梁馨云，趙 毅#，黎銀潮，李湛豪，曾慧玲，王 燕△

(廣東醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 523808)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.003

穩(wěn)定eIF1過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株的構(gòu)建及其功能研究*

梁馨云1，趙 毅1#，黎銀潮2，李湛豪2，曾慧玲2，王 燕1△

(廣東醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 523808)

目的構(gòu)建穩(wěn)定真核翻譯起始因子1(eIF1)過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株，研究其對鼻咽癌細(xì)胞增殖和遷徙活性的影響。方法采用pEGFP-C1真核表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建eIF1過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE1細(xì)胞，進(jìn)而獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株CNE1-eIF1及其對照細(xì)胞，以實時熒光定量PCR(qPCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗證該細(xì)胞中eIF1的過表達(dá)情況。采用細(xì)胞增殖與遷徙實驗分別檢測CNE1-eIF1細(xì)胞增殖和遷徙活性。結(jié)果酶切電泳鑒定及測序檢測顯示pEGFP-C1-eIF1真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。穩(wěn)定eIF1過表達(dá)的鼻咽癌CNE1細(xì)胞CNE1-eIF1的eIF1基因和蛋白的表達(dá)水平與空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比分別增加2.85倍和2.58倍(P<0.05)，而其增殖和遷徙活性組分別下調(diào)55%和36%(P<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建eIF1過表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞株，eIF1過表達(dá)可顯著下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷徙活性，提示其具有潛在的抑癌作用。

鼻咽腫瘤；穩(wěn)定細(xì)胞株；EIF1；基因轉(zhuǎn)染；真核翻譯因子

真核翻譯起始因子1(eukaryotic initiation factor1，eIF1)是該家族中最早被命名的成員，其蛋白相對分子質(zhì)量約12×103，基因位于17q21.2區(qū)[1-2]。eIF1因被發(fā)現(xiàn)能夠以其不同的蛋白質(zhì)表面區(qū)域結(jié)合40S核糖體亞基、eIF2、eIF3及eIF5等，參與組裝43S翻譯前起始復(fù)合物，高保真掃描并選擇翻譯起始密碼子而備受關(guān)注[3-4]。隨著對eIF4E、eIF5A等家族成員的功能進(jìn)一步研究，特別是在細(xì)胞發(fā)育、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等進(jìn)程中的作用不斷引發(fā)研究熱潮[5-6]，針對該家族其他成員的研究探索逐漸成為研究熱點[7-8]。本研究通過體外基因克隆技術(shù)，構(gòu)建了過表達(dá)eIF1的鼻咽癌細(xì)胞株及陰性轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞[9]，進(jìn)而就過表達(dá)eIF1對鼻咽癌細(xì)胞增殖和遷徙活性的影響進(jìn)行了研究，以期為探討真核翻譯調(diào)控機制對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響提供重要的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 真核表達(dá)載體pEGFP-C1及鼻咽癌CNE1細(xì)胞為廣東醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心保存提供，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.2試劑與引物 高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP107)、DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司；2×Power Taq Plus PCR MasterMix(PR4001)購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶HindIII/BamHI、RNAiso Plus(9108)及PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)購自寶生物工程(大連)有限公司；Lipofectamine?3000 Transfection Reagent(L3000008)購自Thermo Fisher Scientific公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，04913850001)購自羅氏(中國)公司；Anti-eIF1單克隆抗體(ab118979)、Anti-β Actin單克隆抗體(ab8226)購自Abcam公司；RIPA Lysis Buffer System(sc-364162)、BCA Protein Assay Kit(sc-202389)、Western Blotting Luminol Reagent(sc-2048)及HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(sc-2005)購自Santa Cruz公司。CCK8檢測試劑盒(CA1210)購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室(3422)購自Corning公司。eIF1的Real-time PCR引物，上游：5′-TGT AAC CAT TTG GGG TCC GCT T-3′，下游：5′-TTT GTA ATC TTA GGG CTC TGG GCTT-3′。內(nèi)參GAPDH的Real-time PCR引物，上游：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′，下游：5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3′。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 以Genbank中eIF1的mRNA序列(NM_005801.3)為模板，pEGFP-C1載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建eIF1過表達(dá)載體，插入序列兩端攜帶限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ/BamHⅠ的靶序列。以測序、PCR鑒定及酶切電泳驗證插入序列及過表達(dá)載體構(gòu)建情況。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將鼻咽癌CNE1細(xì)胞于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度、常規(guī)培養(yǎng)。分別設(shè)置常規(guī)培養(yǎng)組(Blank組)、過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(CNE1-eIF1組)、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(CNE1-NC組)及陰性轉(zhuǎn)染對照組(Control組)，每組3復(fù)孔。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參照說明書，采用Lipofectamine?3000 Transfection Reagent以試劑盒參考比例轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA入鼻咽癌CNE1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后12 h換液。轉(zhuǎn)染后24～48 h觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，計算轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)預(yù)實驗驗證，以轉(zhuǎn)染后48 h熒光表達(dá)為鑒定細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的依據(jù)。

