任金威,李 迪,陳啟賀,劉 睿,孫靖琴,李 慧,徐 騰,李 林,李 勇*
(北京大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系,北京 100191)
吉林人參低聚肽的抗氧化作用
任金威,李 迪,陳啟賀,劉 睿,孫靖琴,李 慧,徐 騰,李 林,李 勇*
(北京大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系,北京 100191)
目的:探討吉林人參低聚肽(ginseng oligopeptide,GOP)對D-半乳糖過氧化損傷大鼠抗氧化作用的影響。方法:取SD大鼠90 只,設立9 個實驗組:6 個GOP劑量組(0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 g/kg mb)、1 個空白對照組、1 個乳清蛋白組(0.250 0 g/kg mb)和1 個模型對照組。除空白對照組外,其余各組每天腹腔注射D-半乳糖125 mg/kg mb,連續(xù)6 周,造成過氧化損傷模型。造模成功后繼續(xù)腹腔注射D-半乳糖并連續(xù)灌胃45 d后進行血清和肝臟氧化應激指標檢測。結(jié)果:GOP可以顯著降低大鼠脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物水平,顯著提高大鼠抗氧化酶活力和抗氧化物質(zhì)含量(P<0.05),且效果優(yōu)于乳清蛋白。結(jié)論:GOP對D-半乳糖所致過氧化損傷大鼠有抗氧化作用。
吉林人參低聚肽;D-半乳糖;過氧化損傷模型;抗氧化
氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時,體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基產(chǎn)生過多,氧化程度超出氧化物的清除能力,氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡,從而導致機體組織細胞及蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子損傷。研究證實,氧化應激可導致胰島β細胞功能損傷及外周胰島素抵抗,從而導致糖尿病的發(fā)生[1];并能引起內(nèi)皮細胞功能障礙,導致心血管疾病[2];此外,還可引發(fā)自身免疫性疾病[3]、血液系統(tǒng)疾病[4]及癌癥[5]等一系列疾病,給人體健康造成極大損害。因此控制氧化應激對于維持機體健康具有極其重要的作用。尋找安全有效的抗氧化物質(zhì)顯得尤為迫切。
目前臨床應用的抗氧化藥物主要有單胺氧化酶抑制劑、多巴胺受體激動劑、維生素等。這些藥物均有不同程度的副作用,不宜長期服用。近年來大量研究已證實天然食物成分在抗氧化方面是安全有效的[6-7]。
生物活性肽是指對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物。肽的分子結(jié)構(gòu)介于氨基和蛋白質(zhì)之間,是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能片段,并使蛋白質(zhì)具有數(shù)以千萬計的生理功能,其本身也具有很強的生物活性[8]。低聚肽,又稱為活性小分子肽,一般由10 個或10 個以下氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn)機體對低聚肽的吸收和代謝速率比對游離氨基酸快[9]。另外,生物活性肽類具有廣泛的生物活性,如免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、降膽固醇、抗氧化和清除自由基作用等。目前生物活性肽以其高效、安全的特點異軍突起,逐漸顯示出其在臨床營養(yǎng)中的重要作用和廣泛的應用前景[8]。
人參屬名中的“Panax”來源于希臘語,意為長壽、包治百病,其應用歷史可以追溯到幾千年前。人參在我國藥用歷史悠久,由于其廣泛而神奇的功效,也是人類認識和應用最早的保健佳品之一。我國現(xiàn)存最早的藥物學專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載:“人參,味甘微寒,主補五臟,安精神,定魂魄,止驚悸,除邪氣,明目,開心益智。久服,輕身延年”?!侗静菥V目》對人參有更為細致的記載:“補五臟血脈,益氣生血,故為強壯藥,能振奮精神”。2012年9月4日,我國衛(wèi)生部批準人參成為新資源食品,人參的應用將由單一的中藥材拓展到食品、飲料及保健產(chǎn)品等領域,范圍大幅擴大,這為我國的人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了新的契機[10]。研究發(fā)現(xiàn),人參可通過提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化酶活性,降低丙二醛(malondialdehvde,MDA)等脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的含量來發(fā)揮抗氧化作用[11-14]。對人參提取物人參皂甙的研究也發(fā)現(xiàn),人參皂甙Rb1[15]、Rg2[16]等具有抗氧化功能。人參低聚肽雖然作為一類重要的化合物存在于人參組織中,但其功能研究較少報道,有關其抗氧化功能的研究更是少之又少。低聚肽在人體內(nèi)不需消化可直接吸收,比單個氨基酸吸收更有效,可直接參與蛋白質(zhì)的合成[8],避免活性物質(zhì)的浪費,提高其生理調(diào)節(jié)作用。本實驗通過對過氧化損傷模型大鼠采用不同劑量的吉林人參低聚肽(ginseng oligopeptides,GOP)水溶液進行干預,觀察GOP的抗氧化作用。
