王 巖，周倩倩，萬銹琳，王佳瑩，侯紅漫，張公亮*

（大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034）

異硫氰酸酯類香料對兩種革蘭氏陽性致病菌的抑制作用

王 巖，周倩倩，萬銹琳，王佳瑩，侯紅漫，張公亮*

（大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034）

選取9 種異硫氰酸酯類香料，以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌作為供試菌，通過測量抑菌圈直徑考察此類含硫香料的抑菌活性，并探討其構效關系。篩選抑菌效果最好的含硫香料，利用反轉錄熒光定量聚合酶鏈式反應技術考察其對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因表達的影響。結果顯示：4 種異硫氰酸酯類香料——異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate，BZITC）、異硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）、異硫氰酸3-甲硫基丙酯（3-methylthiopropyl isothiocyanate，MTPITC）和異硫氰酸異戊酯（isoamyl isothiocyanate，IAITC）對2 種革蘭氏陽性菌的抑菌效果較好，且抑菌能力為BZITC≈PEITC＞MTPITC＞IAITC。對比9 種異硫氰酸酯類香料的抑菌活性，BZITC對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強，最低抑菌濃度為0.61 mmol/L，對單增李斯特菌的最低抑菌濃度為4.88 mmol/L。在亞抑菌濃度條件下，BZITC極顯著地降低了金黃色葡萄球菌毒力基因nuc的表達（P＜0.01）。以上結果說明，苯基的存在可能增強異硫氰酸酯類香料的抑菌活性，該結構對BZITC抑制金黃色葡萄球菌毒力基因nuc的表達具有重要作用。

異硫氰酸酯類香料；革蘭氏陽性菌；抑菌活性；構效關系；毒力基因表達

在食用香料中，含硫香料占據十分重要的地位。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》及美國食品香料與萃取物制造者協會（Flavor Extract Manufacturers’ Association，FEMA）公布的食品香料名單中，包含多種含硫香料[1]。近幾年，FEMA新公布的一般認為安全的物質中，含硫香料的比例都超過31%[2-3]。目前，對含硫香料的研究報道主要集中在硫醚類化合物上，如大蒜的活性成分方面[4-5]。異硫氰酸酯類香料主要從十字花科植物提取，為R—N＝C＝S結構，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌和抗腫瘤等生物活性[6-8]。目前，對此種香料的抑菌構效研究比較少，主要集中在香料合成方面[9-10]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是常見的革蘭氏陽性致病菌。金黃色葡萄球菌是造成人類食物中毒的常見致病菌之一，由金黃色葡萄球菌產生的腸毒素可引起食物的污染，感染后可導致惡心、嘔吐、腹瀉等腸炎反應[11-12]。單增李斯特菌具有高致病率的特點，且對外界環(huán)境具有很強的適應性，在食品的貯藏、運輸及加工過程中極易受到其污染[13-15]，是對人類衛(wèi)生健康具有重大影響的病原微生物之一[16]。因此，選取安全有效的食品級抑制劑來控制食品中的金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌污染具有十分重要的研究意義。

金黃色葡萄球菌能產生多種與毒力強弱、致病力有關的毒素和細胞外酶，其中，由nuc基因編碼的耐熱核酸酶是產腸毒素金黃色葡萄球菌污染的一個典型特征，它不但是細菌成功侵入宿主的重要因子之一，而且是檢測金黃色葡萄球菌污染食品和引起感染的特征標志[17-18]。目前研究含硫香料對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因表達的影響情況很少，本實驗選取了9 種異硫氰酸酯類香料，研究其對2 種革蘭氏陽性致病菌——金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制作用，并探討其構效關系。同時利用異硫氰酸酯類香料，研究其對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因表達的調控情況，為含硫香料的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究根據GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[19]選取9 種異硫氰酸酯類香料，均購自美國Sigma公司。名稱及結構式見表1。

表1 9 種異硫氰酸酯類香料的名稱及結構式Table 1 Names and structures of nine isothiocyanate flavors

金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特菌ATCC 19115由大連工業(yè)大學食品學院微生物實驗室提供。

胰蛋白胨、酵母膏、氯化鈉、瓊脂粉、大豆蛋白胨、磷酸氫二鉀、葡萄糖（分析純） 大連博諾生物化學試劑公司；無水乙醇（分析純） 沈陽力誠試劑廠；RNAprep pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTM、Random primers[pd(N)6]、5×M-MLV Buffer、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RTase M-MLV（RNase H）寶生物工程（大連）有限公司；RNase-free water、熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）用引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

FA（A）型電子天平 上海民橋精密科學儀器公司；01J2003-04型高壓滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZHWY-2102C型雙層小容量全溫度恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；UV-1750型紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；MyiQTM2型熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 含硫香料的處理

