李友梅，馮曉麗，陳淑華，馬艷婷，陳紅艷

(上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院，上海200090)

缺血性腦卒中患者外周血血管內(nèi)皮祖細(xì)胞水平變化及意義

李友梅，馮曉麗，陳淑華，馬艷婷，陳紅艷

(上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院，上海200090)

目的探討缺血性腦卒中患者外周血血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)水平的變化及意義。方法選擇缺血性腦卒中患者63例作為健康觀察組、體檢健康者20例作為健康對(duì)照組。分別于患者發(fā)病第1、7、14、21天用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血EPCs比例，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)水平。結(jié)果發(fā)病第1、7、14天，觀察組外周血EPCs比例較健康對(duì)照組高(P均<0.05)，發(fā)病第21天兩組外周血EPCs比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。發(fā)病第1、7、14天，觀察組血清VEGF、SDF-1水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，發(fā)病第21天兩組血清VEGF、SDF-1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論缺血性腦卒中患者發(fā)病第1天外周血EPGs數(shù)量減少，隨后逐漸增多，至第21天恢復(fù)正常；EPGs數(shù)量變化可反映缺血性腦卒中患者病情發(fā)展。

缺血性腦卒中；血管內(nèi)皮祖細(xì)胞；旁分泌功能

動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成是缺血性腦卒中的主要病因[1]。缺血性腦卒中可引起栓塞部位末梢的腦血管內(nèi)皮因缺氧發(fā)生壞死和脫落。近年研究顯示，存在于體循環(huán)中的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)受損傷的腦血管內(nèi)皮[2]。在健康人外周血中EPCs數(shù)量很少并在小范圍內(nèi)波動(dòng)，當(dāng)血管內(nèi)皮完整性遭到破壞時(shí)，EPCs的數(shù)量會(huì)發(fā)生改變。當(dāng)缺血缺氧引起腦血管內(nèi)皮受損后，骨髓中的EPCs動(dòng)員并釋放到外周血中。目前對(duì)缺血性腦卒中患者外周血EPCs數(shù)量變化報(bào)道不一[3～5]。本研究對(duì)缺血性腦卒中患者在發(fā)病后不同時(shí)間EPCs數(shù)量的變化進(jìn)行觀察，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月～2017年4月本院收治的缺血性腦卒中患者63例(觀察組)，均符合腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，經(jīng)頭顱CT或MRI檢查確診。其中男41例、女22例，年齡(61.4±3.5)歲，發(fā)病至入院時(shí)間<24 h。入選標(biāo)準(zhǔn)：入院前均有不同程度的偏癱和意識(shí)障礙等神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀，排除入院后行溶栓治療的患者?；颊呷朐汉蠼o予阿托伐他汀、拜阿司匹林、血栓通進(jìn)行治療；治療后參照《腦卒中患者臨床神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)》，神經(jīng)功能缺損評(píng)分減少18%～45%者納入研究。同期選擇體檢健康者20例作為健康對(duì)照組，男13例、女7例，年齡(58.8±4.1)歲，無高血壓、糖尿病、心肌梗死和冠心病等病史。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 外周血EPCs檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。分別于患者發(fā)病第1、7、14、21天取末梢血10 mL，加入等體積的Percoll分離液(購于美國GE公司)，放入50 mL離心管，1 500 r/min離心20 min，吸取液面交界處的有核細(xì)胞，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，使用PBS稀釋后1 500 r/min離心5 min，棄上清液，再加入PBS 10 mL重復(fù)離心清洗1次。重懸細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞為1×106個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液200 μL，分別加入EPCs因子CD34-PE、VEGRF-2-APC流式抗體(購于美國BD公司)各5 μL，避光室溫孵育20 min后于流式細(xì)胞儀(美國BD公司)上檢測CD34和VEGRF-2的表達(dá)。采用Cell Quest軟件分析結(jié)果，計(jì)算CD34、VEGRF-2表達(dá)均為陽性的細(xì)胞(EPCs)占有核細(xì)胞的比例。

1.3 血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法。分別于患者發(fā)病第1、7、14、21天取末梢血1 mL，放入1.5 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min。抽取血清5 μL加入495 μL的樣品稀釋液中，標(biāo)準(zhǔn)品取500 μL(不需要使用稀釋液)。取出反應(yīng)板，在每一孔中加入稀釋后的血清10 μL，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組中加入標(biāo)準(zhǔn)品原液10 μL，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。加樣結(jié)束后，每孔分別加入VEGF、SDF-1抗體100 μL，室溫下混勻，置于30 ℃的干燥箱內(nèi)靜置30 min。取出后棄上清液，加入辣根過氧化物酶100 μL，避光保存10 min，加入終止液并用FACSCalibur 550酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)測波長450 nm處檢查各孔的光密度值，通過實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算樣本濃度。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血EPCs水平比較 發(fā)病第1、7、14天觀察組外周血EPCs比例較健康對(duì)照組高(P均<0.05)，發(fā)病第21天兩組外周血EPCs比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組外周血EPCs比例比較

