冉瑞法,劉淑娟,肖圣燕,馮 蔚,李鎮(zhèn)剛

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所,云南 蒙自 661101)

大腸桿菌植酸酶appA基因的克隆、表達及性質(zhì)分析

冉瑞法,劉淑娟,肖圣燕,馮 蔚,李鎮(zhèn)剛*

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所,云南 蒙自 661101)

通過維生素C-鉬藍法，從飼喂青飼料的豬的糞便中分離篩選出1株產(chǎn)較高活性appA植酸酶的大腸桿菌菌株；采用PCR方法從該菌株的基因組中克隆獲得植酸酶appA基因,測序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物全長1447 bp,該植酸酶基因編碼區(qū)有1296個核苷酸,編碼432個氨基酸。將該編碼區(qū)克隆至pPIC9K載體，并轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導(dǎo)表達,獲得了約55 kDa的特征條帶,表達96 h后其上清液的酶活力達到368 U/mL。經(jīng)Ni親和柱純化后進行部分酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果表明：重組appA植酸酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃,溫度高于60 ℃后其酶活下降明顯；其最適pH值為5.0。

植酸酶;appA基因;大腸桿菌;克隆;表達；畢赤酵母

生態(tài)環(huán)境的良性循環(huán)是社會、經(jīng)濟實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展必備的基礎(chǔ)條件,而環(huán)境的保護則是生態(tài)環(huán)境建設(shè)的重要任務(wù)。從磷對環(huán)境的污染而言,養(yǎng)殖業(yè)對于環(huán)境的磷污染主要是因為植物性飼料中的磷有2/3為植酸磷[1],單胃畜禽動物根本無法完全利用這些磷[2]，且植酸能夠與礦物質(zhì)營養(yǎng)元素和蛋白質(zhì)等螯合,因而不能被完全吸收利用[3]，從而導(dǎo)致植物性飼料的營養(yǎng)價值下降。據(jù)報道，在玉米和小麥中,植酸及其螯合物中的磷僅有10%可被家禽消化利用,剩下的磷經(jīng)動物消化道排出，會對環(huán)境造成磷污染[4]；同時在單胃動物飼料中還需要添加無機磷如磷酸氫鈣等，這會增加飼料的成本。植酸酶是催化植酸及其鹽水解成肌醇和磷酸的一類酶的總稱[5]。目前對植酸酶的研究多集中于真菌和細菌上。馬恒甲等[6]通過在草魚飼料中添加植酸酶證明了其對植物性飼料的消化具有正向效應(yīng);梁欣等[7]的研究表明植酸酶在家禽飼料中的添加對植酸磷的消化利用具有不可替代的作用;劉晉生[8]證明了在豬飼糧配制中添加轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米可提高飼糧消化能值和非植酸磷含量,從而減少無機磷源的添加量。

一方面磷在動物飼料中是僅次于能量和蛋白質(zhì)的第三位營養(yǎng)素,另一方面世界上大部分的農(nóng)田土壤缺磷,我國土壤約2/3嚴重缺磷。國家農(nóng)業(yè)部在2008年6月10日印發(fā)了《飼用植酸酶使用指南》,要求在飼料生產(chǎn)加工企業(yè)和規(guī)?；酿B(yǎng)殖場推廣使用植酸酶,以減少外源磷的添加量,降低飼料成本，減輕單胃畜禽排放磷對環(huán)境的污染。因而對植酸酶的研究顯得日益重要,提高植酸酶的活性、尋找新的高酶活性植酸酶具有重要的經(jīng)濟、生態(tài)以及社會意義。來源于大腸桿菌的酸性植酸酶(appA)在現(xiàn)今已有報道中比活性最高[9-10]。本研究利用維生素C-鉬藍法從飼喂青飼料的豬的糞便中篩選獲得了具有較高appA植酸酶活性的大腸桿菌菌株，從其基因組中克隆獲得了appA基因,并利用巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)對其表達及酶學(xué)性質(zhì)進行了初步分析,旨在為植酸酶的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

于農(nóng)戶家豬圈采集主要飼喂青飼料的豬的新鮮糞便，裝入離心管中，及時帶回實驗室備用。T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(XbaⅠ、EcoRⅠ、SacI)、克隆菌株DH5α感受態(tài)細胞、pMD19-T載體、低分子量蛋白質(zhì)Marker、Plasmid Mini Kit I試劑盒、Gel Extraction Kit試劑盒購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司; PfuDNA聚合酶、植酸鈉、EDTA、乙酸鈉、甲醇、鉬酸銨、甘氨酸、生物素、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、Tryptone powder、YNB、Tris、NaCl、CaCl2、Yeast extract、三氯乙酸(TCA)、SDS等均為分析純,購自上海生工生物工程有限公司;質(zhì)粒pPIC9K和巴斯德畢赤酵母GS115(His+)由實驗室保存。