1.1 動物、材料與試劑
健康SPF級成年雄性SD大鼠90 只,適應期結(jié)束時,體質(zhì)量(200±20)g,由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(京)2011-0012。分籠飼養(yǎng),每籠3 只,自由飲食、飲水。動物飼養(yǎng)實驗室符合國標清潔級,溫度范圍為(22±2)℃,相對濕度為50%~60%,晝夜明暗交替時間為12 h。
GOP為利用生物酶解技術從吉林人參中分離得到的小分子生物活性肽的混合物(淡黃色固體粉末),混合物主要以小分子低聚肽為主,相對分子質(zhì)量小于1 000,質(zhì)量分數(shù)為95.42%,由吉林肽谷生物工程有限責任公司提供。
D-半乳糖 美國Amresco公司;SOD、MDA、考馬斯亮藍、GSH-Px、8-表氫氧-異前列腺素、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、蛋白質(zhì)羰基(protein carboxyls,PCO)試劑盒 北京安迪華泰科技有限公司。
1.2 儀器與設備
高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司;Adventurer通用型分析天平 美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司;電熱恒溫水浴鍋 北京天林恒泰科技有限公司;FSH-2A可調(diào)高速電動勻漿機 金壇市金南儀器廠;722型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;WH-861型旋渦混合器 北京科爾德科貿(mào)有限公司。
1.3 方法
1.3.1 劑量分組及受試樣品給予時間
雄性SD大鼠共分為9 個實驗組,每組10 只。實驗設立6 個GOP劑量組(0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 g/kg mb)、1 個空白對照組、1 個乳清蛋白組(0.250 0 g/kg mb)和1 個模型對照組。受試樣品給予時間為45 d。
1.3.2 動物造模、分組及給受試物
1.3.2.1 適應期
于屏障系統(tǒng)下大鼠飼喂維持飼料觀察7 d。
1.3.2.2 造模期
按體質(zhì)量隨機分成2 組,10 只大鼠作為空白對照組,其余80 只作為模型對照組??瞻讓φ战M每日腹腔注射滅菌生理鹽水,注射量為0.2 mL/100 g mb,每日1 次。參照文獻[17]方法制備D-半乳糖過氧化損傷大鼠模型,即模型對照組用125 mg/kg mbD-半乳糖腹腔注射造模,注射量為0.2 mL/100 g(將D-半乳糖31.25 g溶于500 mL生理鹽水中配成D-半乳糖-氯化鈉注射液,使用前配制,常規(guī)滅菌后使用),每日1 次,連續(xù)造模6 周,取血測MDA濃度,按MDA水平分組,隨機分為1 個模型對照組、1 個乳清蛋白組和6 個GOP劑量組。
1.3.2.3 受試樣品給予
分組后,6 個劑量組每天灌胃給予不同劑量GOP水溶液,空白對照組、模型對照組給予同體積蒸餾水,乳清蛋白組給予同體積乳清蛋白水溶液。在給受試樣品的同時,模型對照組、乳清蛋白組和各劑量組繼續(xù)給予相同劑量D-半乳糖腹腔注射,空白對照組繼續(xù)給予相同劑量生理鹽水腹腔注射。
實驗過程中,每周各鼠稱質(zhì)量記錄1 次,按體質(zhì)量調(diào)整腹腔注射量和灌胃量。每日觀察大鼠的食欲行為、狀態(tài)、毛發(fā)及動物死亡情況。
1.3.3 氧化應激指標的檢測
末次給灌胃及腹腔注射完畢后,大鼠禁食不禁水12 h后采血,斷頭處死大鼠。
1.3.3.1 血清氧化應激指標的檢測
血液3 000 r/min離心10 min,取血清并按照試劑盒說明書檢測8-表氫氧-異前列腺素、MDA、PCO、SOD、GSH-Px、GSH水平。
1.3.3.2 肝臟氧化應激指標的檢測
冰浴剝離肝臟,除去脂肪組織,用預冷的生理鹽水漂洗組織至無血色,稱取相同部位組織適量,用眼科小剪刀剪碎組織塊,加入相應倍數(shù)的預冷生理鹽水,用勻漿機制成測試所需質(zhì)量分數(shù)(10%)的組織勻漿(勻漿時間10 s/次,間隔30 s,在冰浴中進行),3 000 r/min低溫離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書進行蛋白質(zhì)、MDA、PCO、SOD、GSH-Px、GSH水平的測定。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
2.1 GOP對過氧化損傷模型大鼠血清、肝組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量的影響
