蘇小燕，羅云俐，葉 濤，何云燕

(重慶市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 400013)

厄他培南耐藥腸桿菌科細(xì)菌碳青酶烯基因分析與耐藥傳遞機(jī)制研究

蘇小燕，羅云俐，葉 濤，何云燕△

(重慶市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 400013)

目的研究重慶某三級(jí)醫(yī)院對(duì)厄他培南不敏感腸桿菌科細(xì)菌所攜帶的碳青酶烯耐藥基因類(lèi)型及耐藥傳遞方式。方法對(duì)臨床分離出的厄他培南不敏感腸桿菌科細(xì)菌采用改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶產(chǎn)生情況；PCR擴(kuò)增常見(jiàn)耐藥基因并測(cè)序確定碳青酶烯酶基因；質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)研究耐藥基因的傳播方式。結(jié)果在臨床772株腸桿菌科細(xì)菌中分離出14株對(duì)厄他培南不敏感菌株(耐藥12株，中介2株)。13株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，其中12株攜帶blaOXA基因，9株攜帶blaIMP基因，2株攜帶blaKPC基因；首次發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶blaOXA-1、blaIMP-8和blaKPC-2 3種耐藥基因的陰溝腸桿菌，改良Hodge試驗(yàn)陰性的1株陰溝腸桿菌沒(méi)有檢測(cè)出耐藥基因，且該菌株質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)失敗。結(jié)論該院分離的厄他培南不敏感的腸桿菌科細(xì)菌所攜帶耐藥基因以blaIMP-8和blaOXA-1為主，且主要通過(guò)質(zhì)粒傳播。

細(xì)菌，抗藥性；腸桿菌科細(xì)菌；厄他培南；質(zhì)粒

腸桿菌科細(xì)菌是引起醫(yī)院感染最常見(jiàn)病原體。由于產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶和AmpC酶菌株的高分離率，碳青酶烯類(lèi)藥物成為治療耐藥腸桿菌感染的首選[1-3]。但隨著碳青酶烯類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用，腸桿菌科細(xì)菌對(duì)其耐藥已明顯升高，給臨床抗感染治療帶來(lái)挑戰(zhàn)[4]。產(chǎn)碳青霉烯酶是該類(lèi)細(xì)菌耐藥的最主要的因素之一。厄他培南是美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶的篩選藥物，本研究對(duì)2013年10月至2015年3月本院臨床分離的厄他培南不敏感的腸肝科細(xì)菌所攜帶的碳青霉烯酶基因種類(lèi)和耐藥基因傳遞方式進(jìn)行研究，為本院碳青酶烯類(lèi)耐藥的腸桿菌科細(xì)菌感染的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 2013年10月至2015年3月本院所有臨床標(biāo)本中分離出對(duì)厄他培南耐藥或中介[最小抑菌濃度(MIC)>4]的腸肝科細(xì)菌14株，包括8株陰溝腸桿菌和6株大腸埃希菌。分別來(lái)自骨科(4株)、ICU病房(3株)、呼吸科(2株)、泌尿科(2株)、普外科(2株)、心胸外科(1株)，標(biāo)本種類(lèi)為傷口分泌物(5株)、痰液(3株)、尿液(3株)、血液(1株)、膽汁(1株)和引流液(1株)。所收集菌株均排除同一患者來(lái)源的相同菌株。

1.2試劑與儀器 Vitek2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)；MH瓊脂(杭州天和公司)；Taq DNA聚合酶、DNA Marker、6×loading buffer上樣緩沖液(大連寶生物公司)；引物合成(上海英俊公司)；PCR擴(kuò)增儀、紫外凝膠成像儀(成都百樂(lè)科技公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI制訂的微生物臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及操作規(guī)程進(jìn)行標(biāo)本采集、接種和培養(yǎng)，用Vitek2 Compact系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定和藥敏檢測(cè)，結(jié)果解釋參照2014版CLSI M100-S24標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.3.2改良Hodge試驗(yàn)篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株 按藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程，將調(diào)成0.5麥?zhǔn)袭?dāng)量的大腸埃希菌ATCC 25922細(xì)菌稀釋液稀釋10倍后，均勻涂布于MH平板上，室溫待干。將厄他培南藥敏紙片(每片10 μg)貼于MH平板中間。用無(wú)菌接種環(huán)取適量待測(cè)菌、陽(yáng)性對(duì)照菌及陰性對(duì)照菌，自紙片外緣向平板邊緣劃直線，35 ℃過(guò)夜孵育后觀察結(jié)果。在中央抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)明顯矢狀生長(zhǎng)者為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。

