安朝旺，劉瑤，趙曉云，韓穎，趙雅寧，趙旭，李建民，薛承景

（華北理工大學(xué) 1. 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科； 2. 護(hù)理與康復(fù)學(xué)院臨床教研室，河北 唐山 063000）

ERK1/2和PI3-K通路抑制劑對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬的協(xié)同作用

安朝旺1，劉瑤2，趙曉云2，韓穎2，趙雅寧2，趙旭1，李建民1，薛承景1

（華北理工大學(xué) 1. 附屬醫(yī)院神經(jīng)外科； 2. 護(hù)理與康復(fù)學(xué)院臨床教研室，河北 唐山 063000）

目的通過(guò)觀察聯(lián)合抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3-K）蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響，探討蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）救治靶點(diǎn)。方法將200只雄性SD大鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、模型（SAH）組、ERK1/2抑制劑U0126組、PI3-K抑制劑LY294002組、U0126+LY294002組。二次注血法制作SAH大鼠模型；HE染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)ERK1/2、PI3-K、自噬相關(guān)蛋白beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈（LC3） mRNA的表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)海馬區(qū)磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果SAH組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡率、ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA以及磷酸化ERK1/2 、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平均高于Sham組 （均P ＜ 0.05）；U0126組和LY294002組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡率高于SAH組，而ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA以及磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平均低于SAH組 （均P ＜ 0.05）；U0126+ LY294002組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡率高于U0126或 LY294002組，而ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA以及磷酸化ERK1/2 、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平分別低于U0126和 LY294002組 （均P ＜ 0.05）。結(jié)論聯(lián)合抑制ERK1/2和PI3-K通路激活可顯著降低SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬，加重神經(jīng)細(xì)胞丟失。

蛛網(wǎng)膜下腔出血； 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶； 磷脂酰肌醇3激酶； 自噬相關(guān)蛋白； 微管相關(guān)蛋白1輕鏈

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）殘障率約為60%以上［1］，早期腦損傷（early brain injury，EBI）神經(jīng)細(xì)胞丟失是SAH患者不良預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］。自噬是細(xì)胞的一種防御機(jī)制，自噬的程度對(duì)維持應(yīng)激損傷狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡以及細(xì)胞的存活有不可忽視的作用［3］，調(diào)控自噬可改善SAH后 EBI階段的神經(jīng)細(xì)胞死亡程度，對(duì)防治SAH后神經(jīng)功能障礙有重要意義［4］。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）和磷酸酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）是調(diào)控細(xì)胞自噬通路的2個(gè)關(guān)鍵激酶，在多種中樞神經(jīng)疾?。ㄈ缒X缺血、帕金森綜合征、阿爾茨海默病）的病理過(guò)程中起關(guān)鍵作用［5-7］。因此，針對(duì)這2個(gè)激酶與SAH后自噬的關(guān)系以及聯(lián)合靶向干預(yù)的研究可能為SAH的早期救治提供潛在依據(jù)。本研究擬建立SAH模型大鼠，并分別或同時(shí)抑制ERK1/2、PI3-K信號(hào)通路，觀察其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬和神經(jīng)細(xì)胞丟失的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與模型建立

清潔級(jí)雄性SD大鼠200只，體質(zhì)量350～450 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2009-003。按照數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（Sham組）、蛛網(wǎng)膜下腔出血模型組（SAH組）、ERK1/2抑制 劑U0126組、PI3-K抑 制 劑LY294002組以及U0126+LY294002組，每組40只；各組大鼠按時(shí)間點(diǎn)再分為6 h、24 h、48 h、72 h 4個(gè)時(shí)間亞組。

采用自體血二次枕大池注血法［8］制備SAH大鼠模型。Sham組向大鼠枕大池注入2次0.3 mL生理鹽水，余操作均與SAH組一致。U0126組、LY294002組、U0126+LY294002組分別在模型制備前30 min對(duì)每只大鼠側(cè)腦室相應(yīng)給予5 μ g/μ L的 U0126注射，500 nmol/5 μ L的 LY294002注射，或U0126和LY294002聯(lián)合用藥。

建模成功判定標(biāo)準(zhǔn)：行二次枕大池注血時(shí)在穿刺部位見(jiàn)少量血性腦脊液滲出，提示穿刺針位置準(zhǔn)確；肉眼見(jiàn)腦底基底池部位有明顯的血性液體分布。剔除不符合模型判斷標(biāo)準(zhǔn)以及制作過(guò)程中死亡大鼠 ， Sham 組、 SAH 組、 U0126 組、 LY294002 組以及U0126+LY294002組最終納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析動(dòng)物數(shù)量分別為40、33、32、32、32只。

