董雅琴，劉 爽，鄭 輝，張 志，吳發(fā)興，李曉成

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

三種偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測試劑盒的比較

董雅琴1，劉 爽1，鄭 輝2，張 志1，吳發(fā)興1，李曉成1

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

為比較3種品牌（A、B、C）偽狂犬病病毒（PRV）gE抗體ELISA檢測試劑盒的臨床使用效果，應用中和試驗來標定偽狂犬病非免疫豬場的180份臨床血清樣品，同時用3種試劑盒進行檢測，并對試劑盒的重復性、敏感性、特異性以及與中和試驗結果的符合度等指標進行測定與分析。結果顯示：3種試劑盒的批內穩(wěn)定性均較好，變異系數(shù)均小于10%；批間重復性差異較大，變異系數(shù)最小者為8.09%，最大者高達21.31%；3種試劑盒的診斷特性良好，敏感性為95.56%～97.78%，特異性為94.44%～100%；各試劑盒檢測結果與中和試驗結果均完全相符（Kappa值為0.91～0.96）。比較結果表明，3種試劑盒均適用于臨床樣品的PRV gE抗體檢測，其中穩(wěn)定性及敏感性俱佳的試劑盒C更適用于PRV的持續(xù)監(jiān)測、早期發(fā)現(xiàn)、引種檢疫及凈化效果評估，而特異性與準確性最高的試劑盒B更適用于貴重病畜的診斷淘汰。因此，生產實踐中應根據(jù)診斷目的合理選擇最適試劑盒。

偽狂犬病毒；gE抗體；ELISA檢測試劑盒；比較

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）又稱Aujeszky氏病，是發(fā)生于豬及多種家畜和野生動物的高度接觸性傳染病。其病原為偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）。動物感染后會出現(xiàn)發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎等急性病癥[1]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為須報告動物疫病[2]。我國將其列入《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》優(yōu)先防治疫病及重點凈化考核疫病，并將到2020年全國所有種豬場達到PR凈化標準列為控制目標[3]。為配合豬場做好PR的凈化工作，快速準確鑒定PRV野毒感染尤為必要。

當前我國主要通過疫苗免疫進行PR防控。PRV基因缺失疫苗的廣泛使用不但可以有效控制PR，還可以通過gE抗體檢測來鑒定豬只是否感染PRV野毒。隨著PRV gE基因缺失疫苗的廣泛應用，針對該基因建立的抗體ELISA檢測方法已被普遍用于PRV野毒感染的檢測。目前，市場上PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒品牌眾多。如何合理選擇診斷試劑盒是基層檢測中普遍存在的問題。本研究選擇3個應用較廣的進口品牌試劑盒，從敏感性、特異性、穩(wěn)定性、準確性等方面進行比較，以期為實踐中PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒的合理選擇提供依據(jù)，也為PR凈化提供一定的技術保障。

1 材料與方法

1.1 ELISA試劑盒

3種PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒，每種試劑盒各3個批次：A品牌試劑盒（批號CL456、BL680、BL524）、B品牌試劑盒（批號MAE100633、MAE100640、MAE100652）、C品牌試劑盒（批號P-01024、P-01118、P-1211）。3種試劑盒的原理均為阻斷ELISA。

1.2 病毒與細胞

PRV閩A株，豬腎細胞傳代細胞系PK-15，均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心畜病監(jiān)測室保存。

1.3 參考血清

PR抗體陽性參考血清，中和抗體效價為1∶（1 651±839），PR抗體陰性參考血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 臨床血清樣本的定性

背景清楚的臨床豬血清樣品180份，均來源于PR非免疫場。用病毒中和試驗對其進行檢測，最終得到90份PR抗體陽性血清和90份PR抗體陰性血清將其用于試劑盒各項指標的測定。具體操作見文獻[4]。

