曹長(zhǎng)春　馬紅霞　楊迪

【摘要】 目的：分析探討經(jīng)介入途徑多療法、多基因聯(lián)合治療肝癌的可行性。方法：選取2013年11月-2016年11月120只大白兔建立肝癌模型，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，每組24只。第一組為單純超液化碘油栓塞組，第二組為超液化碘油+P53（質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物）組，第三組為超液化碘油+TK/CD（濃縮的TK-CD逆轉(zhuǎn)錄病毒上清），第四組為超液化碘油+P53+TK/CD組，第五組僅進(jìn)行生理鹽水治療（對(duì)照組）。對(duì)五組大白兔進(jìn)行常規(guī)的病理檢查和生存期觀測(cè)。結(jié)果：各治療組腫瘤體積增長(zhǎng)率均較對(duì)照組明顯下降，其中第四組腫瘤增長(zhǎng)率抑制最為有效，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組瘤兔介入術(shù)后20～40 d相繼全部死亡，治療組在觀察期內(nèi)自然死亡30只（31.3%），第一組12只（50.0%），第二組9只（37.5%），第三組7只（29.2%），第四組2只（8.3%），五組瘤兔生存情況比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：介入基因療法能夠克服介入治療的副作用，有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)瘤兔的生存時(shí)間。

【關(guān)鍵詞】 介入； 多基因； 肝癌； 可行性

Feasibility Analysis of Combined Therapy and Multiple Gene Therapy for Hepatocellular Carcinoma/CAO Chang-chun，MA Hong-xia，YANG Di.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：029-032

【Abstract】 Objective：To investigate the feasibility of combined therapy and multiple gene therapy in the treatment of liver cancer.Method：A total of 120 rabbits from November 2013 to November 2016 were selected to establish the model of liver cancer，and they were randomly divided into 5 groups according to random number table method，24 cases in each group.The first group was given pure lipiodol embolization group，the second group was given lipiodol+P53（plasmid liposome complex） group，the third group was lipiodol+TK/CD（TK-CD retrovirus supernatant concentration），the fourth group was given lipiodol+P53+TK/CD group，the fifth group only saline the treatment （control group）.Five groups were examined by routine pathology and their lifetime were observed.Result：Compared with the control group，the tumor volume growth rate of the other groups decreased significantly，the fourth group was the most effective，the differences were statistically significant（P<0.05）.Rabbits of the control group had all died after PCI 20-40 days，natural death of the other groups in the observation period was 30 cases（31.3%），the first group was 12 cases（50.0%），the second group 9 cases（37.5%），the third group was 7 cases（29.2%），the fourth group was 2 cases（8.3%），the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Interventional gene therapy can overcome the side effects of interventional therapy，effectively inhibit the growth of tumor and prolong the survival time of tumor rabbits.

【Key words】 Intervention； Polygene； Liver cancer； Feasibility

First-authors address：The First Peoples Hospital of Lanzhou，Lanzhou 730050，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.008