1.2 主要生化試劑及培養(yǎng)基的配制

LB培養(yǎng)基:1%胰蛋白胨、0.5%酵母膏、1%NaCl。溶液I:50 mmol/L葡萄糖、25 mmo1/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA, pH 8.0。磷標準儲備液(5 mmol/L):精確稱取0.68 g在105 ℃下干燥過的KH2PO4,溶于1000 mL雙重蒸餾水中。三氯乙酸TCA (15%):在裝有500 g TCA的瓶中加入227 mL水,形成的溶液為100%TCA (w/v)；將15 mL 100%TCA加入裝有85 mL水的容量瓶中。醋酸緩沖液(0.25 mol/L):稱取14.355 g無水乙酸鈉,加入1.0 g吐溫-20和30 g EDTA,用900 mL水溶解,用冰乙酸調(diào)pH值至5.50±0.01,用水定容至1000 mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。AMES顯色液: A液為10%維生素C溶液;B液為0.42%鉬酸銨溶解于1 mol/L硫酸的溶液;顯色液為A液與B液以體積比1∶6配制的混合液,現(xiàn)用現(xiàn)配。反應(yīng)液:精確稱取132 mg植酸鈉，將其溶解于100 mL醋酸緩沖液中。MD培養(yǎng)基:1.34%YNB、2%葡萄糖、4×10-5生物素、1.5%瓊脂粉。BMGY培養(yǎng)基:2%蛋白胨、1%酵母提取物、1.34%YNB、1%甘油、4×10-5生物素。BMMY培養(yǎng)基:2%蛋白胨、1%酵母提取物、1.34%YNB、0.5%甲醇、4×10-5生物素。

1.3 具有植酸酶活性的大腸桿菌的篩選

1.3.1 磷標準曲線的制作 分別精確量取2、3、4、5和6 mL磷標準儲備液，放入100 mL容量瓶中,制成磷濃度為0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 mmol/L的磷標準稀釋梯度溶液。取6個滅菌的5 mL離心管，分別加入磷標準稀釋梯度溶液1 mL和AMES顯色液1 mL(如表1所示),在50 ℃水浴20 min后冷卻至室溫，測定在820 nm處的吸光度值(OD值)。以磷濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制OD-磷濃度標準曲線。

表1 OD-磷濃度標準曲線制作的設(shè)計

1.3.2 大腸桿菌發(fā)酵液植酸酶活性的測定 取適量新鮮豬糞便，加入無菌雙蒸水后搖勻,將其稀釋適當(dāng)倍數(shù)后取50 μL涂布于多個LB固體培養(yǎng)基平板,37 ℃過夜倒置培養(yǎng)；挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基并分別編號,在37 ℃下以220 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)；離心收集菌體后加500 μL溶液Ⅰ懸浮并加入少量溶菌酶,在37 ℃下保溫10 min后于冰上超聲波破碎,適當(dāng)稀釋后檢測植酸酶的活性,保留相對酶活最高的菌株備用。

取上述稀釋后的處理液100 μL，加入反應(yīng)液900 μL(對照組為1 mL醋酸緩沖液),30 ℃水浴反應(yīng)30 min后加入1 mL 15%TCA終止液,以12000 r/min離心1 min；取上清100 μL,加入900 μL醋酸緩沖液、1 mL AMES顯色液,50 ℃水浴20 min,冷卻至室溫后測定820 nm處的吸光度。酶活性計算公式為U=(OD-OD0)×N/(K×T),式中U為酶活性(μmol/min);OD為測定樣品的吸光度;OD0為對照樣品的吸光度;N為稀釋倍數(shù);K為標準曲線的斜率;T為反應(yīng)時間(min)。將在37 ℃、pH 5.50條件下,每分鐘從濃度為5.0 mmol/L植酸鈉溶液中釋放出l μmol無機磷所需要的植酸酶量定義為一個酶活單位。

1.4 植酸酶appA基因的克隆

根據(jù)GenBank上已公布的L03371[11]、AY496073[12]等序列的開放閱讀框來進行引物的設(shè)計,上游添加XbaⅠ，下游添加EcoRⅠ酶切位點用于表達載體的構(gòu)建。appA-F引物序列:5′-CCGTCTAGAATGAAAGCGATCTTAATCCCA-3′。appA-R引物序列:5′-GCGAATTCTTAgtgatggtgatggtgatgCAAACTGCACGCCGGTATGCG-3′。其中單下劃線堿基為酶切位點,小寫字母堿基為組氨酸(His)標簽。