1.2 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.1 腦組織海馬區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：每組各時(shí)間點(diǎn)取4只或5只大鼠，常規(guī)麻醉后處死。用4%多聚甲醛灌注固定，取視交叉平面至大腦橫裂的腦組織進(jìn)行石蠟包埋，冠狀切片（片厚5 μ m）， HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。光鏡下（×400）觀察海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化，每只大鼠取4張海馬區(qū)切片，每張切片選取5個(gè)不重復(fù)的視野，用Motic-6.0圖像采集以及分析系統(tǒng)分析，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下死亡細(xì)胞百分率（死亡細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量的比值）。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3表達(dá)：每組于各時(shí)間點(diǎn)取4只或5只大鼠處死，快速斷頭取腦，冰上分離雙側(cè)海馬組織，稱量0.6 g。加入1 mL RNAiso Plus溶液后勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清移至1.5 mL離心管內(nèi)，加入1/5 RNAiso Plus溶液體積的氯仿，震蕩混勻后室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入0.5～1倍RNAiso Plus溶液體積的異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀，4 ℃離心（7 500 r/min） 5 min，棄上清并保留沉淀，自然干燥，溶解于30 μ L DEPC處理水中，測(cè)量OD260/280值，計(jì)算RNA濃度，-80 ℃保存。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：行基因組DNA的除去反應(yīng)，在PCR管中依次加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μ L、g DNA Eraser 1 μ L、Total RNA1 μ g，混合均勻后42 ℃孵育2 min或室溫孵育5 min；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在逆轉(zhuǎn)錄儀器進(jìn)行，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，最后溫度降至4℃，如有需要，-20 ℃凍存cDNA；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；定量分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本擴(kuò)增的Ct值算得樣本所檢測(cè)目的基因mRNA相對(duì)拷貝數(shù)，每個(gè)檢測(cè)基因與內(nèi)參基因GAPDH作比，將比值作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，（?Ct=目的基因平均Ct值-內(nèi)參基因平均Ct值，??Ct＝實(shí)驗(yàn)組?Ct-對(duì)照組?Ct，相對(duì)表達(dá)量＝2-△△Ct。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)：標(biāo)本采集同HE染色。切片常規(guī)脫蠟至去離子水，滴加復(fù)合消化液，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌3 次（5 min/次），3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15 min，PBS洗滌，滴加兔抗鼠磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ多克隆抗體（1∶200，1∶200，1∶250，1∶250），4 ℃過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫45 min，PBS洗滌，滴加生物素化二抗，37 ℃孵育40 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水透明，封片，鏡下觀察。陽(yáng)性率的定量分析：每只動(dòng)物取5張海馬區(qū)切片，每張切片再選取相同部位的4個(gè)視野，應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分析各組陽(yáng)性細(xì)胞吸光度（absorbance，A）。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequence of PCR primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以x-±s表示，組間比較采用單因素方差分析，2組比較采用SNK- q分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化

Sham組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰；SAH組海馬區(qū)可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞變性、水腫、壞死（核溶解、核碎裂或核消失結(jié)構(gòu)不清）。SAH組神經(jīng)細(xì)胞死亡率較Sham組明顯增高。U0126組和LY294002組神經(jīng)細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，神經(jīng)細(xì)胞死亡率高于SAH組（P ＜ 0.05）。U0126+LY294002組神經(jīng)細(xì)胞死亡率顯著高于U0126組和LY294002組（P ＜ 0.05）。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 各組大鼠72 h海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HE染色 ×400Fig.1 HE staining of neurons in the hippocampus in each group ×400

表2 各組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡率比較 Tab.2 Comparison of neuronal death rates in the hippocampus of rats from each group

表2 各組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡率比較 Tab.2 Comparison of neuronal death rates in the hippocampus of rats from each group

1） P ＜ 0.05 vs Sham group；2） P ＜ 0.05 vs SAH group；3） P ＜ 0.05 vs U0126 group；4） P ＜ 0.05 vs LY294002 group.