1.2.4穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株篩選及鑒定 轉(zhuǎn)染后48 h，以含有G418(800 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，而后挑取單克隆加壓篩選2個月，3～4 d更換含有G418(終濃度400 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液1次篩選培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)穩(wěn)定增長后，挑取單克隆細(xì)胞簇進(jìn)行RNA及蛋白水平鑒定，其中RNA檢測采用實時熒光定量PCR(qPCR)，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，采用寶生物工程(大連)有限公司RNAiso plus試劑盒提取細(xì)胞總RNA，以PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA，并用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)進(jìn)行檢測。蛋白檢測采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)，參照說明書，以RIPA Lysis Buffer System試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，以BCA Protein Assay Kit對總蛋白定量，而后以50 μg總蛋白及蛋白Marker上樣，采用12% SDS/PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印，特異性一抗4 ℃撫育過夜，以Western Blotting Luminol Reagent檢測。留取與對照組相比，eIF1過表達(dá)水平最高的1株細(xì)胞株，即為CNE1-eIF1過表達(dá)細(xì)胞，同時結(jié)合熒光表達(dá)鑒定法構(gòu)建空載體轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞株CNE1-NC細(xì)胞。

1.2.5細(xì)胞增殖實驗 選用CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒，取對數(shù)生長期各組細(xì)胞以每孔3 000個分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞接種后12 h，設(shè)置重復(fù)孔，其后嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，BioTek公司Synergy 2多功能酶標(biāo)儀450 nm波長測每孔吸光度(A)值。與對照組相比，計算細(xì)胞增殖比率。

1.2.6細(xì)胞遷徙實驗 采用Corning公司Transwell小室，取對數(shù)生長期細(xì)胞，按每毫升5×105個細(xì)胞濃度加入200 μL無血清細(xì)胞懸液到小室中，下室中加入含10%FBS和1%纖維粘連蛋白的完全培養(yǎng)基500 μL，設(shè)置3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室用PBS 輕輕洗2遍，用棉簽去除上室膜表面的細(xì)胞。甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫室溫下染色30 min，PBS洗3遍使結(jié)晶紫完全沖干凈，在高倍鏡視野下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取交叉十字共10 個視野，計算平均值。與對照組相比，計算細(xì)胞遷移比率。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)粒酶切電泳及測序結(jié)果 如圖1所示，可見環(huán)狀質(zhì)粒DNA被切斷后呈現(xiàn)線性條帶改變。證明質(zhì)粒構(gòu)建插入內(nèi)切酶HindⅢ及BamHⅠ的酶切位點正確可靠。雙向測通，pEGFP-C1-eIF1載體MCS(Multiple cloning site)區(qū)插入序列與擬構(gòu)建的eIF1表達(dá)序列一致,見圖2。

1:pEFGP-C1-eIF1載體;2:pEGFP-C1-eIF1載體經(jīng)HindⅢ酶切后形成的線性DNA;3:pEGFP-C1-eIF1載體經(jīng)BamHⅠ酶切后形成的線性DNA
圖1 pEGFP-C1-eIF1質(zhì)粒酶切電泳圖

圖2 pEFGP-C1-eIF1插入序列測序峰

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況 與Blank組、Control組相比，CNE1-eIF1組、CNE1-NC組細(xì)胞均出現(xiàn)大量明顯的綠色熒光，計數(shù)200個細(xì)胞，兩組細(xì)胞均顯示轉(zhuǎn)染效率為90%以上，說明轉(zhuǎn)染成功，外源GFP綠色熒光蛋白表達(dá)正常。見圖3。

2.3eIF1過表達(dá)鑒定 Blank組和CNE1-NC組細(xì)胞eIF1基因、蛋白的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與CNE1-NC組相比，CNE1-eIF1組細(xì)胞的eIF1 mRNA、蛋白的表達(dá)水平分別上調(diào)2.85倍、2.58倍(P<0.05)。見圖4、5。

2.4eIF1過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞增殖和遷徙活性的影響 Blank組和CNE1-NC組細(xì)胞增殖、遷移活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與CNE1-NC組相比，CNE1-eIF1組細(xì)胞的增殖、遷移活性分別下調(diào)55%、36%(P<0.05)。見圖6。

圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h熒光表達(dá)

A：內(nèi)參基因GAPDH及目的基因eIF1的溶解曲線圖；B：3組細(xì)胞eIF1 mRNA相對表達(dá)量
圖4 eIF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株eIF1 mRNA表達(dá)水平