按照下式求出所需原液和無水乙醇的體積后，將9 種異硫氰酸酯類香料稀釋至適當濃度，密封備用。

式中：c為稀釋的異硫氰酸酯類香料的濃度/（mol/L）；ρ為異硫氰酸酯類香料的密度/（g/L）；V1為異硫氰酸酯類香料的體積/L；M為異硫氰酸酯類香料的摩爾質量/（g/mol）；V2為無水乙醇的體積/L。

1.3.2 培養(yǎng)基的配制

溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基，用于金黃色葡萄球菌培養(yǎng)：胰蛋白胨1 g、酵母膏0.5 g、氯化鈉1 g、瓊脂1.5 g、去離子水100 mL，調節(jié)pH值至7.0，于121 ℃條件下滅菌20 min。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，用于單增李斯特菌培養(yǎng)：胰蛋白胨1.7 g、大豆蛋白胨0.3 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鉀0.25 g、葡萄糖0.25 g、瓊脂1.5 g、去離子水100 mL，調節(jié)pH值至（7.3±0.2），于121 ℃條件下滅菌15 min。

1.3.3 菌種的活化與培養(yǎng)

取-80 ℃凍存的菌液，吸取適量于液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h進行初次活化；將上述菌液劃平板過夜培養(yǎng)；挑取平板上的單菌落，轉接至液體培養(yǎng)基中。用生理鹽水將上述菌液配成含菌體為106～107CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3.4 抑菌圈直徑的測定

采用濾紙片法，測定抑菌圈直徑的大小[20-21]，并略有改進。取100 μL上述菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，平鋪直徑為1 cm的圓形濾紙片，添加6 μL的0.08 mol/L異硫氰酸酯類香料，置于37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18～24 h。每種香料做3 組平行，最終實驗結果取平均值。

1.3.5 最低抑菌濃度的測定

根據1.3.4節(jié)的結果，選取抑菌效果最好的異硫氰酸酯類香料測定最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。采用60%乙醇溶液將5 mol/L異硫氰酸酯類香料稀釋成17 個濃度，分別為2.50、1.25、0.63 mol/L等，直至76.28 μmol/L。取0.1 mL菌液添加至0.8 mL液體培養(yǎng)基中，分別添加0.1 mL不同濃度的異硫氰酸酯類香料，充分振蕩均勻，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。分別取培養(yǎng)液100 μL，涂布平板，37 ℃培養(yǎng)24 h[22]。觀察有無細菌生長，以無細菌生長的異硫氰酸酯類香料的最低濃度記為MIC。每種香料3 組平行，實驗結果取平均值。

1.3.6 異硫氰酸酯類香料作用下供試菌生長曲線的測定

將抑菌效果最好的異硫氰酸酯類香料濃度稀釋成1/4 MIC、1/2 MIC（根據1.3.5節(jié)結果），取菌液1 mL添加至99 mL液體培養(yǎng)基中，分別添加0.1 mL異硫氰酸酯類香料，以添加0.1 mL無水乙醇為對照組，振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h，利用紫外分光光度計測定菌液OD600nm，以OD600nm為縱坐標，時間t為橫坐標，繪制實驗組和對照組生長曲線。

1.3.7 RNA的提取和反轉錄熒光定量PCR

在LB培養(yǎng)基中分別添加不同抑菌濃度（根據1.3.5節(jié)結果）的異硫氰酸酯類香料，以未添加異硫氰酸酯類香料作為對照組，培養(yǎng)12 h，取適量的菌液，按照細菌總RNA提取試劑盒說明書步驟進行RNA提取，反轉錄為cDNA[23-24]。反轉錄熒光定量PCR的25 μL反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTM12.5 μL；濃度為10 μmol/L的引物對各0.5 μL；cDNA模板2 μL；RNase-free Water 9.5 μL。nuc基因引物：上游5’-GCG ATT GAT GGT GAT ACG GTT-3’、下游5’-AGC CAA GCC TTG ACG AAC TAA AGC-3’[25]；16S rRNA內參基因引物：上游5’-GCT GCC CTT TGT ATT GTC-3’、下游5’-AGA TGT TGG GTT AAG TCC C-3’[26]。

反應參數：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，于80 ℃停留15 s，收集熒光信號，反應40 個循環(huán)；并在60～95 ℃范圍內建立熔解曲線。16S rRNA作為內參基因，利用方程2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量[27]。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 異硫氰酸酯類香料對2 種革蘭氏陽性致病菌的抑菌效果