Group 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 1.189±0.070 1.200±0.069 1.190±0.070 1.119±0.069 SAH 15.449±2.3361） 25.664±4.5531） 37.652±4.6641） 48.339±5.2881）U0126 28.338±5.6622） 33.448±7.1422） 45.886±8.6202） 51.204±9.8822）LY294002 29.226±6.3392） 33.278±7.1282） 46.339±9.8142） 50.546±8.9982）U0126+LY294002 39.368±5.9973），4） 48.869±9.6843），4） 58.966±10.8203），4） 62.339±12.5593），4）

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

以Sham組ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA表達(dá)量為1，計(jì)算各組ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA值。SAH組ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA水平高于Sham組，其中beclin-1和LC3于24 h達(dá)高峰，72 h迅速下降，但仍高于Sham組（P ＜ 0.05）；U0126組和LY294002組中ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA均低于SAH組（P ＜ 0.05）；U0126+LY294002組ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA分別顯著低于 U0126組和LY294002組（P ＜ 0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組海馬區(qū)ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA表達(dá)水平的比較Tab.3 Comparison of ERK1/2，PI3-K，beclin-1 and LC3 mRNA expression levels in the hippocampus of rats in different groups

表3 各組海馬區(qū)ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3 mRNA表達(dá)水平的比較Tab.3 Comparison of ERK1/2，PI3-K，beclin-1 and LC3 mRNA expression levels in the hippocampus of rats in different groups

1） P ＜ 0.05 vs Sham group；2） P ＜ 0.05 vs SAH group；3） P ＜ 0.05 vs U0126 group；4） P ＜ 0.05 vs LY294002 group.

Group 6 h 24 h 48 h 72 h ERK1/2 Sham 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 SAH 1.848±0.0041） 2.376±0.0061） 2.116±0.0041） 1.336±0.0041）U0126 1.332±0.0022） 1.426±0.0032） 1.319±0.0022） 1.117±0.0022）LY294002 1.584±0.0042） 1.870±0.0062） 1.710±0.0042） 1.138±0.0042）U0126+LY294002 1.184±0.0033），4） 1.172±0.0043），4） 1.100±0.0033），4） 1.102±0.0023），4）PI3-K Sham 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 SAH 1.683±0. 0041） 3.244±0.0081） 2.935±0.0071） 1.778±0.0061）U0126 1.432±0.0032） 2.226±0.0062） 2.312±0.0072） 1.510±0.0022）LY294002 1.382±0.0062） 1.876±0.0082） 1.800±0.0082） 1.324±0.0042）U0126+LY294002 1.254±0.0043），4） 1.468±0.0043），4） 1.422±0.0033），4） 1.148±0.0023），4）becline-1 Sham 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 SAH 1.463±0.0021） 1.760±0.0021） 1.524±0.0021） 1.332±0.002 U0126 1.264±0.0042） 1.562±0.0062） 1.356±0.0042） 1.224±0.0032）LY294002 1.147±0.0022） 1.371±0.0052） 1.196±0.0062） 1.196±0.0042）U0126+LY294002 1.084±0.0023），4） 1.128±0.0023），4） 1.032±0.0033），4） 1.059±0.0023），4）LC3 Sham 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 SAH 1.529±0.0041） 1.892±0.0101） 1.446±0.0121） 1.318±0.004 U0126 1.344±0.0042） 1.633±0.0102） 1.228±0.0092） 1.186±0.0042）LY294002 1.187±0.0062） 1.319±0.0082） 1.158±0.0052） 1.082±0.0042）U0126+LY294002 1.066±0.0023），4） 1.119±0.0023），4） 1.068±0.0033），4） 1.024±0.0013），4）

2.3 各組磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ的陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)細(xì)小的棕黃色顆粒。Sham組可偶見(jiàn)磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞，染色淺黃。SAH 組磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性反應(yīng)增強(qiáng)（P ＜ 0.05）；U0126組和LY294002組中磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性反應(yīng)均低于SAH 組（P ＜0.05）；U0126+LY294002組 磷 酸 化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性反應(yīng)分別顯著低于U0126組和LY294002組（P ＜ 0.05）。見(jiàn)圖2，表4。

3 討論

自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體途徑對(duì)功能受損的白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行識(shí)別、降解和修復(fù)的一種現(xiàn)象，是細(xì)胞除壞死和凋亡外的第3種死亡方式。前期的研究［9］顯示SAH后自噬對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，采用神經(jīng)保護(hù)劑BQ-l23對(duì)SAH大鼠進(jìn)行干預(yù)后，大鼠腦水腫減輕，LC3-Ⅱ表達(dá)水平升高，表明BQ-l23對(duì)SAH的腦保護(hù)作用是通過(guò)促進(jìn)自噬來(lái)完成的。至今，自噬被證實(shí)廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理進(jìn)程中，且研究［5-7］認(rèn)為自噬主要對(duì)腦應(yīng)激損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖2 各組大鼠24 h海馬區(qū)磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 ×400Fig.2 Immunohistochemical staining of phosphorylated ERK1/2，PI3-K，beclin-1，and LC3-Ⅱ in the hippocampus in each group ×400