β-actin：內(nèi)參基因GAPDH；eIF1：目的基因
圖5 eIF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株eIF1蛋白表達(dá)水平

A：增殖；B：遷徙
圖6過表達(dá)eIF1對鼻咽癌CNE1細(xì)胞的增殖和遷徙活性的影響

3 討 論

作為真核翻譯起始因子家族成員中第1個與擬表達(dá)基因mRNA起始區(qū)域結(jié)合的成分，eIF1對于選擇并掃描相關(guān)基因mRNA自5′帽子結(jié)構(gòu)區(qū)至起始密碼子AUG序列前，進(jìn)而控制翻譯起始的保真性與延續(xù)性等過程至關(guān)重要[3]。Lind等[1]研究發(fā)現(xiàn)，eIF1與eIF1A一起通過控制翻譯起始階段，針對mRNA起始密碼第1位和第3位堿基配對的識別與自由能的調(diào)控，升高錯配自由能需求，進(jìn)而保真調(diào)節(jié)核糖體tRNA識別結(jié)合mRNA起始密碼子的掃描過程。另外，在密碼子與反密碼子沒有正確配對時，eIF1可以抑制GTP的水解，控制AUG上下游堿基序列的配對，調(diào)控翻譯起始過程。當(dāng)密碼子的識別完成后，eIF1 的抑制作用被減弱，經(jīng)由精確的起始密碼子及其上下游堿基的配對eIF1的抑制作用得以減弱[10]，從而啟動翻譯起始復(fù)合物的合成。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白翻譯起始時40 S核糖體亞基上面的mRNA結(jié)合通道為關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)eIF1和eIF1A先后結(jié)合到亞基上面時，特別是eIF1 結(jié)合到40 S核糖體亞基P位點后，其mRNA結(jié)合通道才得以打開，擬表達(dá)基因的mRNA結(jié)合到核糖體亞基上，核糖體tRNA開始沿mRNA的5′端進(jìn)行掃描，識別AUG起始密碼子及其上下游堿基序列，堿基配對無誤后，eIF1 從核糖體亞基上釋放出來，翻譯起始復(fù)合物開始形成， mRNA結(jié)合通道關(guān)閉，蛋白翻譯起始[11-12]。在此過程中，特別是在核糖體完成與擬表達(dá)基因mRNA起始密碼子識別后，eIF1的存在對翻譯前起始復(fù)合物的形成，GTP水解和能量釋放,乃至蛋白翻譯過程的抑制作用，不容忽視[13]。

目前，隨著真核翻譯起始家族成員在多種人類疾病，尤其是腫瘤相關(guān)疾病中的研究日漸深入，如eIF4E、eIF5A等在乳腺癌、大腸癌和鼻咽癌等多種腫瘤中的促癌作用已成為相關(guān)研究熱點[14-15]，作為啟動真核蛋白翻譯起始的關(guān)鍵分子，eIF1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的作用亟待進(jìn)一步的研究。為研究eIF1在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中作用，本研究成功構(gòu)建了eIF1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE1細(xì)胞中，篩選并成功構(gòu)建了過表達(dá)eIF1的鼻咽癌CNE1-eIF1細(xì)胞及其對照陰性CNE1-NC細(xì)胞，從而為進(jìn)一步探討蛋白翻譯起始調(diào)控在癌基因表達(dá)和腫瘤形成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的影響提供了研究工具。在此基礎(chǔ)上,筆者就eIF1對鼻咽癌細(xì)胞增殖和遷徙活性的影響進(jìn)行了初步的探索，結(jié)合文獻(xiàn)研究，筆者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的eIF1可明顯下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷徙活性，提示eIF1在鼻咽癌CNE1細(xì)胞的蛋白翻譯起始過程中具有重要的調(diào)控作用，其對CNE1細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物的形成和真核細(xì)胞蛋白翻譯的啟動可能具有重要的開關(guān)抑制作用，并可由此影響到細(xì)胞的一系列生物學(xué)行為，對腫瘤細(xì)胞可能具有潛在的抑癌作用。

目前國內(nèi)外雖已有多家研究機構(gòu)致力于此方面的相關(guān)研究，但均無明確的突破，本研究的發(fā)現(xiàn)為真核細(xì)胞蛋白翻譯的機制研究和腫瘤癌基因異常表達(dá)的調(diào)控研究提示了研究方向，為進(jìn)一步的探討eIF1影響鼻咽癌病變轉(zhuǎn)移機制奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1]Lind C,Aqvist J.Principles of start codon recognition in eukaryotic translation initiation [J].Nucleic Acids Res,2016,44(17):8425-8432.

[2]Sheikh MS,Fernandez-Salas E,Yu M,et al.Cloning and characterization of a human genotoxic and endoplasmic reticulum stress-inducible cDNA that encodes translation initiation factor 1(eIF1(A121/SUI1))[J].J Biol Chem,1999,274(23):16487-16493.