異硫氰酸酯類香料濃度稀釋為0.08 mol/L，在此濃度條件下對2 種供試菌的抑制作用見表2。結果表明，4 種異硫氰酸酯類香料對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌有抑制作用，分別為BZITC、MTPITC、PEITC和IAITC。

表2 9 種異硫氰酸酯類香料對供試菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of nine isothiocyanate flavors on the tested bacteria

2.2 異硫氰酸酯類香料的抑菌作用

圖1 異硫氰酸酯類香料對金黃色葡萄球菌（A）和單增李斯特菌（B）的抑制作用Fig. 1 Diameter of inhibition zone of isothiocyanate flavors against S. aureus (A) and L. monocytogenes (B)

以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌為供試菌，選取對其有抑菌作用的異硫氰酸酯類香料進行抑菌圈實驗。如圖1所示，4 種異硫氰酸酯類香料對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑菌能力大小均為BZITC≈PEITC＞MTPITC＞IAITC，其中BZITC和PEITC的抑菌效果顯著強于其他2 種香料（P＜0.05）。BZITC和PEITC對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別為（2.67±0.35）cm和（2.33±0.23）cm，對單增李斯特菌抑菌圈直徑分別為（2.55±0.26）cm和（2.09±0.30）cm。

BZITC和PEITC側鏈取代基中分別含有苯甲基和苯乙基，而其他2 種香料不含有，BZITC和PEITC的抑制作用較強，說明在本研究抑菌體系下，側鏈取代基含有苯基的異硫氰酸酯類香料對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制作用更強，對于含有苯環(huán)的這2 種異硫氰酸酯類香料，亞甲基的個數對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑菌效果無顯著的影響（P＞0.05）。

MTPITC和BUITC的分子式分別為C5H9NS2和C5H9NS，兩者結構相似，前者連接的基團為甲硫基，后者為甲基。MTPITC對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制能力較強，而BUITC無抑制作用，說明結構中甲硫基的存在或硫原子數目的增多同樣可能增強對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑菌活性，這與前期的研究結果，即具有相同取代基團的硫醚類香料，硫原子的數量可能對其抑菌效果有重要影響[28-29]相似。

IPITC、IBITC和IAITC在結構上相似，IPITC側鏈上無亞甲基、IBITC含有1 個亞甲基、IAITC含有2 個亞甲基。IAITC對金黃色葡萄球菌有微弱的抑制作用，而IPITC和IBITC無抑制作用，說明對于這3 種異硫氰酸酯類香料，結構相似，亞甲基的個數的增多可能對金黃色葡萄球菌的抑菌效果有一定的影響。

可見，不同的異硫氰酸酯類香料由于結構上的差異對同一種革蘭氏陽性致病菌的抑菌活性是不同的；同一種異硫氰酸酯類香料對不同的2 種革蘭氏陽性致病菌可能存在著菌間差異，但大體上趨勢一致。這與前期研究的含氧硫醚類香料的抑菌作用的結論相似[30]。BZITC和PEITC比其他7 種不含有苯基的異硫氰酸酯類香料抑菌效果更明顯，所以可能是側鏈苯基的存在極大地加強了異硫氰酸酯類香料的抑菌活性。

2.3 BZITC對2 種革蘭氏陽性致病菌的MIC

選取對這2 種供試菌均有最強抑制作用的BZITC，測定其MIC，結果見表3。當BZITC的濃度大于4.88 mmol/L時，對這2 種革蘭氏陽性致病菌均表現出良好的抑菌效果。BZITC對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于單增李斯特菌，其對金黃色葡萄球菌的MIC為0.61 mmol/L，對單增李斯特菌的MIC為4.88 mmol/L。

表3 BZITC對2 種革蘭氏陽性致病菌的MICTable 3 MIC of BZITC for two Gram-positive pathogenic bacteria

2.4 BZITC對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

如圖2所示，在0～14 h，金黃色葡萄球菌生長較快，14 h以后金黃色葡萄球菌的生長進入穩(wěn)定期。BZITC對金黃色葡萄球菌的抑菌作用在1/4 MIC～MIC之間具有一定的濃度依賴性。經MIC和1/2 MIC的BZITC處理的金黃色葡萄球菌生長受到明顯的抑制，特別是處于MIC的BZITC，金黃色葡萄球菌立即停止生長，1/2 MIC的BZITC大約抑制了金黃色葡萄球菌生長的1/8左右，濃度在1/4 MIC時，BZITC對金黃色葡萄球菌不再有抑制效果，與對照組相比的生長曲線幾乎重合。

圖2 BZITC對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig. 2 Effect of BZITC on the growth curve of S. aureus

2.5 BZITC對單增李斯特菌生長曲線的影響

圖3 BZITC對單增李斯特菌生長曲線的影響Fig. 3 Effect of BZITC on the growth curve of L. monocytogenes