表4 各組大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平的比較 Tab.4 Comparison of phosphorylated ERK1/2，PI3-K，beclin-1，and LC3-Ⅱexpression levels in the hippocampus of rats in different groups

表4 各組大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK1/2、PI3-K、beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平的比較 Tab.4 Comparison of phosphorylated ERK1/2，PI3-K，beclin-1，and LC3-Ⅱexpression levels in the hippocampus of rats in different groups

1） P ＜ 0.05 vs Sham group；2） P ＜ 0.05 vs SAH group；3） P ＜ 0.05 vs U0126 group；4） P ＜ 0.05 vs LY294002 group.

Group 6 h 24 h 48 h 72 h Phosphorylated ERK1/2 Sham 2.482±0.470 2.520±0.552 2.483±0.528 2.486±0.524 SAH 9.484±2.5661） 16.680±4.5661） 14.608±2.2901） 11.342±2.5261）U0126 6.330±2.1122） 8.526±2.2302） 7.440±2.1182） 5.556±1.9962）LY294002 7.196±2.6602） 10.482±3.8922） 10.855±2.6642） 8.384±2.4202）U0126+LY294002 4.101±1.4243），4） 5.960±1.8863），4） 5.044±1.3603），4） 3.286±1.3383），4）Phosphorylated PI3-K Sham 1.982±0.574 1.990±0.580 1.986±0.588 1.990±0.574 SAH 7.228±2.6201） 11.550±2.9831） 17.028±3.4421） 13.183±3.1261）U0126 5.426±2.3382） 7.942±2.5562） 13.544±3.3382） 9.880±2.9962）LY294002 4.980±1.8482） 6.672±2.1122） 9.224±2.7702） 7.448±1.9922）U0126+LY294002 3.486±2.5593），4） 3.980±2.8863），4） 6.902±3.3383），4） 4.9296±3.0543），4）Phosphorylated beclin-1 Sham 1.662±0.660 1.680±0.654 1.587±0.598 1.710±0.672 SAH 9.416±2.5881） 14.982±3.7281） 18.220±4.4461） 12.282±3.0891）U0126 9.110±2.4402） 14.489±3.5642） 17.996±4.4482） 11.890±2.9982）LY294002 8.996±2.6602） 14.308±3.4402） 18.108±4.5502） 12.009±3.0012）U0126+LY294002 5.084±2.1523），4） 7.446±2.2243），4） 10.366±2.9603），4） 6.820±2.7403），4）Phosphorylated LC3-ⅡSham 2.334±0.720 2.440±0.696 2.338±0.630 2.440±0.650 SAH 7.820±2.3301） 15.390±4.2281） 12.252±3.9921） 8.660±2.4081）U0126 5.212±1.2302） 12.004±3.1242） 9.664±2.4482） 5.090±2.1102）LY294002 4.540±1.8822） 10.896±2.5562） 7.128±2.3212） 4.728±1.4522）U0126+LY294002 3.080±1.1083），4） 6.120±1.5483），4） 2.005±1.1563），4） 3.008±1.0683），4）