由表1可知,與空白對照組相比,模型對照組大鼠血清8-表氫氧異前列腺素、MDA水平和肝臟MDA水平均有所增高,其中血清MDA水平增高極顯著(P<0.01)。與模型對照組相比,乳清蛋白組大鼠血清8-表氫氧異前列腺素、MDA水平和肝臟MDA水平均無顯著變化(P>0.05);GOP C、GOP D劑量組大鼠血清8-表氫氧異前列腺素水平顯著降低(P<0.01,P<0.05);GOP A、D、F劑量組大鼠血清MDA水平顯著降低(P<0.05);GOP A、B、D、F劑量組大鼠肝臟MDA水平顯著降低(P<0.05),其中GOP A、B、F劑量組大鼠肝臟MDA水平降低極顯著(P<0.01)。
表1 GOP對過氧化損傷模型大鼠血清、肝臟脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量的影響(n= 10)Table 1 Effect of GOP on lipid peroxide levels in serum and liver tissue of rats with oxidative damage (n= 10)
2.2 GOP對過氧化損傷模型大鼠血清、肝組織蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物含量的影響
表2 GOP對過氧化損傷模型大鼠血清、肝臟蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物含量的影響(n= 10)Table 2 Effect of GOP on protein peroxide levels in serum and liver tissue of rats with oxidative damage (n= 10)
由表2可知,與空白對照組相比,模型對照組大鼠血清PCO水平顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組相比,乳清蛋白組大鼠血清PCO水平極顯著降低(P<0.01),肝臟PCO水平無顯著變化(P>0.05);GOP A、C、D劑量組大鼠血清PCO水平顯著降低(P<0.05),其中GOP C劑量組大鼠血清PCO水平極顯著降低(P<0.01)。
2.3 GOP對過氧化損傷模型大鼠血清、肝組織抗氧化酶活力的影響
由表3可知,與空白對照組相比,模型對照組大鼠血清和肝臟SOD、GSH-Px水平均無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型對照組相比,乳清蛋白組大鼠血清和肝臟SOD、GSH-Px水平均無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);GOP E劑量組大鼠血清SOD水平極顯著增高(P<0.01);GOP C、D、F劑量組大鼠肝臟SOD水平顯著增高(P<0.05),其中GOP D、F劑量組大鼠肝臟SOD水平增高極顯著(P<0.01);GOP D、F劑量組大鼠肝臟GSH-Px水平顯著增高(P<0.05)。
表3 GOP對過氧化損傷模型大鼠血清、肝臟SOD活力、GSH-Px濃度的影響(n= 10)Table 3 Effect of GOP on the activities of SOD and concentration of GSH-Px in serum and liver tissue of rats with oxidative damage (n= 10)
2.4 GOP對過氧化損傷模型大鼠血清、肝組織抗氧化物質(zhì)含量的影響
表4 GOP對過氧化損傷模型大鼠血清、肝臟抗氧化物質(zhì)含量的影響(n= 10)Table 4 Effect of GOP on antioxidant levels in serum and liver tissue of rats with oxidative damage (n= 10)
由表4可知,與空白對照組相比,模型對照組大鼠血清和肝臟GSH水平均無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型對照組相比,乳清蛋白組大鼠血清和肝臟GSH水平均無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);GOP C劑量組大鼠血清GSH水平顯著增高(P<0.05);GOP各劑量組大鼠肝臟GSH水平均無顯著變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
隨著人們對自由基研究的逐步深入,許多研究證實,體內(nèi)自由基含量是隨著年齡的增長而積累的,但體內(nèi)產(chǎn)生抗氧化劑和氧化酶的能力卻隨年齡增加而逐漸下降[18-19]。自由基的氧化可導致衰老、炎癥、心腦血管疾病和腫瘤等。因此,尋找有效的抗氧化藥物,減少自由基的危害,對人類的健康有著十分重要的意義。本實驗通過與D-半乳糖所致過氧化損傷模型相對比,研究GOP的抗氧化作用。
單純地增加蛋白質(zhì)攝入可能會對氧化應激指標有一定的影響[20],因此本研究專門設立了乳清蛋白組作為對照,通過將GOP各劑量組與乳清蛋白組進行比較可排除因單純提高蛋白質(zhì)的攝入量而引起的假陽性結(jié)果。乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀分離時保留在上清液中的多種蛋白質(zhì)組分的統(tǒng)稱,其在消化過程中產(chǎn)生多種生物活性多肽,具有增強體質(zhì)、提高免疫力、抗疲勞、抗氧化等多種功效[21]。但在本實驗中僅觀察到乳清蛋白有降低過氧化損傷模型大鼠血清PCO水平的作用,并未觀察到其對脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、抗氧化酶活力、抗氧化物質(zhì)含量的影響。