[3]Hussain T,Llácer JL,Fernández IS,et al.Structural changes enable start codon recognition by the eukaryotic translation initiation complex [J].Cell,2014,159(3):597-607.

[4]Lind C,Esguerra M,?qvist J.A close-up view of codon selection in eukaryotic initiation [J].RNA Biol,2017,14(7):815-819.

[5]Nakanishi S,Cleveland JL.Targeting the polyamine-hypusine circuit for the prevention and treatment of cancer [J].Amino Acids,2016,48(10):2353-2362.

[6]Fischer PM.Cap in hand:targeting eIF4E [J].Cell cycle,2009,8(16):2535-2541.

[7]劉岱松,楊思思,譚江琳,等.真核起始因子6抑制小鼠腎間質(zhì)纖維化的組織學(xué)研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,43(16):2022-2025.

[8]Lu C,Makala L,Wu D,et al.Targeting translation:eIF4E as an emerging anticancer drug target [J].Expert Rev Mol Med,2016,18：e2.

[9]聶偉,王小毅,邱干,等.ABCG2過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化能力的影響 [J].重慶醫(yī)學(xué),2016,45(26):3622-3623，3626.

[10]Ivanov IP,Loughran G,Sachs MS,et al.Initiation context modulates autoregulation of eukaryotic translation initiation factor 1 (eIF1) [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(42):18056-18060.

[11]Martin-Marcos P,Nanda JS,Luna RE,et al.Enhanced eIF1 binding to the 40S ribosome impedes conformational rearrangements of the preinitiation complex and elevates initiation accuracy [J].RNA,2014,20(2):150-167.

[12]Maduzia LL,Moreau A,Poullet N,et al.The role of eIF1 in translation initiation codon selection in Caenorhabditis elegans [J].Genetics,2010,186(4):1187-1196.

[13]Llácer JL,Hussain T,Marler L,et al.Conformational differences between open and closed states of the eukaryotic translation initiation complex [J].Mol Cell,2015,59(3):399-412.

[14]Ramon S,De Mattos-Arruda L,Sonenberg N,et al.The intra-tumor heterogeneity of cell signaling factors in breast cancer:p4E-BP1 and peIF4E are diffusely expressed and are real potential targets [J].Clin Transl Oncol,2014,16(11):937-941.

[15]Mathews MB,Hershey JW.The translation factor eIF5A and human cancer [J].Biochim Biophys Acta,2015,1849(7):836-844.

StudyonconstructionandfunctionofCNE1cellsstablyover-expressingeIF1gene*

LiangXinyun1,ZhaoYi1#,LiYinchao2,LiZhanhao2,ZengHuiling2,WangYan1△

(1.BasicMedicalCollege;2.SecondClinicalMedicalCollege,GuangdongMedicalUniversity,Dongguan,Guangdong523808,China)

ObjectiveTo establish nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE1) with eIF1 gene stable over-expression and to study its effects on the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells.MethodsEIF1 over-expression vector was constructed by adopting the pEGFPC1 eukaryotic expression system for transfecting nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells.Thus the stably transfected EIF1-elF1 and its control cells were obtained.The over-expression situation of eIF1 in these cells was verified by real time fluorescence quantitative PCR(qPCR) and Western blot.The proliferation and migration activity of CNE1-eIF1 cells were tested by adopting the cell proliferation and migration tests.ResultsThe enzyme digestion electrophoresis identification and sequencing showed that the pEGFPC1-eIF1 eukaryotic expression vector was successfully constructed.After mRNA and protein expression identification,compared with the reloading plasmid transfection group,the eIF1 gene mRNA and protein expression levels in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE1 stably over-expressing elF1 were up-regulated by 2.85 folds and 2.58 folds respectively (P<0.05),while its proliferation and migration activities were down-regulated by 55% and 36% respective (P<0.05).ConclusionThe nasopharyngeal carcinoma cell line over-expressing elF1 is successfully constructed,the eIF 1 over-expression could significantly down-regulate the proliferation and migration activities of nasopharyngeal carcinoma cells,suggesting that eIF1 has potential anti-tumor effect.

nasopharyngeal neoplasms;stable cell lines;EIF1;gene transfection;eukaryotic translation factor

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(2015A030310046)；廣東省中醫(yī)藥局科研基金資助項目(20151261)；廣東醫(yī)科大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃基金資助項目(201510571003)。

梁馨云(1981-)，實驗師，本科，主要從事腫瘤學(xué)與病原生物學(xué)研究。#共同第一作者趙毅(1978-)，副教授，博士，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究?！?/p>

，E-mail：657057106@qq.com。

R73-35

A

1671-8348(2017)28-3896-04

2017-04-18

2017-06-06)