用高保真Pfu DNA聚合酶以相對植酸酶活性最高的大腸桿菌的基因組DNA為模板進行擴增,按照說明書添加相應(yīng)的引物、模板等反應(yīng)體系組分,反應(yīng)參數(shù)如下:94 ℃ 4 min,94 ℃ 30 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 1.5 min,循環(huán)32次；72 ℃ 10 min,13 ℃保存。電泳鑒定后回收擴增產(chǎn)物并克隆到pMD19-T載體,送到南京金思特科技有限公司測序,并對測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析。

1.5 植酸酶appA基因在畢赤酵母中的表達

利用Plasmid Mini Kit I試劑盒，參照說明書分別提取測序正確的pMD19-appA質(zhì)粒和pPIC9K質(zhì)粒,然后用XbaⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶分別對這兩個質(zhì)粒進行雙酶切反應(yīng),利用Gel Extraction Kit試劑盒回收相應(yīng)的目的片段并進行連接，構(gòu)建pPIC9K-appA表達載體,將構(gòu)建好的載體送到南京金思特科技有限公司進行測序驗證。利用試劑盒大量提取pPIC9K-appA表達載體,用SacI限制性內(nèi)切酶對表達載體進行線性化；然后參照文獻[13]制備畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，電擊轉(zhuǎn)化線性化后的表達載體,進行His+陽性轉(zhuǎn)化子的篩選,利用G418進行高拷貝appA酵母菌株的篩選；最后參照文獻對篩選出的菌株進行甲醇誘導(dǎo)，使其大量表達植酸酶,利用組氨酸標簽進行目的蛋白的純化。

1.6 表達產(chǎn)物部分酶學(xué)性質(zhì)的分析

將純化的重組appA植酸酶首先在37 ℃、不同pH下進行酶促反應(yīng),底物1 mmol/L植酸鈉用不同pH緩沖液配制。其中pH 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0為甘氨酸-鹽酸緩沖液體系; pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5為醋酸-醋酸鈉緩沖液體系; pH 6.0、6.5為咪唑-鹽酸緩沖液體系; pH 7.0、7.5、8.0為Tris-鹽酸緩沖液體系。最適反應(yīng)溫度實驗：在pH 5.0下,分別在25、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90 ℃下進行酶促反應(yīng)。將在某條件下酶活占最高酶活(100%)的百分數(shù)定義為該酶在此條件下的相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 高活性植酸酶appA大腸桿菌菌株的篩選

將采集的飼喂青飼料的豬的新鮮糞便進行稀釋涂板后過夜培養(yǎng),共挑取了59個單菌落進行過夜培養(yǎng),對擴大培養(yǎng)的菌體進行處理后采用維生素C-鉬藍法測定植酸酶的相對比活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同菌落之間的相對酶活性相差較大,其中編號18的菌株的相對酶活性最高，達271.31 μmol/min(見表2)。因此保留植酸酶相對活性最高的菌株18，作進一步研究。

表2 從豬糞便中篩選的菌株及其植酸酶活性測定結(jié)果

2.2 植酸酶appA基因的克隆

以相對植酸酶活性最高的菌株18的基因組DNA為模板進行PCR擴增,電泳檢測到大約1400 bp的特異性擴增條帶(如圖1所示)。將其克隆至pMD19-T載體，然后進行XbaI和EcoRI雙酶切鑒定，最后進行測序,測序結(jié)果如圖2所示,其中進行序列分析時除去了兩邊測序載體的序列。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果

將測序結(jié)果在NCBI上進行Blast分析,結(jié)果表明,該序列與Dassa J等[11]公布的appA基因序列(GeneBank:L03371)同源性較高,僅有3個核苷酸發(fā)生突變,分別在起始密碼子后面的第67位、114位和215位,由公布序列的谷氨酰胺(Gln)轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?Arg),天冬氨酸(Asn)轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸(His),第215位公布的序列為未知堿基(如圖2)。該擴增產(chǎn)物包含完整的開放閱讀框,appA基因全長1296 bp,編碼432個氨基酸；在線預(yù)測(http://www.expasy.org/tools/)該蛋白質(zhì)的分子量為47.10 kDa,等電點pI為6.93。該序列具備組氨酸酸性磷酸酶的活性中心RHGxRxP(x代表任意氨基酸)保守序列和催化中心HD保守序列[14],說明可以將該appA植酸酶歸為組氨酸酸性磷酸酶這一家族；另外在氨基酸第161～163位點、226～228位點和339～340位點分別存在3個潛在的糖基化位點。

