方法。研究結(jié)果表明：在最佳測定條件下，該方法的檢測限為14.55 μg/L，相對標準偏差為1.3%～2.1%(n=5)，樣品加標回收率為97.9%～101.7%，且常見共存離子不影響測定結(jié)果。

分光光度法；鉻；番紅花紅T；啤酒酵母

鉻(Ⅲ)是人體必需微量元素，參與糖、脂類和蛋白質(zhì)的代謝，具有維持耐糖量于正常水平、促進生長發(fā)育的功能。人體缺鉻(Ⅲ)會引發(fā)糖尿病、冠心病、兒童發(fā)育不良等疾病，但鉻(Ⅲ)過量又會危害人體健康[1-2]。啤酒酵母中富含三價有機鉻，人體吸收利用率高，是天然鉻(Ⅲ)的良好來源[3]，因其具有品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量大、經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)勢，被廣泛應用于食品工業(yè)中[4]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計：UV-2550型，日本島津公司；

超級恒溫水?。篠YC-15C型，南京桑力電子設備廠；

酸度計：pHS-3C型，上海精密科學儀器有限公司；

微波消解儀：ETHOS E型，意大利Milestone公司；

石英亞沸高純水蒸餾器：SYZ-B型，宜興新建石英玻璃器廠；

重鉻酸鉀、磷酸、碘化鉀、聚乙烯醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

番紅花紅T：生物染色劑，上海靈錦精細化工有限公司；

啤酒酵母粉：食品級，亳州市保華藥業(yè)有限公司；

試驗用水：二次蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 鉻(VI)標準儲備液的配制 稱取0.282 9 g經(jīng)105 ℃烘干2 h的基準試劑重鉻酸鉀，用水溶解并定容至1 L，即得100.0 μg/mL的鉻(VI)標準儲備液，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時稀釋成5.0 μg/mL的標準溶液。

1.2.2 樣品處理 稱取0.5 g(精確到0.000 1 g)啤酒酵母粉于消解罐，加入6 mL硝酸和2 mL雙氧水，置于微波消解儀中，在5 min內(nèi)由室溫升至120 ℃并恒溫5 min，再在5 min內(nèi)升溫至160 ℃并恒溫10 min，然后在5 min內(nèi)升溫至180 ℃并恒溫10 min，消解完畢得透明溶液。冷卻后取出消解罐，在140～160 ℃電熱板上趕酸至0.5～1.0 mL。冷卻后將消化液轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入40 mL水，用2 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至12，滴加20 g/L高錳酸鉀溶液至溶液呈紫紅色，在電爐上加熱煮沸20 min，期間若紫紅色褪去，應及時滴加高錳酸鉀溶液。加熱完畢后立即滴加95%乙醇使紫紅色褪去，搖勻，用1 mol/L硝酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，趁熱過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，并用少量熱水洗滌3次，洗滌液并入容量瓶中，加水定容至刻度，即得待測樣液。

1.2.3 測定方法 取2支25 mL具塞比色管，其中一支依次加入4 mol/L磷酸溶液、一定量鉻(VI)標準溶液或待測樣液、0.1 mol/L碘化鉀溶液、10 g/L聚乙烯醇溶液、5.0×10-4mol/L 番紅花紅T溶液，用水定容至25 mL，搖勻；另一支為試劑空白同時配制，僅不加鉻(VI)。避光反應完全后，以試劑空白為參比，用1 cm比色皿，用分光光度計在波長460 nm下測量離子締合物體系的吸光度。

1.2.4 測定波長的選擇 按1.2.3的方法分別掃描試劑空白(以水為參比)和離子締合物體系(以試劑空白為參比)的吸收光譜，根據(jù)光譜圖的最大吸收峰確定測定波長。

