李海洋，黃李雅，吳 陽，劉 慧

(1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內(nèi)科，銀川 750004；3.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西咸陽 712000)

·論著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.002

趨化因子Fractalkine通過調(diào)控IL-6/STAT3信號通路對人胰腺癌細胞株增殖和侵襲的影響研究*

李海洋1，黃李雅2△，吳 陽3，劉 慧1

(1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院消化內(nèi)科，銀川 750004；3.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西咸陽 712000)

目的探討趨化因子Fractalkine(FKN)通過調(diào)控白細胞介素(IL)-6/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3信號通路對人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1和SW-1990增殖、侵襲的影響。方法以腺病毒為載體構(gòu)建、合成FKN-小干擾RNA(siRNA)并轉(zhuǎn)染PANC-1和SW-1990。應(yīng)用CCK-8法和Transwell檢測細胞增殖和侵襲力，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)法檢測FKN、IL-6和STAT3蛋白及mRNA的表達。結(jié)果轉(zhuǎn)染FKN-siRNA 24 h時，PANC-1及SW-1990各組細胞吸光度值(A值)無明顯變化，在48 h和72 h時，F(xiàn)KN-siRNA組A值明顯高于對照組和FKN-siRNA陰性組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染FKN-siRNA后，PANC-1及SW-1990 FKN-siRNA組細胞侵襲力明顯強于對照組和FKN-siRNA陰性組(P<0.05)。PANC-1及SW-1990轉(zhuǎn)染FKN-siRNA后，與對照組和FKN-siRNA陰性組相比較，F(xiàn)KN-siRNA組細胞FKN蛋白和mRNA的表達明顯減少(P<0.05),IL-6與STAT3蛋白和mRNA的表達明顯增加(P<0.05)。結(jié)論趨化因子FKN可能通過IL-6/STAT3信號通路對胰腺癌細胞生物學活性發(fā)揮了抑制作用。

趨化因子Fractalkine；轉(zhuǎn)染；胰腺癌細胞株；白細胞介素6；STAT3

胰腺癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。在我國，近10年胰腺癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第6位，胰腺癌患者的中位生存時間為3～5個月，1年生存率小于10%[1]，其嚴重危害著人民的身體健康。目前胰腺癌的早期診斷及有效治療還是尚待解決的問題。趨化因子Fractalkine(FKN)是CX3C家族中的唯一成員，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著一定的作用，如介導(dǎo)癌細胞黏附、浸潤及轉(zhuǎn)移，促進腫瘤血管生成等，由于其具有特殊的白細胞趨化及分子黏附作用，F(xiàn)KN在各腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，即抑制腫瘤生長和促進腫瘤生長。白細胞介素-6(IL-6)是一種多效能細胞因子，其結(jié)合可溶性IL-6受體 (soluble interleukin-6 receptor，sIL-6R) 形成IL-6/sIL-6R復(fù)合物，繼而活化細胞膜表面的gpl30，誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3活化[2]，IL-6/STAT3信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有著密切的聯(lián)系。本實驗擬通過以腺病毒為載體，包裝構(gòu)建FKN-小干擾RNA(siRNA)并沉默F(xiàn)KN在人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1及SW1990中的表達，探討FKN對人胰腺癌細胞株生物學特性的影響和IL-6/STAT3信號通路在人胰腺癌細胞株中的作用變化，尋求臨床治療胰腺癌新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1主要試劑 FKN、STAT3、IL-6和辣根過氧化物酶標記的二抗等抗體(美國abcam公司)，內(nèi)參GAPDH(北京中杉金橋生物公司)；CCK-8(美國Sigma公司)，Transwell小室(美國Millipore Carrlgtwahill公司)，Matrigel膠(美國B&D公司)；TRIzoI和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher scientific公司)；RT-qPCR試劑盒(美國KAPA Biosystems公司)。

1.1.2細胞株、腺病毒載體 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1及SW1990(上海北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司)在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院外科實驗室傳代培養(yǎng)。上海生工生物工程有限公司設(shè)計、構(gòu)建、合成、鑒定、測序并擴增以腺病毒為載體的FKN-siRNA。

