嚴(yán) 燁，鄒 力，舒 靜，王 瑛，唐 欣，樊 成

（1. 西安悟空檢測科技有限公司，陜西西安 710065；2. 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）

國標(biāo)試管法與試劑盒微孔法檢測嬰幼兒奶粉中葉酸含量的結(jié)果比較

嚴(yán) 燁1，鄒 力2，舒 靜2，王 瑛2，唐 欣1，樊 成2

（1. 西安悟空檢測科技有限公司，陜西西安 710065；2. 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）

采用國標(biāo)試管法GB 5413.16和微孔板形式的微生物法，定量檢測6罐嬰幼兒配方羊奶粉中的葉酸含量。國標(biāo)試管法檢測YNF1-1，YNF1-2，YNF2-1，YNF2-2，YNF3-1及YNF3-2的葉酸結(jié)果分別為118.5，112.3，105.9，97.5，89.5，97.6 μg/100 g；試劑盒微孔法檢測6個(gè)樣品的葉酸含量分別為129.9，125.8，101.4，102.3，99.0，100.4 μg/100 g。結(jié)果表明，同一產(chǎn)品不同個(gè)體之間的葉酸含量存在差異，國標(biāo)試管法的穩(wěn)定性低于試劑盒微孔法?？稍谝欢〞r(shí)間內(nèi)用試劑盒微孔法對(duì)國標(biāo)試管法進(jìn)行驗(yàn)證和偏差值評(píng)定，確保檢測結(jié)果真實(shí)反映樣品中葉酸含量。

GB 5413.16；微孔板；葉酸

（1. Xi'an Wukong Testing Technology Co.， Ltd.， Xi'an， Shaanxi 710065， China；2. Shaanxi Product Quality Supervision and Inspection Research Institute，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

葉酸（Folic acid），即通常所說的VB9，是微生物B復(fù)合體之一，是嬰幼兒乳粉中規(guī)定添加的營養(yǎng)成分[1-3]。葉酸具有促進(jìn)骨髓中幼細(xì)胞成熟的作用，人體缺乏葉酸可引起巨紅細(xì)胞性貧血癥或白細(xì)胞減少癥[4]、腦卒中[5]、血管性癡呆[6]等。所以，對(duì)于嬰幼兒奶粉中葉酸含量的檢測監(jiān)測非常重要。

葉酸的測定方法有間接熒光定量法[7-8]、高效液相色譜法[9-10]、微生物濁度法[11-12]、差示脈沖溶出法[13]。國家標(biāo)準(zhǔn)參考微生物濁度法進(jìn)行制定，原理是利用干酪乳桿菌 （Lactobacillus casei） ATCC 7469 對(duì)葉酸的特異性，通過其在含有葉酸的樣品中生長產(chǎn)生形成的光密度來測定葉酸含量[14]。葉酸檢測試劑盒同樣利用微生物方法，將樣品提取液和葉酸檢測用培養(yǎng)基加入包被有鼠李糖桿菌（Lactobacillus rhamnosus）的微孔板中，該菌的生長情況取決于葉酸的含量。

采用2種不同的微生物方法對(duì)6罐某品牌嬰幼兒配方羊奶粉中葉酸含量檢測，對(duì)比2種方法的差異性。

1 材料與方法

市場市售嬰幼兒配方羊奶粉，某品牌金裝嬰兒配方羊奶粉、金裝較大嬰兒配方羊奶粉及金裝幼兒配方羊奶粉，每種各購買2罐，分別編號(hào)為YNF1-1， YNF1-2， YNF2-1， YNF2-2， YNF3-1， YNF3-2。

SPX-80SH-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；SM800型酶標(biāo)儀，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（生化級(jí)，批號(hào)1610171）、乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（生化級(jí)，批號(hào)1611161），購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葉酸檢測培養(yǎng)基（生化級(jí)，批號(hào)：4020410），購自美國BD醫(yī)療器械有限公司；干酪乳桿菌（生化級(jí)，批號(hào)233-25-1），購自美國ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株保存庫；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，批號(hào)：30717），購自德國Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；葉酸檢測試劑盒（生化級(jí)，批號(hào)KF42724），購自德國拜發(fā)R-Biopharm公司。

1.3.1 國標(biāo)試管法[13]