肝癌（HCC）在世界惡性腫瘤中排名第五，是繼胃癌、食管癌之后引起死亡的第三大原因[1]。我國(guó)是肝炎大國(guó)，肝癌的發(fā)病率世界上最高，患者在初期時(shí)癥狀不明顯，大部分患者就診時(shí)已經(jīng)為晚期，主要表現(xiàn)為乏力、黃疸、肝區(qū)疼痛、腹水等，出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)時(shí)大部分已經(jīng)不能夠進(jìn)行手術(shù)，其他的治療方法效果不理想，而且預(yù)后較差[2]。目前治療肝癌的眾多方法中手術(shù)仍舊為首選的方式，復(fù)發(fā)率較高，因此肝癌治療的關(guān)鍵為有效的抑制復(fù)發(fā)[3]，近年來(lái)基因治療的研究取得了很大成果，是繼化療、放療、手術(shù)、免疫治療之后的第五種治療方式，是最具有潛力的方法之一。為了進(jìn)一步研究介入途徑多療法和多基因聯(lián)合治療肝癌的可行性，特選取本院120只大白兔進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 選取2013年11月-2016年11月6～8個(gè)月120只新西蘭大白兔建立肝癌模型，體重2.0～2.5 kg，平均（2.23±0.53）kg，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，每組24只。實(shí)驗(yàn)中使用的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、5-氟胞嘧啶、丙氧鳥(niǎo)苷分別由Gibco公司、Sigma公司、Roch Syntex公司生產(chǎn)，pCMV-p53質(zhì)粒、PA317細(xì)胞、PA317/TK-CD細(xì)胞由山東大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所贈(zèng)。使用的主要設(shè)備為德國(guó)西門子公司的大C臂DSA和64排CT機(jī)。第一組為單純超液化碘油栓塞組，第二組為超液化碘油+P53（質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物）組，第三組為超液化碘油+TK/CD（濃縮的TK-CD逆轉(zhuǎn)錄病毒上清），第四組為超液化碘油+P53+TK/CD組，第五組僅進(jìn)行生理鹽水治療（對(duì)照組）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）通過(guò)擴(kuò)增、提取、純化等制備pCMV-P53質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，將提取后的pCMV-P53質(zhì)粒在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳需要8 V/cm電壓1 h，之后進(jìn)行EB染色30 min并在紫外透視儀下觀察結(jié)果。為保證轉(zhuǎn)染效率最高，本次研究按照P53質(zhì)粒與脂質(zhì)體以1∶2比例混合。（2）制備濃縮的TK-CD逆轉(zhuǎn)錄上清，所用PA317/TK-CD為轉(zhuǎn)染pWZLneoT-KglyCD質(zhì)粒（為TKcDNA及CDcDNA的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體）的穩(wěn)定產(chǎn)病毒細(xì)胞，復(fù)蘇PA317細(xì)胞以及PA317/TK-CD細(xì)胞，將得到純化的PA317/TK-CD細(xì)胞大量培養(yǎng)，傳代。為去除細(xì)胞碎片應(yīng)收集病毒上清液并離心5 min，過(guò)濾后加入多聚賴氨酸至終濃度0.005%，混均，4 ℃孵育5 min。在4 ℃條件下以20 000 r/min離心，2 h后去掉上清，用少量培養(yǎng)基重融病毒顆粒沉淀得到濃縮病毒。（3）細(xì)胞建立大白兔肝癌模型需要將瘤細(xì)胞加重在兔大腿內(nèi)側(cè)腹股溝部位的皮下，使其成瘤并傳代，瘤體長(zhǎng)至1～2 cm3大約需要2周時(shí)間，手術(shù)取出代瘤株并剝落腫瘤包膜，剔除干凈壞死及纖維組織，取魚(yú)肉樣腫瘤組織在平皿剪成1～2 mm3的小塊，用生理鹽水反復(fù)沖洗后作為瘤種備用。（4）對(duì)預(yù)接種兔進(jìn)行麻醉和固定，以倒V樣小弧形切口打開(kāi)腹腔，打開(kāi)部位為劍突下正中，檢出劍突并使用小拉鉤牽引暴露肝臟。用大小合適的瞼板腺囊腫鑷在擬接種的部位夾持肝葉并拖出腹腔外，夾持的力量為阻斷局部血流循環(huán)的力度，調(diào)整并固定螺絲。刺破肝包膜，深度約為4 cm，注入1瘤塊后封閉窗口，封閉可使用小塊的明膠海綿并在表面涂OB膠，待凝固后撤出瞼板腺囊腫鑷。將肝臟還原腹腔并縫合切口，手術(shù)后給予80萬(wàn)單位的青霉素肌肉注射3 d。（5）手術(shù)后2周進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)CT掃面選取腫瘤直徑為2 cm的荷瘤兔120只隨機(jī)分為五組，使用經(jīng)股動(dòng)脈-肝動(dòng)脈插管法，首先將實(shí)驗(yàn)兔麻醉并固定，切開(kāi)靠近腹股溝區(qū)股動(dòng)脈縱行的皮膚，剪開(kāi)股動(dòng)脈稍分離股動(dòng)脈，遠(yuǎn)端用4號(hào)線穿過(guò)。將近絲線端提起阻斷血流，在股動(dòng)脈前壁剪一小“V”插入短導(dǎo)絲，沿導(dǎo)絲插入自制導(dǎo)管鞘并結(jié)扎固定。用3F微導(dǎo)管尋找腹腔動(dòng)脈進(jìn)行造影，確認(rèn)肝固有動(dòng)脈后行選擇性插管，再次造影，證實(shí)肝實(shí)質(zhì)顯影需進(jìn)一步對(duì)肝左或肝右動(dòng)脈進(jìn)行造影，插管成功后進(jìn)行數(shù)字減影造影（使用優(yōu)維顯300為血管對(duì)比劑）并在透視監(jiān)視下緩慢的灌注試驗(yàn)藥品。第一組每只注入1 mL的超液化碘油，第二組每只按順序經(jīng)導(dǎo)管注入1 mL超液化碘油和20 ?g的P53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染液，第三組每只按順序經(jīng)導(dǎo)管注入1 mL超液化碘油和103 PFU的TK/CD濃縮病毒，第四組每只按順序經(jīng)導(dǎo)管注入1 mL超液化碘油、20 ?g的P53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染液、103 PFU的TK/CD濃縮病毒，第五組經(jīng)導(dǎo)管于腫瘤供血?jiǎng)用}注入1 mL的生理鹽水。