1.5 ELISA檢測及結果判定

嚴格按試劑盒說明書對血清樣品進行檢測，在指定波長下測定樣品的OD值。按公式進行換算，并判定結果（表1）。

表1 各試劑盒檢測方法及判定條件

1.6 敏感性、特異性、與中和試驗的符合度測定

對3種試劑盒各取1個批次，對180份臨床血清樣品同時進行檢測，結果填入表2。按公式敏感性Se=a/（a+c），特異性Sp=d/（b+d）[4-5]，計算各試劑盒的Se和Sp。按照公式Kappa12=2（adbc）/（p1q2+p2q1），計算試劑盒與金標方法結果間的Kappa值，比較試劑盒與金標的符合程度。Kappa值在0.81～1，說明兩個方法間完全符合；在0.61～0.8，為高度符合；在0.41～0.6，為中度符合；在0.21～0.4，為比較符合；0.2以下為輕度符合；0以下為不符合[6-7]。

表2 敏感性、特異性計算數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1.7 重復性試驗

選取經中和試驗判定的PR抗體陽性血清和陰性血清各20份，進行重復性試驗。在以下兩個試驗結束后，對每份樣品的3個結果（OD值）計算變異系數(shù)（CV=平均值/標準差），再計算所有樣品的平均變異系數(shù)；以批內重復平均變異系數(shù)和批間重復平均變異系數(shù)的大小，來衡量3種試劑盒的批內、批間穩(wěn)定性。

1.7.1 批內重復性測定。每種試劑盒隨機抽取1個批次，用不同盒的3塊板，對以上血清同時進行檢測。

1.7.2 批間重復性測定。每種試劑盒隨機抽取3個批次，每批各抽1塊板，對以上血清同時進行檢測。

2 結果與分析

2.1 敏感性、特異性、與中和試驗結果的符合度測定結果

各試劑盒敏感性較高，均在95%以上，其中試劑盒C敏感性最高，達到97.78%；各試劑盒特異性均在94%以上，其中試劑盒B的特異性達到100%。各試劑盒檢測結果與中和試驗結果間的Kappa值均大于0.9。這說明3個品牌試劑盒的測定結果與中和試驗結果均完全符合。符合程度由高到低依次為試劑盒B、C、A。

表3 各試劑盒診斷特性統(tǒng)計結果

2.2 重復性測定結果

試劑盒A、B、C的批內平均變異系數(shù)均小于10%，由此說明3種試劑盒的批內重復性均良好；試劑盒C變異系數(shù)最小說明其批內板間穩(wěn)定性最好；試劑盒C的批間平均變異系數(shù)小于10%，說明其批間重復性良好；試劑盒B的批間平均變異系數(shù)為11.02%，說明其批間重復性一般；試劑盒A批間平均變異系數(shù)大于20%，說明其批間重復性較差。綜合批內、批間重復試驗結果，試劑盒穩(wěn)定性由高到低依次為C、B、A。

表4 各試劑盒批內、批間變異系數(shù)的比較

3 討論

目前對PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒的比較與評價的研究并不多。陳偉杰等[8]通過分析3種商用試劑盒對同一批臨床血清樣品的檢測結果，計算兩兩試劑盒結果間的相關性、符合率和Kappa值，發(fā)現(xiàn)3種試劑盒具有極顯著的相關性以及極強或高度的一致性；通過比較各試劑盒的陽性率高低，直接得出三者敏感性的高低順序。該研究在計算敏感性時，沒有考慮到試劑盒檢測出的陽性結果并不一定全是真陽性。而本研究在評價試劑盒的敏感性、特異性時，應用了“金標準”方法——病毒中和試驗，來標定血清樣品的陰、陽性，以此為標準來衡量待檢驗試劑盒的特性。這樣更加科學。楊濤等[9]應用Kappa檢驗來比較兩種PRV gE抗體ELISA檢測試劑盒，得出二者結果高度一致，均可應用于臨床檢測。該文獻只側重于評價兩兩試劑盒間的一致性，而對診斷試驗的特性——敏感性、特異性以及試驗結果的穩(wěn)定性（重復性）和準確性未作評價。本研究應用來自PR非免疫場的180份臨床豬血清樣品，先用病毒中和試驗對血清進行定性，然后以此結果作為標準，對3種商品化試劑盒的敏感性、特異性和準確度進行了評價；同時隨機抽取同批中不同反應板以及不同批次的反應板，來評價3種試劑盒的批內、批間重復性，創(chuàng)新地對3種試劑盒的各項特性進行了全面測定與比較。