由圖3可知，添加MIC、1/2 MIC和1/4 MIC的BZITC，單增李斯特菌的生長受到了抑制，MIC的BZITC完全抑制了單增李斯特菌的生長，1/2 MIC的BZITC抑制單增李斯特菌生長量的1/3左右，1/4MIC的BZITC仍可以輕微抑制單增李斯特菌的生長，表明抑制作用具有一定的濃度依賴性。

2.6 BZITC對金黃色葡萄球菌毒力基因nuc表達的影響

圖4 BZITC對金黃色葡萄球菌nuc基因表達的影響Fig. 4 Effect of BZITC on the expression of nuc gene in S. aureus

如圖4所示，與對照組相比，添加不同亞抑菌濃度的BZITC，金黃色葡萄球菌毒力基因nuc的表達量均極顯著降低（P＜0.01）。1/64 MIC的BZITC與對照組相比，nuc的表達量降低了30%左右，1/16 MIC的BZITC下降了55%左右，當BZITC的濃度為1/4 MIC，與對照組相比，nuc基因的表達量降低了約85%，只有對照組的15%左右，結果顯示出一種濃度依賴性。這與大蒜素以一種劑量依賴性方式降低金黃色葡萄球菌hla基因表達的結論類似，大蒜素的主要成分為甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚等含硫香料[26]。

3 結 論

根據實驗結果可知，9 種異硫氰酸酯類香料中，BZITC和PEITC對2 種革蘭氏陽性致病菌均有較強的抑制作用，側鏈苯基的存在很可能極大地加強了異硫氰酸酯類含硫香料的抑菌活性。BZITC對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強，MIC為0.61 mmol/L。BZITC對2 種革蘭氏陽性致病菌生長曲線的抑制作用呈現濃度依賴性。在MIC條件下，能夠完全抑制供試菌的生長，這與抑菌實驗的結果相符。亞抑菌濃度條件下的BZITC以一種濃度依賴性的方式，極顯著地降低了金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因的表達（P＜0.01）。

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Inhibitory Effect of Isothiocyanate Flavors on Two Gram-Positive Pathogenic Bacteria

WANG Yan, ZHOU Qianqian, WAN Xiulin, WANG Jiaying, HOU Hongman, ZHANG Gongliang*
(School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

Nine isothiocyanate flavors were selected to evaluate their antibacterial activities against Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes by measuring the diameter of inhibition zone. Besides, the structure-activity relationship for these compounds was further investigated. The highest inhibitory effect of sulfur-containing flavors was screened to investigate its impact on the expression of the thermostable nuclease (nuc) gene of S. aureus as determined by real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The results showed that benzyl isothiocyanate(BZITC), phenethyl isothiocyanate (PEITC), 3-methylthiopropyl isothiocyanate (MTPITC) and isoamyl isothiocyanate(IAITC) had better inhibitory effect against the two Gram-positive bacteria, and the inhibitory effect followed the descending order of BZITC ≈ PEITC 〉 MTPITC 〉 IAITC. Among the nine isothiocyanate flavors, BZITC showed the highest inhibitory effect against S. aureus with a minimal inhibitory concentration (MIC) of 0.61 mmol/L compared to 4.88 mmol/L for L. monocytogenes. At sub-inhibitory concentrations, BZITC markedly decreased the expression of the virulence factor nuc in S. aureus (P 〈 0.01). These results suggested that the presence of benzene ring may enhance the antibacterial activity of isothiocyanate flavors, and play an important role in the inhibitory effect of virulence factor gene nuc expression of BZITC in S. aureus.

isothiocyanate flavors; Gram-positive bacteria; antibacterial activity; structure-activity relationship; virulence factor expression

10.7506/spkx1002-6630-201721003

TS202.3

A

1002-6630（2017）21-0015-06

2016-09-13

國家自然科學基金面上項目（31571888）；遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃項目（LJQ2015010）

王巖（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：18804208629@163.com

*通信作者：張公亮（1978—），男，副教授，博士，研究方向為食品色香味化學。E-mail：zhanggl1978@hotmail.com

王巖, 周倩倩, 萬銹琳, 等. 異硫氰酸酯類香料對兩種革蘭氏陽性致病菌的抑制作用[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 15-20.

10.7506/spkx1002-6630-201721003. http://www.spkx.net.cn

WANG Yan, ZHOU Qianqian, WAN Xiulin, et al. Inhibitory effect of isothiocyanate flavors on two Gram-positive pathogenic bacteria[J]. Food Science, 2017, 38(21): 15-20. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721003. http://www.spkx.net.cn