介入操作后沖洗導(dǎo)管（使用1 mL肝素鹽水），拔出鞘管、導(dǎo)管并進(jìn)行結(jié)扎和縫合。術(shù)后預(yù)防感染可注射80萬(wàn)單位青霉素，飼養(yǎng)環(huán)境需保證無(wú)菌和清潔。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)五組進(jìn)行常規(guī)病理檢查（術(shù)前和術(shù)后進(jìn)行B超和CT掃描計(jì)算腫瘤體積=最大直徑×最小直徑2/2，腫瘤生長(zhǎng)率=治療后體積/治療前體積）和生存期觀測(cè)[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘤兔治療前后的肝臟腫瘤生長(zhǎng)體積和生長(zhǎng)率 各治療組治療前瘤體所差無(wú)幾（P>0.05）；治療后前四組腫瘤體積增長(zhǎng)率均較對(duì)照組明顯下降，其中第四組腫瘤增長(zhǎng)率抑制最為有效，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 瘤兔生存期比較 此次試驗(yàn)成功建立了兔肝癌模型，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程插管以及介入治療順利，無(wú)死亡。肉眼觀察腫瘤組織呈現(xiàn)灰白色圓形或橢圓形結(jié)節(jié)樣，與周圍的分界較為清晰，剖面呈現(xiàn)出魚(yú)肉狀，中央大多數(shù)具有液化性壞死灶并形成囊腔。光鏡下發(fā)現(xiàn)切片中看不見(jiàn)正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，腫瘤呈明顯的異型性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，較多核分裂相，呈現(xiàn)片狀或巢狀排列。對(duì)照組瘤兔介入術(shù)后20～40 d相繼全部死亡，治療組在觀察期內(nèi)自然死亡30只（31.3%），第一組12只（50.0%），第二組9只（37.5%），第三組7只（29.2%），第四組2只（8.3%），五組瘤兔生存差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病原因和機(jī)制尚不十分明確，至今仍然使用傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療和化療等手段治療肝癌，特別是中晚期患者療效不是特別滿意。經(jīng)過(guò)研究人們逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與血管的生長(zhǎng)有著密切的關(guān)系，腫瘤基因治療是目前研究的熱點(diǎn)，關(guān)鍵是尋找目的基因和探索多基因聯(lián)合治療，以獲得最佳的治療效果。腫瘤免疫學(xué)認(rèn)為惡性腫瘤是惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞逃避了機(jī)體的免疫監(jiān)視而快速的生長(zhǎng)，而免疫逃逸的機(jī)制十分復(fù)雜，與機(jī)體的免疫功能、腫瘤細(xì)胞的抗原調(diào)變等均有很大關(guān)系[5]。機(jī)體免疫監(jiān)視涉及特異性免疫、非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫等多種免疫成分，相互協(xié)作殺傷腫瘤細(xì)胞。一般認(rèn)為抗腫瘤免疫的主要方式是細(xì)胞免疫，特異性效應(yīng)細(xì)胞是T細(xì)胞，但是在發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)會(huì)受到腫瘤細(xì)胞MHC限制。自殺基因是目前研究的熱點(diǎn)，雙自殺基因療法通過(guò)整合兩種自殺基因并轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞并表達(dá)融合基因產(chǎn)物，此產(chǎn)物具有兩種自殺基因編碼的酶活性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行雙前體藥物治療可以發(fā)揮雙功能的殺傷作用，使腫瘤對(duì)于兩種雙前體的藥物更加敏感，具有高效、安全、廣譜、不易出現(xiàn)耐藥的優(yōu)勢(shì)[6-9]。在眾多自殺基因的體系中，對(duì)TK基因和CD基因的研究較為深入并且取得了確切的效果，而TK、CD上自殺基因的融合在更安全、更高效、更廣譜、不易產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)可以減少藥物的劑量。雙自殺基因最為突出的特點(diǎn)為“旁觀者效應(yīng)”，明顯擴(kuò)大了殺傷作用，克服了轉(zhuǎn)導(dǎo)率低的缺點(diǎn)，效應(yīng)更為強(qiáng)大，發(fā)揮出更大的抑癌效果。P53基因分為兩種類型（突變型和野生型），大部分肝癌患者存在基因突變，突變型喪失了抑癌活性轉(zhuǎn)為原癌基因，因此P53缺失或失活可導(dǎo)致化療敏感性降低和耐藥性出現(xiàn)，野生型主要是參與細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[10]。在應(yīng)用基因治療時(shí)，首先轉(zhuǎn)染的基因應(yīng)該具有一定的表達(dá)效率，其次要注意為了方便最大限度的殺傷腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入的基因要局限于靶細(xì)胞，而不會(huì)損傷正常的細(xì)胞[11-12]。因此，基因治療的關(guān)鍵就為提高靶向轉(zhuǎn)染的效率和解決靶向性基因轉(zhuǎn)移技術(shù)[13]。通過(guò)接入的方式直接將基因?qū)肽[瘤組織還能夠減輕毒副作用，降低對(duì)正常肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，可以作為基因治療的理想給藥方法及途徑[14]。endprint

