王珊 趙作濤 王譽(yù)涵 涂平 劉玲玲

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科 皮膚病分子診斷北京市重點實驗室（第一作者現(xiàn)在國家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院皮膚科，100045北京）

金黃色葡萄球菌腸毒素B對LAD2肥大細(xì)胞系活化作用的研究

王珊 趙作濤 王譽(yù)涵 涂平 劉玲玲

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科 皮膚病分子診斷北京市重點實驗室（第一作者現(xiàn)在國家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院皮膚科，100045北京）

目的用LAD2肥大細(xì)胞系與金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）共培養(yǎng)，探討SEB對肥大細(xì)胞非IgE機(jī)制的活化作用。方法建立LAD2與不同濃度的SEB（0.01、0.1、1、10、100 μg/ml）以及A23187陽性對照、陰性對照的孵育體系，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，光鏡下觀察SEB對肥大細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)影響并收集各體系上清液，通過酶活性法檢測肥大細(xì)胞分泌的類胰蛋白酶濃度，并通過ELISA法檢測組胺水平。結(jié)果LAD2與SEB共孵育30 min后,光鏡下可見肥大細(xì)胞形態(tài)為細(xì)胞略增大、邊緣模糊、突起增多，折光性下降，呈放射狀毛刺樣。LAD2與不同濃度SEB（0.01、0.1、1、10、100 μg/ml）共孵育30 min后，上清液檢測類胰蛋白酶濃度分別為（4.116±0.651）、（5.344±0.874）、（3.806±0.459）、（1.309 ± 0.247）、（0.310 ± 0.199）ng/ml，SEB濃度在0.01、0.1、1 μg/ml時，釋放類胰蛋白酶濃度明顯高于陰性對照組（P＜0.05），而SEB濃度繼續(xù)增加則類胰蛋白酶濃度水平依次下降。不同SEB濃度下檢測組胺水平分別為（242.409±63.915）、（522.491± 73.466）、（550.926± 84.466）、（334.397±33.640）、（226.527 ± 5.678）ng/ml，SEB濃度在0.01、0.1、1 μg/ml時，肥大細(xì)胞釋放的組胺濃度隨SEB濃度的增加而增高，明顯高于陰性對照組（P＜0.05）；而SEB濃度繼續(xù)增加時，肥大細(xì)胞釋放組胺濃度依次下降。結(jié)論SEB可通過非IgE依賴機(jī)制直接作用于肥大細(xì)胞，使肥大細(xì)胞活化發(fā)生形態(tài)變化并釋放類胰蛋白酶和組胺。

肥大細(xì)胞；金黃色葡萄球菌；腸毒素類；類胰蛋白酶類；組胺；皮炎，特應(yīng)性

近年研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞在炎癥性皮膚病如特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）的發(fā)病過程中起到重要的作用，特別是急性發(fā)作階段［1?2］。AD的發(fā)病機(jī)制涉及到遺傳、免疫、皮膚屏障和感染等多個方面，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)［3］，AD感染與免疫機(jī)制的相互作用是研究熱點之一。金黃色葡萄球菌（金葡菌）的感染/定植在AD的作用中已得到公認(rèn)［4］，其機(jī)制目前認(rèn)為主要是與金葡菌超抗原（staphylococcal super antigen，SsAg）對T細(xì)胞的作用有關(guān)，其中金黃色葡萄球菌腸毒素B（Staphylococcus aureusenterotoxins B，SEB）最常見［4］。以往研究證實，肥大細(xì)胞可通過B淋巴細(xì)胞被金葡菌抗原激活后產(chǎn)生的IgE活化而脫顆粒，間接加重AD的炎癥［5］，但是，金葡菌的感染/定植時產(chǎn)生的超抗原SEB能否直接活化肥大細(xì)胞，以及肥大細(xì)胞是否參與AD金葡菌感染/定植導(dǎo)致的皮炎尚未見報道。我們用LAD2（laboratory of allergic disease 2）肥大細(xì)胞系與SEB共培養(yǎng)，研究SEB對肥大細(xì)胞非IgE機(jī)制的活化作用，進(jìn)一步探討AD相關(guān)發(fā)病機(jī)制。

資料與方法

一、資料

1.實驗細(xì)胞：肥大細(xì)胞系LAD2由北京大學(xué)深圳醫(yī)院余佯洋博士惠贈（為LAD2標(biāo)準(zhǔn)品，來源于美國NIH，Laboratory of Allergic Diseases）［6］。

2.主要實驗試劑：Stem Pro?34培養(yǎng)基（美國Gibco公司），SEB（美國AnaSpec公司），肥大細(xì)胞脫顆粒檢測試劑盒、A23187（美國Millipore公司），組胺ELISA定量檢測試劑盒（美國Genwaybio公司）。