1.2.5 測定條件的選擇 以影響反應的主要因素反應介質(zhì)的選擇及用量、碘化鉀用量、番紅花紅T用量、表面活性劑的選擇及用量、反應溫度和反應時間為考察因素，以吸光度值為考察指標，分別進行單因素試驗，按1.2.3的方法在1.2.4中的測定波長下測量吸光度，優(yōu)化出適宜的測定條件。其中對于反應介質(zhì)、表面活性劑的選擇按以下步驟操作：分別考察鹽酸、硫酸和磷酸3種介質(zhì)，根據(jù)吸光度值選擇反應介質(zhì)，繼而考察其濃度，加入1，4，10 mol/L的介質(zhì)溶液各5 mL，再根據(jù)吸光度值確定介質(zhì)適宜濃度，然后按以下單因素試驗方法確定最佳用量。分別考察8種常用表面活性劑，其濃度為10 g/L(或10 mL/L)，用量為2 mL，根據(jù)吸光度值選擇表面活性劑，再按以下單因素試驗方法確定最佳用量。單因素試驗步驟為：對于反應條件適宜濃度介質(zhì)溶液3.0 mL、0.1 mol/L 碘化鉀溶液3.0 mL、10 g/L(或10 mL/L)適宜表面活性劑溶液2.0 mL、5.0×10-4mol/L番紅花紅T溶液4.0 mL，反應溫度20 ℃，避光反應時間15 min，逐一改變反應條件，固定其他反應條件不變進行試驗，根據(jù)吸光度值確定最佳反應條件。

1.2.6 標準曲線的繪制 向6個25 mL比色管中，分別準確加入0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL鉻(VI)標準溶液，使鉻(VI)質(zhì)量濃度各為0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μg/mL，按1.2.3的方法在1.2.5的條件下測定。以吸光度為縱坐標，鉻(VI)質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.7 共存離子的影響 在25 mL比色管中加入2.0 mL鉻(VI)標準溶液，按1.2.3的方法在1.2.5的條件下測定吸光度；另取若干支25 mL比色管，除了加入2.0 mL鉻(VI)標準溶液外，分別加入一定量待考察的共存離子，再同前述步驟測定吸光度，并計算兩次吸光度測定值的相對誤差，判斷共存離子是否干擾鉻(VI)的測定[16]。

1.2.8 樣品中鉻含量的測定 取2.0 mL 1.2.2待測樣液于25 mL比色管中，按1.2.3的方法在1.2.5的條件下測定。根據(jù)樣品的吸光度及標準曲線線性回歸方程，求得樣品中鉻含量。測定結(jié)果與GB 5009.123—2014中的原子吸收光譜法(AAS)對照。同時做加標回收試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

掃描440～540 nm吸收光譜見圖1。試劑空白的最大吸收峰位于521 nm；鉻(VI)、碘化鉀和番紅花紅T反應生成離子締合物的最大吸收峰位于460 nm。故選擇測定波長460 nm 定量檢測鉻(VI)的含量。

2.2 測定條件的選擇

2.2.1 反應介質(zhì) 分別考察了鹽酸、硫酸和磷酸介質(zhì)對吸光度的影響。結(jié)果表明，磷酸介質(zhì)的靈敏度最高。故選用磷酸介質(zhì)，改變其濃度進一步試驗，發(fā)現(xiàn)4 mol/L磷酸效果最佳。若使用1 mol/L磷酸，基本不反應，吸光度幾乎為0；若使用10 mol/L磷酸，反應過快體系不穩(wěn)定，吸光度數(shù)值變化大，造成測定不準確。當4 mol/L磷酸溶液用量為3.0 mL，吸光度最大(見圖2)。因此，后續(xù)試驗加入4 mol/L的磷酸溶液3.0 mL。