（1） 樣品待測液制備。稱取2.000 g左右樣品置于50 mL燒杯中，加入20 mL蒸餾水復(fù)溶，轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶中，量取5 mL定容至250 mL容量瓶中，加水定容，再從250 mL容量瓶中吸取10 mL溶液加入100 mL容量瓶中，用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（稱取5.85 g磷酸二氫鉀，1.22 g磷酸氫二鉀，用1 000 mL水溶解；使用前按0.5 g/100 mL 加入抗壞血酸）定容，即為樣品待測液，稀釋倍數(shù)為50 000。

（2） 接種菌懸液制備。標(biāo)準(zhǔn)菌株活化后保藏于乳酸桿菌瓊脂斜面上備用；試管用活性洗潔劑清洗干凈，烘干，分裝10 mL乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，于121 ℃條件下滅菌15 min；冷卻后接種干酪乳桿菌，于36±1 ℃條件下培養(yǎng)18 h，然后將菌懸液移至無菌離心管中，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，傾倒上清液，加入10 mL 0.85%滅菌生理鹽水，振蕩混勻，再以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，傾倒上清液，重復(fù)清洗菌體3次后，加入10 mL 滅菌生理鹽水復(fù)懸菌體。吸取1 mL菌懸液加入10 mL滅菌生理鹽水中混勻，調(diào)整透光率至60%～80%，即為接種菌懸液。

（3） 葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液最終質(zhì)量濃度為0.05 ng/mL及0.1 ng/mL。葉酸檢測用培養(yǎng)基制備按照標(biāo)簽說明配制備用。

（4） 檢測管制備。采用9個(gè)梯度，3個(gè)平行。按國標(biāo)試管法中順序加入蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)工作液和葉酸測定用培養(yǎng)基于培養(yǎng)管中。試管S2～S10中，相當(dāng)于葉酸含量為 0， 0.05， 0.10， 0.15， 0.20， 0.25， 0.30，0.40，0.50 ng/100 g。按試劑盒微孔法中順序在測定用培養(yǎng)基試管中加入蒸餾水、試樣和葉酸。

（5） 滅菌。將標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管于121 ℃條件下滅菌5 min，迅速冷卻到室溫。

（6） 接種。無菌條件下每管中均加入1滴（約50 μL） 接種菌懸液，加蓋，充分振蕩混勻所有試管（標(biāo)準(zhǔn)曲線未接種空白管S1除外）。

（7） 培養(yǎng)。在36±1 ℃條件下培養(yǎng)16～24 h。對(duì)每支試管進(jìn)行目測檢查，未接種管內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中培養(yǎng)液的濁度應(yīng)有梯度。

（8） 測定。以接種空白管（國標(biāo)試管法中試管號(hào)S2） 作對(duì)照，取出最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線管S7，振蕩5 s，于波長550 nm處讀取光密度，放回重新培養(yǎng)。2 h 后同等條件重新測該管的光密度，如果2次光密度的絕對(duì)差結(jié)果≤2%，則取出全部檢驗(yàn)管測定標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣的光密度。

（9） 以標(biāo)準(zhǔn)曲線管葉酸含量作橫坐標(biāo)、光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。用樣品吸光度查圖得到數(shù)值，按照公式進(jìn)行計(jì)算。

式中：X——樣品中葉酸含量，μg/100 g；

Cx——樣品4個(gè)梯度總平均值，ng；

f——稀釋倍數(shù)，50 000；

m——稱樣量。

1.3.2 試劑盒微孔法

（1） 樣品待測液制備。秤取1.000 g左右樣品置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL左右磷酸鹽緩沖液（7.8 g 磷酸二氫鈉和1 g 抗壞血酸鈉溶解于1 L蒸餾水中，校正pH值至7.2；每天新配緩沖液） 復(fù)溶混勻，再添加磷酸鹽緩沖液至40 mL刻度。蓋塞后于95 ℃水浴中保存30 min，期間振蕩3次；迅速冷卻后以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min；吸取上清液在1.5 mL離心管中梯度稀釋至300倍。

（2） 培養(yǎng)基制備。將10 mL無菌水和1 mL試劑盒中緩沖液加入自帶培養(yǎng)基瓶中，渦旋振蕩混勻，置于95 mL水浴中保溫5 min；迅速冷卻，過0.22 μm無菌膜備用。

（3） 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備。用自帶標(biāo)準(zhǔn)溶液配制6個(gè)梯度， 即 0， 160， 320， 640， 960， 1 280 ng/100 g。

（4） 加樣。按照需要取適量孔板，移取150 μL葉酸培養(yǎng)基至微孔中，移取150 μL標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋樣品至指定的微孔中，用黏合箔蓋住板條或微孔（除去黏合箔上的保護(hù)層，將其平放在微孔條上，用手將黏合箔平壓，使其充分封閉微孔板條）。