研究表明,大劑量D-半乳糖可引起多組織基因表達與調(diào)控異常、細胞增殖分化能力下降及細胞退行性改變等,其機制可能是D-半乳糖誘導活性氧產(chǎn)生增多,脂質(zhì)過氧化亢進,產(chǎn)生超氧陰離子自由基[22]。同時脂質(zhì)過氧化分解產(chǎn)物MDA能使DNA、蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),影響細胞的分裂,破壞蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)、功能[23],因此,檢測MDA的含量??煞从硻C體脂質(zhì)過氧化的程度,同時也可間接地反映出細胞損傷程度。從實驗結(jié)果可知,與正常對照組大鼠相比,過氧化損傷模型組大鼠的血清MDA濃度極顯著升高(P<0.01),說明由D-半乳糖所致過氧化損傷模型組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的細胞損傷,同時也表明本研究的過氧化損傷模型制備成功。與模型對照組相比,乳清蛋白組大鼠血清8-表氫氧異前列腺素、MDA水平和肝臟MDA水平均無顯著變化(P>0.05);GOP C、D劑量組大鼠血清8-表氫氧異前列腺素水平顯著降低(P<0.01,P<0.05);GOP A、D、F劑量組大鼠血清MDA水平顯著降低(P<0.05);GOP A、B、D、F劑量組大鼠肝臟MDA水平顯著降低(P<0.05)。說明GOP具有抑制MDA生成,減少細胞損傷的作用。
H2O2或O2-·對蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化可導致羰基產(chǎn)物的積累。羥自由基也可直接作用于肽鏈,使肽鏈斷裂,引起蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的破壞,在斷裂處產(chǎn)生羰基。羰基化蛋白極易相互交聯(lián)、聚集為大分子從而降低或失去原有蛋白質(zhì)的功能。PCO形成是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標志,且化學性質(zhì)穩(wěn)定,并隨著年齡的增長而增加[24-25]。檢測PCO含量可直接反映蛋白質(zhì)損傷的程度[26]。本實驗結(jié)果顯示,與模型對照組相比,乳清蛋白組大鼠血清PCO水平極顯著降低(P<0.01),而肝臟PCO水平無顯著變化(P>0.05);GOP A、C、D劑量組大鼠血清PCO水平顯著降低(P<0.01,P<0.05)。提示GOP可以保護蛋白質(zhì)免受氧化損傷。GSH-Px在機體內(nèi)廣泛存在,能夠特異性地催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應,從而保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。SOD是一種能夠清除超氧陰離子自由基的重要的酶,可以保護細胞免受氧化損傷[27]。從實驗結(jié)果可知,與模型對照組相比,乳清蛋白組大鼠血清和肝臟SOD、GSH-Px水平均無顯著變化(P>0.05);GOP E劑量組大鼠血清SOD水平極顯著升高(P<0.01);GOP C、D、F劑量組大鼠肝臟SOD水平極顯著升高(P<0.01);GOP D、F劑量組大鼠肝臟GSH-Px水平顯著升高(P<0.05)。說明GOP能夠通過提高SOD和GSH-Px的水平來減少自由基的氧化,并起到保護細胞膜的作用。
GSH是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽,是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物[28-29],能夠穩(wěn)定含巰基的酶,有利于酶活力的發(fā)揮。此外,GSH還是一種低分子清除劑,它可清除O2-·、H2O2、LOOH,保護DNA、蛋白質(zhì)及其他輔助因子免受氧化損傷[30]。本研究結(jié)果顯示,與模型對照組相比,乳清蛋白組大鼠血清和肝臟GSH水平均無顯著變化(P>0.05);GOP C劑量組大鼠血清GSH水平顯著增高(P<0.05)。提示GOP可以通過提高GSH的水平來減少體內(nèi)氧化應激水平,保護抗氧化酶活力??傊?,GOP能夠增強機體的抗氧化能力,具備作為一種新型抗氧化制劑的潛力,有關其抗氧化作用的深層機制尚有待進一步的研究與探討。
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Antioxidant Effect of Oligopeptide Extracted from Panax ginseng Grown in Jilin Province
REN Jinwei, LI Di, CHEN Qihe, LIU Rui, SUN Jingqin, LI Hui, XU Teng, LI Lin, LI Yong*
(Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Peking University, Beijing 100191, China)
Purpose: To investigate the antioxidant effect of oligopeptide extracted from Panax ginseng grown in Jilin
province (GOP) on rats with D-galactose-induced oxidative damage. Methods: In total, 90 specific pathogen free (SPF)male SD rats were randomly divided into 9 groups: control group, model group, whey protein group, and six GOP groups with different doses. The rats in all groups except the control group were subjected to intraperitoneal injection of 125 mg/kg D-galactose for 6 weeks. Then, the rats in the six GOP groups were gavaged with 0.062 5, 0.125 0, 0.250 0, 0.500 0,1.000 0 and 2.000 0 g/kg mbGOP, respectively, while those in the control and model groups were gavaged with the same volume of distilled water. The rats in the whey protein group were gavaged with 0.250 0 g/kg mbwhey protein. The administration lasted for 45 days. At the same time, the rats in all groups except the control group were injected with D-galactose 125 mg/kg mbuninterruptedly. Thereafter, the oxidative stress parameters in serum and liver tissue were determined. Results: The levels of lipid peroxide and protein peroxide in the GOP groups were significantly lower than those in the model group. Meanwhile, the antioxidant enzyme activities and the antioxidant levels significantly increased compared with the model group (P 〈 0.05), and the antioxidant effect of GOP was better than that of whey protein. Conclusion: GOP has an antioxidant effect on rats with D-galactose-induced oxidative damage.
oligopeptide extracted from Panax ginseng grown in Jilin province (GOP); D-galactose; oxidative damage model; antioxidant
10.7506/spkx1002-6630-201721031
R151.2
A
1002-6630(2017)21-0195-06
任金威, 李迪, 陳啟賀, 等. 吉林人參低聚肽的抗氧化作用[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 195-200.
10.7506/spkx1002-6630-201721031. http://www.spkx.net.cn
REN Jinwei, LI Di, CHEN Qihe, et al. Antioxidant effect of oligopeptide extracted from Panax ginseng grown in Jilin province[J]. Food Science, 2017, 38(21): 195-200. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721031. http://www.spkx.net.cn
2016-08-28
“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD27B08)
任金威(1988—),男,碩士研究生,研究方向為生物活性肽與健康。E-mail:ren_jinwei@126.com
*通信作者:李勇(1958—),男,教授,博士,研究方向為營養(yǎng)與疾病。E-mail:liyongbmu@163.com