二、方法

1.肥大細(xì)胞系LAD2的建立與培養(yǎng)：LAD2細(xì)胞以含300 U/L干細(xì)胞因子的StemPro?34培養(yǎng)液中（含營養(yǎng)強(qiáng)化劑、100 ng/ml SCF、50 ng/ml IL?6、1%青鏈霉素以及2 mmol/l L谷氨酰胺），在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。細(xì)胞懸浮生長，部分貼壁。每周換液1次，每2周傳代，以每106個細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，選擇生長旺盛、形態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗。

2.LAD2與SEB共孵育體系的建立：將LAD2調(diào)整為濃度2×106/ml的細(xì)胞懸液，在6孔板中每孔加入1 ml細(xì)胞懸液和10 μl不同濃度（0.01、0.1、1、10、100μg/ml）的SEB，為不同濃度SEB組。1ml細(xì)胞懸液+10 μl培養(yǎng)基為陰性對照組，1 ml細(xì)胞懸液+2 nmol/L A23187為陽性對照組。各組在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育30 min。光鏡下觀察孵育前后肥大細(xì)胞的形態(tài)變化。110×g離心收集上清液，4℃儲存，用于檢測。

3.上清液類胰蛋白酶濃度檢測：通過酶活法進(jìn)行檢測。按肥大細(xì)胞脫顆粒檢測試劑盒步驟，取不同待測細(xì)胞上清液180 μl及類胰蛋白酶底物20 μl于96孔板內(nèi)，在37℃恒溫箱內(nèi)孵育2h。在酶標(biāo)儀405nm波長下讀取各孔A值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本的類胰蛋白酶濃度。每組樣本設(shè)3個復(fù)孔取均值。

4.上清液中組胺濃度的檢測：通過組胺ELISA試劑盒采用競爭法原理進(jìn)行檢測。將待測上清液?；螅?0 μl加至96孔板，加入50 μl酶聯(lián)物及50 μl組胺抗血清，振蕩器上室溫溫育3 h。洗滌后加入100 μl TMB底物液，振蕩器上室溫溫育20 min后加入終止液終止底物反應(yīng)，酶標(biāo)儀上450 nm波長處讀取A值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算組胺濃度。每組樣本設(shè)3個復(fù)孔取均值。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析采用SPSS14.0統(tǒng)計分析軟件。數(shù)據(jù)結(jié)果均用±s進(jìn)行描述。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey?Kramer檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、光鏡下觀察LAD2細(xì)胞系與SEB共孵育后肥大細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

共孵育前肥大細(xì)胞呈規(guī)則圓形，大小較為一致，細(xì)胞核偏于一側(cè)，胞質(zhì)內(nèi)具有大量折光性強(qiáng)的顆粒，少數(shù)細(xì)胞細(xì)胞膜處可見芽狀突起；將1 μg/ml的SEB與肥大細(xì)胞共孵育10 min，在光學(xué)顯微鏡×100和×400下觀察到肥大細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，隨時間推移而明顯：肥大細(xì)胞較未共孵育前體積略有增大，折光性下降，細(xì)胞表面突起明顯增多、增長，呈放射狀毛刺樣；此改變與陽性對照組胺釋放劑A23187對肥大細(xì)胞的作用類似。圖1為共孵育前和共孵育30 min時LAD2形態(tài)。

圖1 光鏡下觀察LAD2細(xì)胞系與金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）共孵育前后的細(xì)胞形態(tài)（1A～1C：×100；1D～1F：×400） 1A、1D：共孵育前LAD2細(xì)胞大小一致，核偏于一側(cè)，胞質(zhì)內(nèi)有大量折光性強(qiáng)的顆粒；1B、1E：與SEB共孵育30 min后，LAD2細(xì)胞折光性下降，表面突起明顯增多、增長，呈放射狀毛刺樣；1C、1F：與陽性對照A23187共孵育30 min后，LAD2與SEB處理后類似

二、LAD2細(xì)胞系與不同濃度SEB共孵育后上清液中類胰蛋白酶濃度檢測

檢測結(jié)果見表1。采用單因素方差分析，F(xiàn)=28.951，P＜0.001，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在SEB 0.01、0.1、1 μg/ml組，LAD2細(xì)胞系釋放的類胰蛋白酶濃度均較陰性對照組增高，用Tukey?Kramer檢驗進(jìn)行組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.913，P=0.020、t=5.777，P=0.001和t=3.441，P=0.048），其中SEB 0.1 μg/ml組的類胰蛋白酶濃度達(dá)高峰；而SEB濃度繼續(xù)增長至10 μg/ml及100 μg/ml時，類胰蛋白酶濃度依次下降，低于陰性對照組（t=0.348，P=0.999和t=1.864，P=0.531）。見表 1，圖2。