1. 試劑空白 2. 離子締合物圖1 吸收光譜Figure 1 Absorption spectra

圖2 磷酸用量對吸光度的影響Figure 2 Effect of phosphoric acid volume on absorbance

2.2.2 碘化鉀溶液(0.1 mol/L)用量 由圖3可知，當?shù)饣浫芤杭尤肓繛?.0 mL時，吸光度最大。因此碘化鉀溶液用量選用3.0 mL。

圖3 碘化鉀用量對吸光度的影響Figure 3 Effect of potassium iodide volume on absorbance

2.2.3 番紅花紅T溶液(5×10-4mol/L)用量 由圖4可知，當加入4.0 mL番紅花紅T溶液時，吸光度最大。因此番紅花紅T溶液用量選用4.0 mL。

圖4 番紅花紅T用量對吸光度的影響Figure 4 Effect of safranine T volume on absorbance

2.2.4 表面活性劑 由表1可知，與未加表面活性劑相比，加入聚乙烯醇，吸光度顯著增大，增敏效果明顯優(yōu)于其他表面活性劑，此外其增穩(wěn)效果也好，吸光度數(shù)據(jù)更穩(wěn)定，有利于準確測定。加入β-環(huán)糊精或阿拉伯樹膠，吸光度增幅較小，靈敏度略有提高。加入其他表面活性劑，吸光度均減小，靈敏度不同程度降低。故選用10 g/L聚乙烯醇作增敏增穩(wěn)劑。由圖5可知，聚乙烯醇適宜用量為2.0 mL。

表1 表面活性劑對吸光度的影響Table 1 Effect of surfactant on absorbance

圖5 聚乙烯醇用量對吸光度的影響Figure 5 Effect of polyvinyl alcohol volume on absorbance

2.2.5 反應溫度 由圖6可知，溫度為5 ℃時反應較容易發(fā)生，吸光度較大；溫度為10 ℃時能反應完全，吸光度達到最大，溫度升至40 ℃，吸光度基本不變；溫度升至50～100 ℃時，吸光度明顯減小，這是由離子締合物的穩(wěn)定性降低造成的?？紤]測定的靈敏度和操作的簡便性，選擇室溫下反應。

圖6 反應溫度對吸光度的影響Figure 6 Effect of reaction temperature on absorbance

2.2.6 反應時間與穩(wěn)定性 由圖7可知，反應初期，吸光度逐漸增大；反應15 min時，吸光度達到最大，在聚乙烯醇增穩(wěn)作用下能保持175 min基本不變(相對誤差<-5%)。說明鉻(VI)、碘化鉀和番紅花紅T的顯色反應在15 min內(nèi)即可完成，生成的離子締合物能穩(wěn)定維持175 min。故選擇反應時間為15 min。本法的反應時間和穩(wěn)定性均優(yōu)于傳統(tǒng)的二苯碳酰二肼分光光度法[7, 9-10]，反應時間縮短一半，穩(wěn)定時間延長1.9倍。

圖7 反應時間對吸光度的影響Figure 7 Effect of reaction time on absorbance

2.3 標準曲線

由圖8可知，鉻(VI)質(zhì)量濃度在0.0～0.5 μg/mL時，符合朗伯—比爾定律，線性回歸方程為A=1.326ρ-0.008 4，r=0.999 5，表觀摩爾吸光系數(shù)ε460=6.90×104L/(mol·cm)。平行測定11次試劑空白A0，得標準偏差為6.43×10-3，該計算方法的檢出限(3s/k)為14.55 μg/L。

2.4 干擾試驗

圖8 標準曲線Figure 8 Standard curve

2.5 樣品分析

由表2可知，番紅花紅T分光光度法測定結(jié)果與原子吸收光譜法[5]一致，且相對標準偏差為1.3%～2.1%，表明該方法準確可靠，重現(xiàn)性好。

由表3可知，平均回收率為97.9%～101.7%，表明該方法測定結(jié)果準確。

表2 啤酒酵母中鉻含量測定結(jié)果Table 2 Results for the determination of chromium in beer yeast (n=5)

表3 回收試驗結(jié)果Table 3 Results of test for recovery (n=5)

3 結(jié)論

本試驗建立了一種適用于啤酒酵母中鉻含量測定的番紅花紅T分光光度法，該方法快速，有較高的準確度、靈敏度和精密度，符合常規(guī)檢測要求。與傳統(tǒng)的二苯碳酰二肼分光光度法相比，該方法避免使用有毒溶劑，反應時間縮短、提高樣品分析速度，穩(wěn)定可持續(xù)測定時間明顯延長、能保證測定準確度。

[1] 楊克敵, 張?zhí)鞂? 王愛國, 等. 微量元素與健康[M]. 北京: 科學出版社, 2003: 139-148.

[2] 吳茂江. 鉻與人體健康[J]. 微量元素與健康研究, 2014, 31(4): 72-73.