本研究結(jié)果顯示，各治療組腫瘤體積增長(zhǎng)率均較對(duì)照組明顯下降，其中第四組腫瘤增長(zhǎng)率抑制最為有效，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），對(duì)照組瘤兔介入術(shù)后20～40 d相繼全部死亡，治療組在觀察期內(nèi)自然死亡30只（31.3%），第一組12只（50.0%），第二組9只（37.5%），第三組7只（29.2%），第四組2只（8.3%），五組瘤兔生存差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。本研究引入野生型P53基因發(fā)揮出正常抑癌功能的同時(shí)也加強(qiáng)了雙自殺基因的效能，基因治療與碘油栓塞相結(jié)合加劇了腫瘤內(nèi)部缺氧的環(huán)境，延長(zhǎng)基因治療的作用，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)達(dá)到延長(zhǎng)生存期的效果[15]。介入技術(shù)是一種易操作的、微創(chuàng)的、理想的基因施放方法，導(dǎo)管應(yīng)該能夠?qū)y帶目的基因的載體投放到準(zhǔn)確的部位，基因的轉(zhuǎn)染僅限于所在的細(xì)胞內(nèi)，最大限度的減少隨血流流入遠(yuǎn)端部位而減輕基因治療的不良反應(yīng)[16-17]。介入醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展在許多疾病的診斷和治療中都占據(jù)著重要的作用，因此需要介入放射醫(yī)生對(duì)基本原理和治療的策略熟悉掌握，積極的投身基因治療的臨床試驗(yàn)中[18]。無(wú)論是腫瘤內(nèi)灌注還是影像引導(dǎo)下的瘤內(nèi)直接注射都是介入醫(yī)學(xué)范疇，因此可見(jiàn)介入醫(yī)學(xué)是基因?qū)氲睦硐敕椒?，并伴隨肝癌的基因治療逐步應(yīng)用于臨床并起到積極作用[19]。通過(guò)前期的研究已經(jīng)證實(shí)了P53基因和TK、CD雙自殺基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染和表達(dá)的情況，基因療法主要通過(guò)靜脈給藥和瘤體內(nèi)注射，相應(yīng)的表達(dá)說(shuō)明介入途徑導(dǎo)入基因有效可行，為理想的給藥方法和途徑[20]。

綜上所述，介入多療法、多基因聯(lián)合治療能夠克服介入治療的副作用，有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)瘤兔的生存時(shí)間。

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（收稿日期：2017-04-25） （本文編輯：鄧朝陽(yáng)）endprint