表1 不同濃度金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）刺激LAD2細(xì)胞系后上清液類胰蛋白酶濃度比較

圖2 肥大細(xì)胞釋放類胰蛋白酶及組胺濃度隨SEB濃度的變化曲線 1：陰性對照；2：0.01 μg/ml；3：0.1 μg/ml；4：1 μg/ml；5：10 μg/ml；6：100 μg/ml SEB：金黃色葡萄球菌腸毒素B

三、LAD2細(xì)胞系與不同濃度SEB共孵育后上清液中組胺濃度檢測

采用單因素方差分析，F(xiàn)=23.024，P＜0.001，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各SEB濃度組組胺濃度均高于陰性對照組，用統(tǒng)計學(xué)Tukey?Kramer檢驗進(jìn)行組間比較，除 SEB 0.01 μg/ml和 100 μg/ml組外，各SEB濃度組與陰性對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），其中SEB 1 μg/ml組的組胺濃度達(dá)高峰。SEB在0.01、0.1、1 μg/ml濃度下，肥大細(xì)胞釋放組胺濃度隨SEB濃度的增加而增高。而SEB濃度增加至10、100 μg/ml時，肥大細(xì)胞釋放組胺濃度依次下降，SEB 10 μg/ml組與陰性對照組比較增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.670，P=0.004），而SEB 100 μg/ml組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.564，P=0.637）。見表2，圖2。

表2 不同濃度金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）刺激LAD2細(xì)胞系上清液組胺濃度比較

討 論

金黃色葡萄球菌是常見毒力最強(qiáng)的表皮定植細(xì)菌，其可分泌腸毒素A～E、中毒休克綜合征毒素1（toxic shock syndrometoxin，TSST?1）、表皮剝脫毒素（exfoliative toxin，ET）等［7］。這些毒素都屬于超抗原（superantigen，sAg），即能在極低濃度下即可非特異地刺激多數(shù)T細(xì)胞克隆活化增殖，產(chǎn)生極強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。AD皮損局部的金葡菌更易于產(chǎn)生外毒素，以SEB最常見，其次為SEA及TSST?1［7?8］，理論上SsAg只需極低濃度（1～10 ng/ml）即可刺激強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，但本研究采用的SEB濃度為10～100 μg/ml，是針對肥大細(xì)胞探討SEB刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的濃度。LAD2細(xì)胞系來源于人肥大細(xì)胞白血病患者的骨髓穿刺液，是目前最適宜做人類肥大細(xì)胞生物學(xué)研究的肥大細(xì)胞系［9］。與傳統(tǒng)肥大細(xì)胞系H肥大細(xì)胞1相比，LAD2活化后能產(chǎn)生更高水平的類胰蛋白酶和糜蛋白酶，更接近成熟的皮膚肥大細(xì)胞［10］。因此，我們采用LAD2模擬成熟肥大細(xì)胞在體外的活化。A23187是一種鈣離子載體，能使鈣離子迅速內(nèi)流［11］，是肥大細(xì)胞脫顆粒實驗的陽性對照試劑。本研究在光鏡下觀察肥大細(xì)胞分別與A23187和SEB共孵育30 min后，均可見到肥大細(xì)胞形態(tài)變化。且記錄形態(tài)變化的同時檢測到肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的組胺及類胰蛋白酶均顯著上升，因此，可證實此種形態(tài)變化即為肥大細(xì)胞活化后脫顆粒的光鏡表現(xiàn)。肥大細(xì)胞的脫顆粒過程通常在電鏡下觀察，而本實驗初步證實，光鏡下也可見LAD2的脫顆粒表現(xiàn)，猜測細(xì)胞邊緣的毛刺狀突起即為肥大細(xì)胞顆粒合并形成的脫粒管道。

在SEB誘發(fā)加重AD皮損的機(jī)制中，除了其強(qiáng)大的活化T細(xì)胞作用外，肥大細(xì)胞的作用機(jī)制是通過活化B細(xì)胞介導(dǎo)的，SEB作為過敏原使B細(xì)胞活化產(chǎn)生IgE后作用于肥大細(xì)胞表面交聯(lián)造成肥大細(xì)胞活化而釋放炎癥介質(zhì)。SEB同時是一種超抗原，是否可以在非IgE機(jī)制下直接活化肥大細(xì)胞？Ackermann等［12］以SEB刺激H肥大細(xì)胞1，發(fā)現(xiàn)SEB可以直接活化肥大細(xì)胞，產(chǎn)生5羥色胺等物質(zhì)。本研究顯示，SEB與LAD2細(xì)胞系共孵育30 min后，肥大細(xì)胞即發(fā)生細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并促進(jìn)類胰蛋白酶及組胺的釋放，且在SEB不同濃度作用下釋放的類胰蛋白酶和組胺水平變化趨勢大致一致。與陰性對照組比較可明顯增強(qiáng)類胰蛋白酶和組胺釋放的SEB濃度分別是0.01～ 1 μg/ml和0.1～ 100 μg/ml（P＜0.05）。進(jìn)一步證實，在無IgE的存在下，超抗原SEB仍可在極低濃度下直接活化肥大細(xì)胞細(xì)胞系LAD2，促使其釋放類胰蛋白酶和組胺，產(chǎn)生類似于肥大細(xì)胞超抗原的作用。因肥大細(xì)胞很敏感，很多因素均可引起活化，故與陰性對照的目的是去除肥大細(xì)胞的非特異活化產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)的釋放。SEB活化肥大細(xì)胞的方式，初步推測可能是通過肥大細(xì)胞表面的模式識別受體Toll樣受體識別的。