[3] 傅永懷. 微量元素與臨床[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 1997: 64-67.

[4] 吳振, 江建梅, 舒媛, 等. 啤酒酵母及其衍生品的應用研究進展[J]. 中國釀造, 2014, 33(10): 10-13.

[5] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 5009.123—2014 食品安全國家標準 食品中鉻的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2015.

[6] BOUTORABI L, RAJABI M, BAZREGAR M, et al. Selective determination of chromium(VI) ions using in-tube electro-membrane extraction followed by flame atomic absorption spectrometry[J]. Microchemical Journal, 2017, 132(5): 378-384.

[7] 李鑫, 張東雷, 張越, 等. 多方法測定明膠中鉻含量[J]. 食品與機械, 2012, 28(4): 100-103.

[8] 陳意光, 阮文紅, 羅東輝, 等. 紫外分光光度法測定食品模擬物中六價鉻和鋁[J]. 食品與機械, 2012, 28(3): 65-67.

[9] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會. GB/T 13088—2006 飼料中鉻的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2006.

[10] 李曉燕, 朱櫻, 歐陽泉根, 等. 二苯碳酰二肼光度法測定微量鉻的改進[J]. 理化檢驗: 化學分冊, 2016, 52(6): 729-731.

[11] 高向陽, 高遒竹, 張小燕, 等. 微波消解—流動注射化學發(fā)光法快速測定調(diào)味品中的微量鉻[J]. 中國調(diào)味品, 2016, 41(10): 101-104, 108.

[12] 王征帆. 庫侖分析法測定富鉻酵母中鉻含量研究[J]. 中國調(diào)味品, 2013, 38(8): 102-103, 120.

[13] TIWARI S, DEB M K, SEN B K. Cloud point extraction and diffuse reflectance-Fourier transform infrared spectroscopic determination of chromium(VI): A probe to adulteration in food stuffs[J]. Food Chemistry, 2017, 221(4): 47-53.

[14] 任華莉, 李琪琳, 曾文法. 離子色譜法測定六價鉻的研究進展[J]. 廣東化工, 2016, 43(9): 239-240.

[15] 楊曉穎, 丁春光, 閆慧芳. 電感耦合等離子體—質(zhì)譜法檢測全血中鉻[J]. 中國職業(yè)醫(yī)學, 2014, 41(2): 208-210.

[16] 龐向東, 江虹, 張琴, 等. 三波長分光光度法快速測定青蘋果中的蘋果酸[J]. 食品與機械, 2016, 32(12): 79-82.

SpectrophotometricdeterminationofchromiumcontentinbeeryeastwithsafranineT

A new spectrophotometric method for determination of chromium content was developed. In both polyvinyl alcohol and phosphoric acid medium, chromium (VI) could react with potassium iodide and safranine T at room temperature, leading to coloration after microwave digestion sample and oxidation of chromium (III) to chromium (VI) with potassium permanganate under alkaline conditions. The effects of the factors such as absorption spectra, reaction conditions and coexisting ions on the reaction were discussed. The results showed that under the optimum determination conditions, Beer-Lambert law was obeyed in the mass concentration range of 0.0～0.5 μg/mL for chromium with the maximum absorption peak at 460 nm. The detection limit was 14.55 μg/L. The apparent molar absorption coefficient was 6.90×104L/(mol·cm). This method had been applied to the determination of chromium content in beer yeast. The results obtained by this method agreed well with those obtained by atomic absorption spectrometry. RSD was in the range of 1.3%～2.1% (n=5), and recovery was in the range of 97.9%～101.7%. Moreover, a large number of common coexisting ions did not affect the determination.

spectrophotometry; chromium; safranine T; beer yeast

2015年度國家自然科學基金面上項目(編號：21571105)；2014年江蘇省高?！扒嗨{工程”資助項目；2015年度連云港市第五期“521工程”科研項目(編號：201529)；2015年江蘇省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(編號：201511585003Y)

李人宇(1972—)，男，連云港師范高等?？茖W校教授，博士。E-mail: lirenyu518@163.com

2017—05—27

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.015