1.2方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)染 將人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1及SW1990使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞按每孔1×105接種于6孔板中，加入完全培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%以上時，加入腺病毒包裝的FKN-siRNA(10 mmol/L)對細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染適當時間后繼續(xù)后續(xù)的實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期細胞按每孔1×105接種于96孔板中(每孔100 μL)，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。設(shè)置對照組、FKN-siRNA組及FKN-siRNA陰性組，每組均設(shè)3個復(fù)孔，分別在24、48、72 h時向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h,用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度值(A值)。

1.2.3細胞侵襲實驗 將Transwell小室置于24孔板中，在小室內(nèi)膜上加入1∶8稀釋的Matrigel膠(每孔60 μL)，放置于培養(yǎng)箱4～5 h。設(shè)置對照組、FKN-siRNA組及FKN-siRNA陰性組，每組均設(shè)3個復(fù)孔，并向各Transwell小室中加入細胞懸液每孔100 μL(每孔1×105)，向24板下室中加入600 μL含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦去膜上層的細胞，結(jié)晶紫染色，在高倍顯微鏡下隨機觀察5個視野細胞，計數(shù)。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測FKN、IL-6和STAT3蛋白的表達 提取人胰腺癌細胞株總蛋白，并采用BCA法檢測蛋白濃度，加入蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，100 V恒定電壓轉(zhuǎn)膜110 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉90 min后，分別加入FKN、IL-6和STAT3一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000)，室溫搖床孵育90 min，SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物發(fā)光，使用Image Quant LAS 4000進行曝光，采用Image J軟件對FKN、IL-6、STAT3和內(nèi)參GAPDH蛋白條帶進行分析，以內(nèi)參GAPDH與FKN、IL-6和STAT3分別相比較的值作為其蛋白相對表達量。

1.2.5實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)法檢測FKN、IL-6和STAT3 mRNA的表達 應(yīng)用TRIzol提取細胞總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。FKN：上游引物5′-CTG CCC TGA CTA GAA ATG GT-3′，下游引物5′-CAG TCG GTT CCA AAG TAA GG-3′，141 bp；IL-6：上游引物5′-TGC CTT CTT GGG ACT GAT-3′，下游引物5′-CTG GCT TTG TCT TTC TTG TTA-3′，384 bp；STAT3：上游引物5′-GAT GCT GGA GGA GAG AAT CG-3′，下游引物5′-TGT GTT TGT GCC CAG AAT GT-3′，265 bp；GAPDH：上游引物5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，460 bp。根據(jù)KAPA SYBR FAST qPCR試劑盒要求加入各反應(yīng)體系量，采用CFX ConnetTM熒光定量PCR儀進行擴增定量，F(xiàn)KN、IL-6和STAT3 mRNA的相對表達量通過2-△△CT法計算得到，結(jié)果采用倍數(shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1FKN-siRNA轉(zhuǎn)染后對人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1及SW-1990增殖的影響 通過CCK-8法檢測細胞的增殖活性顯示：PANC-1及SW-1990轉(zhuǎn)染FKN-siRNA 24 h時，各組細胞A值無明顯變化，在48 h和72 h時，F(xiàn)KN-siRNA組A值明顯高于對照組和FKN-siRNA陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 PANC-1不同時點各組的吸光度曲線

圖2 SW-1990不同時點各組的吸光度曲線

2.2FKN-siRNA轉(zhuǎn)染后對人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1及SW-1990侵襲的影響 PANC-1及SW-1990轉(zhuǎn)染FKN-siRNA后， FKN-siRNA組細胞侵襲力明顯強于對照組和FKN-siRNA陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 PANC-1及SW-1990各組穿膜細胞數(shù)比較