2.2 兩組血清VEGF、SDF-1水平比較 發(fā)病第1、7、14天觀察組血清VEGF、SDF-1水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，發(fā)病第21天兩組血清VEGF、SDF-1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 兩組血清VEGF、SDF-1水平比較

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05。

3 討論

EPCs是一種具備分化潛能的前體細(xì)胞，在一定條件下可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。在生理狀態(tài)下，EPCs存在于末梢血循環(huán)中的量很少，其主要參與維持更新或修補(bǔ)受損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞，使機(jī)體內(nèi)的血管生成維持在一定的動(dòng)態(tài)平衡[7]。但在病理狀態(tài)下，EPCs可從骨髓動(dòng)員到外周血中，歸巢至損傷的組織，參與血管的形成，并可分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與缺血組織的修復(fù)[8]。多種心血管疾病(冠心病、急性心肌梗死、高血壓、高膽固醇血癥、缺血性腦卒中等)患者EPCs在外周血中的數(shù)量均發(fā)生變化[9]。研究顯示，缺血性腦卒中患者體內(nèi)EPCs數(shù)量減少，且可將EPCs作為評(píng)價(jià)心血管風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物之一[10]；同時(shí)也有研究報(bào)道，缺血性腦卒中患者體內(nèi)EPCs的數(shù)量增多，并認(rèn)為EPCs數(shù)量與缺血性腦卒中患者的預(yù)后相關(guān)[11,12]。本研究中缺血性腦卒中患者發(fā)病第1天血清EPCs數(shù)量減少，但隨著病情轉(zhuǎn)歸EPCs數(shù)量逐漸升高并在發(fā)病第21天恢復(fù)正常。

EPCs還可通過旁分泌作用釋放各種細(xì)胞因子，包括VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、SDF-1和基質(zhì)金屬蛋白酶9等。以上細(xì)胞因子對(duì)促進(jìn)EPCs的骨髓動(dòng)員起重要作用[13]，可動(dòng)員EPCs從骨髓進(jìn)入外周血，還可以促進(jìn)EPCs增殖、分化、趨化和歸巢。VEGF是目前已知的誘導(dǎo)EPCs向成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的最重要的細(xì)胞因子，促進(jìn)EPCs的骨髓動(dòng)員、成熟，在EPCs增殖、分化、趨化和歸巢中起至關(guān)重要的作用；SDF-1是一種趨化因子，對(duì)EPCs的趨化作用是其他細(xì)胞因子的10倍。血液中SDF-1水平升高有利于EPCs歸巢，誘發(fā)EPCs與受損內(nèi)皮黏附和血小板聚集，并抑制EPCs凋亡，在診斷和治療心肌缺血性疾病中有重要意義。因此，本研究選取VEGF、SDF-1兩種因子進(jìn)行分析。結(jié)果顯示缺血性腦卒中發(fā)生的第1天，患者血清VEGF、SDF-1水平降低。由于EPCs可直接分泌VEGF和SDF-1，因此EPCs數(shù)量減少后血清VEGF、SDF-1水平下降。隨著缺血性腦卒中患者病情康復(fù)，血清VEGF、SDF-1水平逐漸升高，到發(fā)病第21天恢復(fù)正常。

本研究未將藥物治療作為影響因素加以考慮。EPCs增殖主要受內(nèi)皮損傷和腫瘤因素的影響，當(dāng)機(jī)體內(nèi)發(fā)生外源性的內(nèi)皮損傷和血管生長旺盛需要有內(nèi)皮細(xì)胞補(bǔ)充時(shí)，機(jī)體可通過骨髓動(dòng)員的方式將EPCs動(dòng)員到外周血中，而且數(shù)量極少。藥物對(duì)EPCs骨髓動(dòng)員效果較差，目前用以治療缺血性腦卒中的藥物無動(dòng)員EPCs的相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，通過對(duì)發(fā)病不同時(shí)期缺血性腦卒中患者內(nèi)體的EPCs水平的觀察，發(fā)現(xiàn)EPCs在發(fā)病初期出現(xiàn)明顯下降，此后EPCs比例隨患者康復(fù)逐漸升高并最終恢復(fù)正常。與此同時(shí)，VEGF和SDF-1在缺血性腦卒中患者體內(nèi)的變化也證實(shí)了其變化趨勢與EPCs變化相同?？梢姡珽PCs水平變化可反映缺血性腦卒中患者病情的變化。

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