研究［10］證實(shí)ERK1/2參與細(xì)胞自噬的形成，用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑VK3誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬，ERK1/2激活，U0126可阻斷該過(guò)程中LC3-Ⅱ的表達(dá)；在小鼠SAH模型中發(fā)現(xiàn)代謝型谷氨酸受體1選擇性拮抗劑可降低海馬區(qū)beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平，且在該變化過(guò)程中伴隨ERK1/2活性的改變［11］，提示ERK1/2通路可能是調(diào)控細(xì)胞自噬的靶點(diǎn)。PI3-K信號(hào)是維持細(xì)胞存活的經(jīng)典通路。李曉暉等［12］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PI3-K抑制劑LY294002干預(yù)SAH小鼠，可造成p53表達(dá)顯著增加、海馬區(qū)神經(jīng)元嚴(yán)重丟失。PI3-K激活后，可催化肌醇環(huán)上的3位羥基生成3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇，使Akt發(fā)生磷酸化，進(jìn)而減少其下游雷帕霉素靶蛋白的表達(dá)，調(diào)控真核細(xì)胞的自噬，促進(jìn)細(xì)胞存活［13］。本研究中，U0126組和LY294002組中beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白和mRNA表達(dá)水平（二者是自噬標(biāo)記蛋白，反映細(xì)胞自噬發(fā)生和程度）均較SAH組顯著下降，提示ERK1/2和PI3-K信號(hào)激活共同參與SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬的調(diào)控。結(jié)合本研究中神經(jīng)細(xì)胞死亡率的變化，筆者認(rèn)為SAH后ERK1/2和PI3-K通路激活可促進(jìn)自噬，從而拮抗神經(jīng)細(xì)胞的丟失。本研究亦發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用ERK1/2和PI3-K通路抑制劑后神經(jīng)細(xì)胞死亡率進(jìn)一步增加，且beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白和mRNA表達(dá)水平持續(xù)降低，提示SAH后二者可相互促進(jìn)，協(xié)同發(fā)揮對(duì)早期腦損傷的保護(hù)作用。研究［14-15］顯示，ERK1/2和PI3-K通路不僅存在共同的活化因子（如Ras、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等），亦存在某些共同的底物（如GSK3β、反應(yīng)元件結(jié)合蛋白等），可能是SAH后二者相互影響的原因。 SAH后PI3-K和ERK1/2途徑之間的關(guān)系以及二者調(diào)控自噬的機(jī)制仍需深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2和PI3-K通路激活共同參與SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)，聯(lián)合抑制ERK1/2和PI3-K通路激活可顯著降低SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬，加重神經(jīng)細(xì)胞丟失，提示SAH早期救治時(shí)應(yīng)注意ERK1/2和PI3-K的協(xié)同效應(yīng)，同時(shí)對(duì)二者進(jìn)行調(diào)控可能會(huì)取得更好的效果。

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（編輯 王又冬）

Synergistic Effects of ERK1/2 and PI3-K Pathway Inhibitors on Autophagy in the Hippocampus of Rats with Subarachnoid Hemorrhage

AN Chaowang1，LIU Yao2，ZHAO Xiaoyun2，HAN Ying2，ZHAO Yaning2，ZHAO Xu1，LI Jianmin1，XUE Chengjing1

（1. Neurosurgery Department，Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China；2. Clinical Department，College of Nursing and Rehabilitation，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China）

ObjectiveTo investigate synergistic effects of extracellular signal regulated kinase （ERK1/2） and phosphatidylinositol 3 kinase （PI3-K） pathway inhibitors on autophagy in the hippocampus of rats with subarachnoid hemorrhage （SAH），for identification of therapeutic targets in SAH.MethodsTotally，200 male SD rats were randomly divided into a sham operated group，SAH group，inhibitor U0126 group，inhibitor LY294002 group，and a U0126+ LY294002 group. Animal models were established by injecting autologous blood twice into the cisterna magna. Morphological changes in the hippocampus nerve cells were detected by HE staining；ERK1/2，PI3-K，beclin-1，and LC3 mRNA expression in the hippocampus were detected by real-time PCR，and phosphorylated ERK1/2，PI3-K，beclin-1，and LC3-Ⅱ protein expression were detected by immunohistochemistry.ResultsNeuronal death rate and phosphorylated ERK1/2，PI3-K，beclin-1，and LC3-Ⅱlevels in the hippocampus in the SAH group were higher than in the sham group （all P ＜ 0.05）. Neuronal death rate in U0126 or LY294002 group was higher than in SAH group，while ERK1/2，PI3-K，beclin-1，and LC3 mRNA and phosphorylated ERK1/2，PI3-K，beclin-1，and LC3-Ⅱprotein levels were lower than in SAH group （all P ＜ 0.05）. Neuronal death rate in U0126 +LY294002 group was higher than in U0126 or LY294002 group，while ERK1/2，PI3-K，beclin-1，LC3 mRNA and phosphorylated ERK1/2，PI3-K，beclin-1，and LC3-Ⅱprotein levels in the hippocampus were lower than in U0126 or LY294002 group （all P ＜ 0.05）.ConclusionCo-targeting the inhibition of ERK1/2 and PI3-K pathways can significantly reduce neuronal cell autophagy and aggravate cells loss after SAH.

subarachnoid hemorrhage；extracellular signal regulated kinase；phosphatidylinositol 3 kinase；autophagy

R651.1

A

0258-4646（2017）11-0995-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.008

河北省省級(jí)重大醫(yī)學(xué)科研課題（zd2013087）；唐山市科技計(jì)劃（14130220B）

安朝旺（1980-），男，主治醫(yī)師，碩士.

李建民，E-mail：18531776202@163.com

2016-11-22