2.3Western blot檢測FKN、IL-6和STAT3蛋白的表達 PANC-1及SW-1990轉(zhuǎn)染FKN-siRNA后，與對照組和FKN-siRNA陰性組相比較，F(xiàn)KN-siRNA組細胞FKN蛋白的表達明顯減少(P<0.05),IL-6與STAT3蛋白的表達明顯增加(P<0.05)。見圖3、4。

圖3 PANC-1中FKN、IL-6及STAT3蛋白的表達

圖4 SW-1990中FKN、IL-6及STAT3蛋白的表達

2.4RT-qPCR法檢測FKN、IL-6和STAT3 mRNA的表達 PANC-1轉(zhuǎn)染FKN-siRNA后顯示:對照組細胞FKN mRNA的表達是FKN-siRNA組1.74倍，F(xiàn)KN-siRNA陰性組細胞FKN mRNA是FKN-siRNA組的1.83倍，F(xiàn)KN-siRNA組細胞中FKN mRNA的表達明顯下降(P<0.05)；FKN-siRNA組細胞IL-6和STAT3 mRNA的表達分別是對照組的2.03倍和1.79倍，F(xiàn)KN-siRNA陰性組的1.95倍和1.81倍，F(xiàn)KN-siRNA組細胞IL-6和STAT3 mRNA的表達明顯升高(P<0.05)。SW-1990轉(zhuǎn)染FKN-siRNA后顯示：對照組細胞FKN mRNA的表達是FKN-siRNA組1.81倍，F(xiàn)KN-siRNA陰性組細胞FKN mRNA的表達是FKN-siRNA組的1.77倍，F(xiàn)KN-siRNA組細胞FKN mRNA表達明顯下降(P<0.05)；FKN-siRNA組細胞IL-6和STAT3 mRNA的表達分別是對照組的1.76倍和1.80倍，F(xiàn)KN-siRNA陰性組的1.71倍和1.79倍，F(xiàn)KN-siRNA組細胞IL-6和STAT3 mRNA的表達明顯升高(P<0.05) 。

3 討 論

趨化因子FKN是CX3C亞家族中的唯一成員，與其他趨化因子區(qū)別在于它是一種跨膜糖蛋白，其具有獨特的趨化和黏附雙重作用。多項研究表明，F(xiàn)KN在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。一方面，F(xiàn)KN可以介導(dǎo)腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤血管的形成從而促進腫瘤生長[2-3]。另一方面，F(xiàn)KN又可以趨化NK細胞、CD8+T細胞及CD4+T細胞等免疫細胞到腫瘤的局部，減少侵襲及轉(zhuǎn)移的發(fā)生，進而抑制腫瘤的發(fā)生[4]。FKN在胰腺癌中發(fā)揮著何種作用，這需要進一步探討研究。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過對人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1和SW1990轉(zhuǎn)染FKN-siRNA后，細胞侵襲力明顯增強，反映出FKN可能在胰腺癌細胞株中發(fā)揮著抑制作用，這種假設(shè)是否成立，并且趨化因子FKN是否還在其他消化系統(tǒng)腫瘤中起到類似的抑制作用。Jones等[5]研究發(fā)現(xiàn)，將FKN導(dǎo)入到小鼠肝癌細胞中，然后種植在小鼠體內(nèi)，可以增強抗腫瘤免疫，從而抑制肝癌的生長；Tang等[6]發(fā)現(xiàn)高表達FKN的結(jié)直腸癌患者預(yù)后要好于低表達FKN的患者。以上研究初步證實趨化因子FKN在消化系統(tǒng)腫瘤中能夠抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，這與本實驗結(jié)果相一致。 Ohta等[7]研究顯示，通過結(jié)合腫瘤細胞表面的膜型FKN后可以激活NK細胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，進一步證明了FKN具有抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，IL-6/STAT3信號通路在多種腫瘤中起著非常重要的作用。有研究表明，結(jié)直腸癌患者的血清和癌組織中IL-6的水平均升高，且與腫瘤大小、腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后和生存率相關(guān)[8-10]，并且90%以上的結(jié)直腸癌細胞發(fā)生STAT3的持續(xù)活化，其加強了腫瘤細胞的增殖和腫瘤的生長[11]。在宮頸鱗狀細胞癌中亦發(fā)現(xiàn)了STAT3的持續(xù)激活[12]。IL-6/STAT3信號通路作為重要的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，已證明IL-6/STAT3信號通路在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的誘導(dǎo)、促進作用[13-14]。本實驗顯示：與對照組和FKN-siRNA陰性組相比較，F(xiàn)KN-siRNA組細胞FKN的蛋白及mRNA的表達減少，IL-6、STAT3的蛋白及mRNA的表達增加；細胞侵襲試驗證實FKN-siRNA組細胞侵襲力較對照組與FKN-siRNA陰性組強。這都初步闡明FKN在胰腺癌中抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，IL-6/STAT3信號通路在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。黃陳等[15]研究顯示，通過AG490可以抑制胰腺癌中SATA3的活化，從而降低腫瘤細胞的增殖和侵襲力，促進細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著趨化因子FKN表達的下調(diào)，IL-6/STAT3表達明顯升高，說明趨化因子FKN與STAT3信號通路之間存在著一定的相關(guān)性，在一定程度上認為FKN是通過IL-6/STAT3信號通路對胰腺癌的增殖和侵襲產(chǎn)生影響。