國際推薦的檢測PR抗體的方法有病毒中和試驗（VN）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。其中，前者一直被認為是檢測PR抗體的“金標準”，后來因其操作復雜、耗時長，在大量檢測中往往被ELISA試驗所取代[10]。因目前國內使用的PR疫苗均為gE基因缺失苗，故非免疫場中，抗體陽性血清必為感染抗體陽性，即gE抗體陽性。

本研究結果表明，3種試劑盒檢測結果與中和試驗結果的符合度極高。因此，這3種試劑盒可以保證結果的準確性，均適用于臨床PRV gE抗體檢測。從穩(wěn)定性來講，3種試劑盒的批內穩(wěn)定性均較好，批內重復平均變異系數(shù)均在10%以內（C＜B＜A）；但批間穩(wěn)定性差異較大，A、B、C的批間重復平均變異系數(shù)分別為21.31%、11.02%、8.09%?？梢姡粢獙RV野毒抗體進行持續(xù)監(jiān)測，就需試劑盒具備較好的穩(wěn)定性，以保證監(jiān)測數(shù)據(jù)的可靠性和縱向可比性。這時應選擇穩(wěn)定性最佳的試劑盒C。從診斷特性來講，3種試劑盒的敏感性和特異性均較好，但仍有差異。試劑盒A、B、C的敏感性分別為96.67%、95.56%、97.78%；特異性分別為94.44%、100.00%、95.56%。臨床上在選用診斷試劑盒時，在準確性和穩(wěn)定性相當?shù)那闆r下，通常都想追求高敏感性和高特異性，但有時無法兼得。因此，在選用試劑盒時應根據(jù)診斷目的，來對敏感性和特異性進行取舍。如：用于疫病的早期發(fā)現(xiàn)、引種檢疫、證明某地無疫或評價豬場凈化效果時，就要求診斷試驗的敏感性越高越好，即假陰性結果越少越好，不讓任何發(fā)?。ǜ腥荆﹦游锫z，此種情況下建議使用試劑盒C；若用于淘汰貴重病畜、出口貿易時，則要求診斷試驗的特異性越高越好，即假陽性結果越少越好，不錯殺1例或錯判1份樣品，此時最好使用試劑盒B。臨床實踐中，應綜合分析試劑盒的各項性能指標，并根據(jù)工作需求合理選擇最合適的診斷試劑。

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[10] MOENNING V，WOLDESENBERT P，F(xiàn)EY H R，et al. Comparative Evaluation of ELISA and neutralization test for the diagnosis of Aujeszky's disease[M]. Netherlands：Springer，1982.

（責任編輯：朱迪國）

Comparison on Three ELISA Test Kits for gE Antibodies of Pseudorabies Virus

Dong Yaqin1，Liu Shuang1，Zheng Hui2，Zhang Zhi1，Wu Faxing1，Li Xiaocheng1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Yebio Biological Engineering Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong 266114）

To compare the clinical using effects from three brands of commercial ELISA test kits for Pseudorabies virus（PRV）gE antibodies，180 sera samples were collected from swine farms without PRV vaccination. The sera was determined by virus neutralization test（VN）and was tested by the three ELISA kits at the same time. The characteristics of the three kits were determined and analyzed，including the repeatability，diagnostic sensitivity，specificity and coincidence with VN. The results were as follows：all the three kits had good stability in the inter-assay test with coefficient of variation（CV）below 10%，whereas they were quite different in the intra-assay test with CV，which ranged from 6.90% to 28.87%. And all of the three kits performed well in their sensitivity（from 95.56% to 97.78%）and specificity（from 94.44% to 100%）. Besides，test results of the three kits were completely consistent with those of VN，with the Kappa value from 0.91 to 0.96. The results of the study indicated that all the three brands of ELISA kits were applicable for detection of PRV gE antibodies. Kit C was suitable for continuous surveillance，early detection，introduction quarantine and evaluation on eradication effect because of its best stability and sensitivity；while kit B could be used to diagnose culling expensive animals based on its best specificity and accuracy. Therefore，the optimum reagent kit should be chosen reasonably according to the purpose of diagnosis in production practice.

Pseudorabies virus；gE antibody；ELISA test kits；comparison

S852.659.1

B

1005-944X（2017）11-0079-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.021

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1200500）；科技部科技基礎性工作專項（2012FY111000）

李曉成