波浪線下劃線部分為限制性酶切位點;雙下劃線部分為保守序列;單下劃線部分為催化中心保守序列;虛下劃線部分為組氨酸標簽。

2.3 植酸酶appA基因的酵母表達

目前有不少的研究報道已經(jīng)表明appA基因通過原核表達系統(tǒng)能夠進行誘導(dǎo)表達且能檢測到植酸酶活性,由于該基因是在大腸桿菌中克隆獲得的,因此大腸桿菌表達系統(tǒng)對該基因的翻譯表達修飾等更具有優(yōu)勢,但是要將該基因轉(zhuǎn)化入真核生物以降低植酸及其螯合物對動物飼料及環(huán)境污染的影響,就需要對該基因在真核表達系統(tǒng)中的表達進行研究。因此本研究將該基因克隆至真核表達載體pPIC9K中進行巴斯德畢赤酵母的誘導(dǎo)表達,通過在外源蛋白的N-末端融合6個組氨酸串聯(lián)的His-tag,有利于對表達的目的蛋白進行純化進而檢測其酶活性及部分酶學(xué)性質(zhì)分析。

經(jīng)過MD平板篩選后獲得表型為His+和Mut+的轉(zhuǎn)化子；經(jīng)3次繼代培養(yǎng)后進行PCR陽性鑒定和G418平板篩選,獲得1株具有高拷貝數(shù)的植酸酶appA基因工程菌菌株；經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達,分別收集0、24、48、72、96 h時間點的表達上清液,進行SDS-PAGE凝膠電泳分析,如圖3a所示,誘導(dǎo)24 h時菌株表達量開始增加,隨著誘導(dǎo)時間的增加其表達的蛋白量也增加,在分子量約55 kDa處表現(xiàn)出特征性條帶；然后利用組氨酸His-tag對誘導(dǎo)表達的蛋白進行了純化,如圖3b所示,表現(xiàn)為單一的條帶,說明純化的蛋白比較單一,可以用于后續(xù)部分酶學(xué)性質(zhì)的分析研究。

a:甲醇誘導(dǎo)的表達蛋白;1:對照畢赤酵母;2:誘導(dǎo)0 h;3:誘導(dǎo)24 h;4:誘導(dǎo)48 h;5:誘導(dǎo)72 h;6:誘導(dǎo)96 h;M:低分子量蛋白質(zhì)Marker。b:純化的誘導(dǎo)表達蛋白;M:低分子量蛋白質(zhì)Marker;1、2、3:純化的目的蛋白。

圖3重組酵母工程菌表達蛋白及純化蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果

2.4 表達蛋白的部分酶學(xué)性質(zhì)分析

在37 ℃條件下測定了經(jīng)Ni親和柱純化的appA植酸酶在不同pH值條件下的相對酶活性,結(jié)果顯示該純化的重組appA植酸酶最適pH為5.0,并且在pH 2.5時有1個次高峰。這與陳寅等[15]報道的結(jié)果相似。當(dāng)pH值超過6.0時,其相對酶活性迅速下降,如圖4。在pH 5.0條件下分別測定了25～80 ℃下酶促反應(yīng)的相對酶活力,結(jié)果顯示重組appA植酸酶相對酶活性在25～55 ℃之間隨溫度的上升而增強,至55 ℃時達最大；此后隨溫度的繼續(xù)上升而逐漸降低,當(dāng)溫度達到80 ℃后酶活基本喪失,如圖5。