本研究初步探討了FKN對胰腺癌增殖和侵襲的影響及與IL-6/STAT3信號通路之間的關(guān)系，結(jié)果顯示FKN對胰腺癌細胞生物學活性起著抑制作用，并且通過IL-6/STAT3信號通路對胰腺癌的增殖和侵襲產(chǎn)生影響。這揭示著通過阻斷趨化因子FKN及IL-6/STAT3信號通路可能為胰腺癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。

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EffectsofchemokineFractalkineonproliferationandinvasionofhumanpancreaticcancercelllinesbyregulatingIL-6/STAT3signalpathway*

LiHaiyang1,HuangLiya2△,WuYang3,LiuHui1

(1.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;2.DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;3.DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,ShaanxiTraditionalChineseMedicineUniversity,Xianyang,Shaanxi712000,China)

ObjectiveTo explore the effects of chemokine Fractalkine(FKN) on the proliferation and invasion of human pancreatic cancer cell lines PANC-1 and SW-1990 by regulating IL-6/STAT3 signal pathway.MethodsAdenovirus served as the vector to construct and synthesizing FKN-small interfering RNA(siRNA),then which was transfected into PANC-1 and SW-1990.The proliferation and invasion ability of cells was determined by CCK-8 assay and Transwell assay.Expression of FKN,IL-6 and STAT3 protein and mRNA was detected by Western blot and RT-qPCR.ResultsAfter transfecting FKN-siRNA for 24 h,the absorbance values(A value) in the PANC-1 and SW-1990 groups had no significant changes,the A value at 48,72 h in the FKN-siRNA group was significantly higher than that in the control group and FKN-siRNA negative group (P<0.05).After transfecting FKN-siRNA,the cellular invasive ability in the PANC-1 and SW-1990 FKN-siRNA group was significantly stronger than that in the control group and FKN-siRNA negative group(P<0.05).After transfecting FKN-siRNA in cell lines PANC-1 and SW-1990,compared with the control group and FKN-siRNA negative group,the FKN protein and mRNA expression in the FKN-siRNA group was significantly decreased(P<0.05),while IL-6 and STAT3 protein and mRNA expression was significantly increased(P<0.05).ConclusionChemokine FKN might play the inhibiting effect on the biological activity of pancreatic cancer cells by regulating IL-6/STAT3 signal pathway.

chemokine Fractalkine;transfection;pancreatic cancer cell lines;interleukin-6;STAT3

國家自然科學基金資助項目(81460367)；寧夏自然科學基金資助項目(NZ14118)。

李海洋(1988-)，在讀碩士，主要從事胰腺疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。△

，E-mail:txmbw@126.com。

R567

A

1671-8348(2017)28-3893-03

2017-05-18

2017-07-06)