Yoshino等［13］在有關(guān)超抗原對AD患者淋巴細(xì)胞的增殖作用的研究中發(fā)現(xiàn)，SEB可誘導(dǎo)重度AD患者T淋巴細(xì)胞的凋亡，同時使外周血單核細(xì)胞的增殖明顯受抑制。本研究顯示，肥大細(xì)胞釋放的類胰蛋白酶和組胺的水平并不隨SEB濃度的增長而一直升高，超過一定濃度范圍（SEB濃度10 μg/ml和100 μg/ml），其活化水平反而隨SEB濃度的增長而下降，與陰性對照組比較，類胰蛋白酶的活性反而更低，組胺水平趨于和陰性對照組相當(dāng)，說明高濃度的SEB可能反而會抑制肥大細(xì)胞的活化，其機(jī)制可能與SEB的毒性作用相關(guān)。綜上所述，本研究通過LAD2與SEB共培養(yǎng)及上清液檢測初步證實SEB可通過非IgE依賴機(jī)制直接作用于肥大細(xì)胞，使肥大細(xì)胞活化發(fā)生形態(tài)變化并釋放類胰蛋白酶和組胺；且SEB對肥大細(xì)胞的作用在中、低濃度下具有活化作用，在濃度過高時具有抑制作用。

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Role ofStaphylococcus aureusenterotoxin B in activation of LAD2 mast cells

Wang Shan,Zhao Zuotao,Wang Yuhan,Tu Ping,Liu Lingling
Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing Key Laboratory of Molecular Diagnosis on Dermatoses,Beijing 100034,China（Current affiliation of the first author was Department of Dermatology,Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,National Center for Children′s Health,Beijing 100045,China）

Liu Lingling,Email:liulingling@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the role ofStaphylococcus aureusenterotoxin B（SEB）in non?IgE mediated activation of mast cells（MCs）byin vitroco?culture of laboratory of allergic disease 2（LAD2）cells and SEB.MethodsThe LAD2 cells were incubated with SEB at different concentrations of 0.01,0.1,1,10 and 100 μg/ml,A23187 positive control and negative control separately for 30 minutes.Then,effects of SEB on the morphology of MCs were observed by using a light microscope,and culture supernatants of the above incubation systems were collected.The concentration of tryptase released from MCs was analyzed by enzymatic activity assay,and the level of histamine was detected by enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsAfter 30?minute co?culture of LAD2 cells and SEB,MCs showed larger size,obscure boundaries,increased number of protuberances on the cell surface and decreased refractivity,with a radial burr fin?like appearance.After 30?minute co?culture of LAD2 cells and SEB at different concentrations of 0.01,0.1,1,10 and 100 μg/ml,the concentrations of tryptase in the culture supernatants were 4.116 ±0.651,5.344±0.874,3.806±0.459,1.309±0.247,0.310±0.199 ng/ml respectively.Additionally,the tryptase levels were significantly higher in the 0.01?,0.1?,1?μg/ml SEB groups than in the negative control group（1.538 ± 0.490,allP＜ 0.05）,and gradually decreased along with the increase of SEB concentrations.The histamine levels in the 0.01?,0.1?,1?,10?and 100?μg/ml SEB groups were 242.409 ± 63.915,522.491 ±73.466,550.926 ± 84.466,334.397 ± 33.640,226.527 ± 5.678 ng/ml respectively.In the 0.01?,0.1?,1?μg/ml SEB groups,the levels of histamine released from MCs were gradually increased along with the increase of SEB concentrations,and were significantly higher than those in the negative control group（146.436±3.100,allP＜ 0.05）.However,with the continued increase of SEB concentrations,the histamine levels gradually decreased.ConclusionSEB can directly activate MCs by a non?IgE mediated mechanism,followed by morphologic changes of MCs and release of tryptase and histamine.

Mast cells;Staphylococcus aureus;Enterotoxins;Tryptases;Histamine;Dermatitis,atopic

劉玲玲，Email：liulingling@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.09.002

2017?02?03）

（本文編輯：吳曉初）