圖4 重組appA植酸酶的最適pH值

3 討論和結(jié)論

磷是動物、植物及人類生長發(fā)育必需的元素之一,并且在生物體代謝過程中起著重要的作用。一方面磷缺乏日趨嚴重,另一方面植物性飼料中的磷有2/3為植酸磷,單胃動物無法對其消化吸收而造成磷污染,同時植酸及其螯合物還會影響動物體對營養(yǎng)元素及蛋白質(zhì)等的吸收利用,從而增加養(yǎng)殖業(yè)的成本,因此植酸酶的出現(xiàn)就很好地解決了此類問題。植酸酶的研究已有100多年的歷史,目前來源于大腸桿菌的appA植酸酶分解植酸及其螯合物的能力最強[16]。本研究在飼喂青飼料為主的豬的糞便中進行大腸桿菌的培養(yǎng),采用維生素C-鉬藍法測定植酸酶活性,選擇相對活性最高的菌株,提取基因組并從中克隆獲得植酸酶appA基因,與已報道的appA基因同源性較高,僅有3個堿基位點發(fā)生了突變,具有組氨酸酸性磷酸酶家族活性中心位點RHGxRxP(x代表任意氨基酸)保守序列和催化中心HD保守序列；然后將其克隆至pPIC9K表達載體,并電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達獲得55 kDa左右的蛋白；預(yù)測該植酸酶appA存在3個潛在的N-端氨基酸糖基化位點,而N-端糖基化修飾會導(dǎo)致蛋白質(zhì)大于其預(yù)測分子量[17]。對于載體的線性化，采用BglⅡ[18]、AvrⅡ[19]和DraⅠ[20]等限制性內(nèi)切酶處理會影響表達單元整合的方式及拷貝數(shù)，進而影響獲得基因高效表達菌株[21],而采用SacI線性化的研究較少,但利用此酶亦能獲得高表達的重組子。

圖5 重組appA植酸酶的最適反應(yīng)溫度

植酸酶活性測定的方法較多但沒有統(tǒng)一的標準,其中釩-鉬酸銨法的靈敏度最高，而維生素C-鉬藍法次之。在進行無機磷含量測定時，如果靈敏度要求過高，則必須滿足試劑純度高、水的純度高和玻璃儀器的清潔程度高的要求,還要對樣品進行高度稀釋,這就會增加測定過程的繁瑣度，因而精度相對會降低[22]。有研究表明三氯乙酸(TCA)在37 ℃下可部分水解植酸鈉[22],但是本研究是在酶促反應(yīng)達到一定時間后才采用TCA使酶失活,并且在終止酶促反應(yīng)后立即進行顯色，這樣可以防止TCA對底物的作用,因此檢測的酶活力結(jié)果更準確。

大腸桿菌表達系統(tǒng)較成熟完善,其優(yōu)點為繁殖速度快、培養(yǎng)條件簡單、操作過程方便、遺傳比較穩(wěn)定,因此大腸桿菌被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物。但是大腸桿菌表達系統(tǒng)缺乏對蛋白質(zhì)的修飾加工且細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素等。而甲醇酵母表達系統(tǒng)能克服大腸桿菌表達系統(tǒng)的不足,可以進行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾和加工,能分泌目的蛋白到培養(yǎng)液中，有利于純化,但受啟動子的嚴格調(diào)控分泌效率較低。Stahl等[23]將appA植酸酶基因在酵母中誘導(dǎo)表達，其植酸酶活力達到了117 U/mL；黃光瑞等[24]構(gòu)建appA重組菌株進行酵母表達，誘導(dǎo)168 h后酶活力達到了422 U/mL；而本研究在表達96 h后其上清液的酶活力能達到368 U/mL。同時利用Ni親和柱進行純化的濃度較低,效率較差,還需要對表達條件及蛋白的純化等環(huán)節(jié)進行進一步的優(yōu)化。

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Cloning,ExpressionandPropertiesofPhytaseappAGeneinEscherichiacoli

RAN Rui-fa, LIU Shu-juan, XIAO Sheng-yan, FENG Wei, LI Zhen-gang*

(Sericulture & Apiculture Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Mengzi 661101, China)

Through adopting vitamin C-molybdenum blue method, we isolated and screened out anEscherichiacolistrain which could produce high-activity appA phytase from the excrement of swine feeding on green fodder. The phytaseappAgene was cloned from the genome of this strain by using PCR method. The sequencing results showed that the overall length of this PCR product was 1447 bp, and in the coding region of this phytase gene there were 1296 nucleotides encoding 432 amino acids. This coding region was cloned into pPIC9K vector, and then the pPIC9K-appA was transformed intoPichiapastoristo induce the expression ofappAgene by methanol. A characteristic band of about 55 kDa was obtained, and the enzyme activity of the supernatant reached 368 U/mL after 96-h expression. The target protein was purified by Ni affinity column, and the analysis of partial enzymatic properties indicated that: the optimum reaction temperature for recombinant appA phytase was 55 ℃, and the enzyme activity decreased obviously when the temperature was higher than 60 ℃; the optimum pH-value for this enzyme was 5.0.

Phytase;appAgene;Escherichiacoli; Cloning; Expression;Pichiapastoris

2017-07-12

國家自然科學(xué)基金項目(31360190)。

冉瑞法(1976─),男,助理研究員,主要從事桑樹資源搜集與遺傳育種研究。*通訊作者:李鎮(zhèn)剛。

Q78

A

1001-8581(2017)11-0001-06

(責(zé)任編輯:黃榮華)