（5） 培養(yǎng)。在37±1 ℃黑暗條件下孵育48 h。（6） 測量。用酶標(biāo)儀于波長550 nm處讀取吸光度。

（7） 以標(biāo)準(zhǔn)曲線管葉酸含量作橫坐標(biāo)、光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果分析

國標(biāo)試管法標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表1，國標(biāo)試管法標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

由表1可知，國標(biāo)試管法測得吸光度逐漸增大，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)差隨著葉酸含量的增大而增加，說明隨著菌體的不斷增加，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分變化更加明顯，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量差異性增大。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較長（24 h） 的情況下，S10試管中吸光度也不斷增加，不能滿足≤2%的情況。

表1 國標(biāo)試管法標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

圖1 國標(biāo)試管法標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的增長趨勢符合微生物生長曲線趨勢，包含對(duì)數(shù)增長期和穩(wěn)定期，說明國標(biāo)試管法可以滿足測定樣品中葉酸含量的要求。在曲線處理方面采取了手繪曲線的方式，同時(shí)在大量的檢測試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在曲線點(diǎn)分散比較均勻的條件下，可以采用Origin等數(shù)據(jù)處理軟件擬合多元曲線，進(jìn)行單變量求解，便于計(jì)算最終的結(jié)果。一般情況下，不能擬合一次曲線，防止產(chǎn)生較大的誤差。

試劑盒微孔法標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表2，試劑盒微孔法標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

表2 試劑盒微孔法標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

由表2可知，試劑盒微孔法吸光度增加趨勢明顯，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度的標(biāo)準(zhǔn)偏差保持在1%左右。同一批次試劑盒，培養(yǎng)時(shí)間固定，重現(xiàn)性良好。

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的Origin擬合結(jié)果符合微生物生長曲線，對(duì)數(shù)期明顯。

國標(biāo)試管法和試劑盒微孔法測定結(jié)果見表3。

圖2 試劑盒微孔法標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 國標(biāo)試管法和試劑盒微孔法測定結(jié)果

由表3可知，國標(biāo)試管法測得結(jié)果各梯度之間呈增加趨勢，各平行之間偏離度較微孔法測量結(jié)果大，21組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差大于1%、3組數(shù)據(jù)大于2%，這是由于大體積菌液增長的不穩(wěn)定性造成的。微孔法各樣品測定值之間偏差較小，標(biāo)準(zhǔn)差均小于1%。說明試劑盒微孔法的穩(wěn)定性強(qiáng)于國標(biāo)法。

國標(biāo)試管法和試劑盒微孔法計(jì)算結(jié)果比較見表4。

表4 國標(biāo)試管法和試劑盒微孔法計(jì)算結(jié)果比較/ μg·（100 g）-1

由表4可知，國標(biāo)試管法檢測結(jié)果和試劑盒微孔法檢測結(jié)果之間存在差異，3組對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)差大于5%，小于10%，說明2種方法在一定條件下是可以相互驗(yàn)證的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一樣品不同個(gè)體之間的葉酸含量存在差異，說明葉酸在樣品中的分布不均勻。

3 結(jié)論

采用國標(biāo)試管法和試劑盒微孔法分別對(duì)6罐嬰幼兒配方羊奶粉中的葉酸含量進(jìn)行檢測，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線趨勢相近，符合一般微生物生長曲線趨勢；國標(biāo)試管法檢測結(jié)果各吸光度梯度平行間偏差大于試劑盒微孔法檢測結(jié)果間偏差，國標(biāo)試管法的穩(wěn)定性弱于試劑盒微孔法；國標(biāo)試管法檢測所得葉酸含量同試劑盒微孔法檢測所得值有差異，但在允許范圍內(nèi)；同一樣品不同個(gè)體之間的葉酸含量存在差異，表明葉酸在樣品中的分布存在不均勻性。說明在試劑盒微孔法原理同國標(biāo)試管法原理相同的條件下，試劑盒微孔法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性強(qiáng)于國標(biāo)試管法。因此可在規(guī)定時(shí)間間隔內(nèi)采用試劑盒微孔法對(duì)國標(biāo)試管法進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)判檢測結(jié)果偏差值，確保測得葉酸含量結(jié)果能準(zhǔn)確反映樣品中葉酸實(shí)際含量。

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TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.016

1671-9646（2017） 10a-0054-04

2017-08-25

嚴(yán) 燁（1986— ），男，碩士，工程師，研究方向?yàn)槲⑸餀z驗(yàn)。