1.3.3耐藥菌DNA模板的制備 取過(guò)夜震蕩培養(yǎng)的菌液1.5 mL，6 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清液；加750 μL去離子水重懸沉淀，6 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清液；加300 μL去離子水重懸沉淀，95 ℃ 水浴10 min，冰上速冷2 min；12 000 r/min 4 ℃離心2 min，取上清液200 μL即為所需DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4耐藥基因的檢測(cè) PCR總反應(yīng)體積為25 μL，包括Primer Buffer 12.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，待測(cè)菌的DNA模板1 μL，去離子水10.5 μL。引物序列及參考文獻(xiàn)見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件和結(jié)果觀測(cè)如來(lái)源文獻(xiàn)所述。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，用NCBI網(wǎng)站中的BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)具體基因型。

1.3.5質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn) 以分離的14株臨床菌株為供體菌，EC600為受體菌，分別取供體菌和受體菌過(guò)夜培養(yǎng)菌液200 μL和100 μL混合于600 μL的LB肉湯中，37 ℃靜置孵育18 h。接合子接種于含利福平700 μg/mL和厄他培南0.5 μg/mL的選擇培養(yǎng)基上，24～48 h后觀察，有菌落生長(zhǎng)者即為結(jié)合成功，并同時(shí)以供體菌和受體菌在同一培養(yǎng)基內(nèi)做陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果 臨床分離的14株細(xì)菌，對(duì)厄他培南中介2株，包含大腸埃希菌和陰溝腸桿菌各1株，其余12株菌均對(duì)厄他培南耐藥。

2.2改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果 本研究分離的14株耐藥菌中，13株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，1株陰溝腸桿菌為陰性。

2.3耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 14株耐藥菌中，13株細(xì)菌攜帶常見(jiàn)耐藥基因。其中12株攜帶blaOXA-1基因，8株攜帶blaIMP-8基因，2株攜帶blaKPC-2基因，1株攜帶blaIMP-26基因。1株陰溝腸桿菌不攜帶所擴(kuò)增的常見(jiàn)耐藥基因。見(jiàn)表2。

2.4質(zhì)粒結(jié)合和消除試驗(yàn) 除骨科病房分離的1株陰溝腸桿菌外，其余13株細(xì)菌質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)均成功。

表1 耐藥基因引物序列

表2 14株腸桿菌科細(xì)菌來(lái)源及其耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物在臨床上被認(rèn)為是治療多重耐藥菌感染的最佳選擇，但伴隨此類(lèi)藥物的大量應(yīng)用，世界各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類(lèi)的腸桿菌科細(xì)菌[2]。本研究共檢測(cè)臨床菌株772株，對(duì)厄他培南不敏感14株，分離率是1.81%，低于同期我國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示全國(guó)1.9%的耐藥率，高于重慶1.5%的耐藥率。

產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯耐藥的主要原因。碳青霉烯酶包括Ambler分類(lèi)中的A、B、D 3類(lèi)[7]。A類(lèi)是絲氨酸蛋白酶，主要包含blaSME和blaKPC。B類(lèi)為金屬酶，主要包含blaIMP和blaVIM。D類(lèi)又稱(chēng)為OXA酶。本研究對(duì)14株耐藥菌進(jìn)行常見(jiàn)耐藥基因擴(kuò)增和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)blaOXA-1和blaIMP-8是存在于本院耐藥菌中的主要耐藥基因,這與楊勇文等[8]報(bào)道的腸桿菌科細(xì)菌中主要流行的是blaOXA-48不同。blaKPC基因最常見(jiàn)于克雷伯菌屬，河南鄭州地區(qū)報(bào)道過(guò)攜帶blaKPC-2的肺炎克雷伯菌和日溝維腸桿菌[9],攜帶blaKPC-2的陰溝腸桿菌目前少見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)攜帶blaOXA-1，blaIMP-8和blaKPC-2 3種耐藥基因的陰溝腸桿菌國(guó)內(nèi)亦未見(jiàn)報(bào)道。14株耐藥菌有13株質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)成功，表明本院耐藥基因可以通過(guò)質(zhì)粒傳播。

本研究中，來(lái)自普外科的兩株陰溝腸桿菌攜帶相同耐藥基因，經(jīng)進(jìn)一步核實(shí)，兩株菌的分離時(shí)間相差兩周，其攜帶者存在同時(shí)住院的情況，所以不能排除醫(yī)院感染的可能性。骨科分泌物中分離的兩株大腸埃希菌同時(shí)攜帶blaOXA-1，但其分離時(shí)間間隔8個(gè)月，第1株耐藥菌攜帶者出院5個(gè)月后，第2株耐藥菌攜帶者才入院，可以排除醫(yī)院感染。

本研究還發(fā)現(xiàn)1株改良Hodge陰性的陰溝腸桿菌，耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果亦為陰性，初步推斷，可能是由于產(chǎn)ESBLs或Amp C酶等其他因素造成。該菌株質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)失敗，考慮耐藥基因可能是垂直傳播或通過(guò)整合子的方式水平傳播，有待進(jìn)一步確定。

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蘇小燕(1985-)，碩士，主要從事細(xì)菌耐藥性及感染預(yù)防方面的研究。△

，E-mail:1210427994@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.032

R378.2

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1671-8348(2017)28-3981-03

2017-04-15

2017-06-16)