洪甜，閆志風(fēng)，張立，徐小潔，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853；3.總參警衛(wèi)局 衛(wèi)生保健處，北京 100017

應(yīng)用LC3B-PLA2研究Atg4B對(duì)LC3B的切割作用

洪甜1，閆志風(fēng)2，張立3，徐小潔1，葉棋濃1

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853；3.總參警衛(wèi)局 衛(wèi)生保健處，北京 100017

目的：構(gòu)建帶Myc標(biāo)簽的LC3B-PLA2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，獲得LC3B-PLA2融合蛋白，并應(yīng)用LC3B-PLA2研究Atg4B對(duì)LC3B的切割作用。方法：以本實(shí)驗(yàn)室保存的乳腺文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增獲得LC3B序列，與PLA2G10拼接后插入pCMV-Myc載體，用構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)，用LC3B-PLA2與Atg4B共轉(zhuǎn)染的方法檢測(cè)Atg4B對(duì)LC3B的切割作用。結(jié)果：菌液PCR、重組質(zhì)粒雙酶切及測(cè)序均表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，Western印跡結(jié)果表明融合蛋白在HEK293T細(xì)胞中獲得表達(dá)，LC3B-PLA2真核表達(dá)蛋白能夠應(yīng)用于Atg4B對(duì)LC3B切割作用的研究。結(jié)論：構(gòu)建了pCMV-Myc-LC3B-PLA2真核表達(dá)質(zhì)粒，LC3B-PLA2融合蛋白在Atg4B對(duì)LC3B切割作用的研究中至關(guān)重要，為進(jìn)一步研究Atg4B在自噬過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

LC3B-PLA2；Atg4B；自噬；重組質(zhì)粒

自噬是進(jìn)化上保守的，通過(guò)溶酶體依賴(lài)途徑，分解多種蛋白質(zhì)、大分子化合物和細(xì)胞器等，避免細(xì)胞積累未折疊蛋白和衰老細(xì)胞器，起著類(lèi)似“管家”的功能。自噬還可以在營(yíng)養(yǎng)不充足的條件下，維持細(xì)胞ATP的合成[1-3]。通過(guò)對(duì)酵母基因的分析，絕大多數(shù)自噬相關(guān)基因（autophagy-re?lated gene，ATG）已被確定。自噬失調(diào)能導(dǎo)致多種疾病，包括多種腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也與組織缺氧和細(xì)菌感染有關(guān)[4-6]。自噬發(fā)生時(shí)，pro-LC3B（酵母自噬相關(guān)蛋白Atg8的人同源體）被半胱氨酸酶Atg4B切割掉C端的5個(gè)氨基酸殘基，形成激活形式的LC3B-Ⅰ，在自噬前體膜上，LC3B-Ⅰ進(jìn)行PE修飾形成LC3-Ⅱ，Atg4B還可以使LC3-Ⅱ去酯化，使LC3B在自噬過(guò)程中得以重復(fù)利用[7-10]。盡管自噬研究越來(lái)越深入，但是對(duì)細(xì)胞中Atg4B活性的檢測(cè)依然不夠全面，Atg4B上游激活因子、下游抑制因子、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控都有可能調(diào)節(jié)Atg4B的半胱氨酸酶活性，因此，亟待建立檢測(cè)Atg4B活性的實(shí)驗(yàn)方法。在此，我們擬構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Myc-LC3B-PLA2，通過(guò)計(jì)算融合蛋白LC3B-PLA2的被切割程度，在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)Atg4B的半胱氨酸酶活性，為進(jìn)一步研究Atg4B在自噬過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎HEK293T細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)；質(zhì)粒pCMV-Myc為本實(shí)驗(yàn)室保存；VigoFect轉(zhuǎn)染試劑、Western印跡發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ、T4DNA連接酶、PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司；新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM購(gòu)自Gibco公司；胰酶購(gòu)自Amersco公司；Flag-HRP、Myc-HRP和β-actin-HRP單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；引物和 PLA2G10（43～165）片段由博邁德科技發(fā)展有限公司合成。

1.2 LC3B、PLA2引物設(shè)計(jì)及PCR條件

根據(jù)人LC3B的CDS序列和人PLA2G10（43～165）序列合成引物 1（5'-CGGAATTCGGATGCCG TCGGAGAAGACCTTCA-3'）、2（5'-CCTGCCAGTT CCAGGATCCCCACTGACAATTTCATCCCGA-3'）、3（5'-GGGATCCTGGAACTGGCAGGAACTGTGGGTT GTG-3'）、4（5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCA CACTTGGGCGAGTCCGGCTCA-3'）。

以乳腺文庫(kù)為模板，引物1和引物2為上下游引物擴(kuò)增目的片段LC3B；以合成的人PLA2G10（43～165）為模板，引物3和引物4為上下游引物擴(kuò)增目的片段PLA2G10（43～165），1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。以擴(kuò)增產(chǎn)物L(fēng)C3B和PLA2G10（43～165）為模板，引物1和引物4為上下游引物擴(kuò)增目的片段 LC3B-PLA2G10（43～165）。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物L(fēng)C3BPLA2G10（43～165）（后文簡(jiǎn)寫(xiě)為 LC3B-PLA2）。

1.3 pCMV-Myc-LC3B-PLA2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切目的基因LC3B-PLA2和質(zhì)粒載體pCMV-Myc，目的片段直接用膠回收試劑盒回收，酶切載體經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后膠回收大片段；用T4DNA連接酶連接具有相同粘性末端的目的基因和空載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，菌液PCR初步鑒定陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切進(jìn)一步鑒定目的基因是否導(dǎo)入質(zhì)粒載體。

1.4 Western印跡檢測(cè)重組質(zhì)粒的真核表達(dá)

用含雙抗和10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％～90％時(shí)，用VigoFect轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒pCMV-Myc-LC3B-PLA2和空載體pCMV-Myc分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293T細(xì)胞（細(xì)胞接種于6cm皿中，配置含 4μL VigoFect轉(zhuǎn)染試劑的 200μL NaCl溶液，混勻，靜置5min，再將含5μg重組質(zhì)粒的200μL NaCl溶液與上述含 VigoFect的 200μL NaCl溶液混勻，靜置15min，將混好的400μL溶液加入6cm皿中），轉(zhuǎn)染后4～6h換新培養(yǎng)基，24h后收細(xì)胞；RIPA冰上裂解細(xì)胞30min，加等量的2×SDS上樣緩沖緩，沸水煮15min，12 000r/min離心2min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE；電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后，5％脫脂牛奶封閉15min，F(xiàn)lag-HRP、β-actin-HRP抗體室溫孵育1h，1×TBST洗膜5min×3次，用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.5 Western印跡檢測(cè)Atg4B對(duì)LC3B的切割作用

于6cm皿中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)80％～90％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法同上，轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒分別為pcDNA3.0-Flag和pCMV-Myc-LC3B-PLA2共轉(zhuǎn)、pcDNA3.0-Flag-Atg4B和pCMV-Myc-LC3B-PLA2共轉(zhuǎn)。用RIPA冰上裂解30min，加等量2×SDS上樣緩沖液，Western印跡方法同上。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用ImageJ軟件對(duì)Western印跡結(jié)果進(jìn)行灰度分析，數(shù)據(jù)計(jì)算使用公式：CleavedLC3B-PLA2=DLC3B/（DLC3B-PLA2+DLC3B+DPLA2）（D為光密度）。采用雙尾t檢驗(yàn)驗(yàn)證Atg4B活性實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 6軟件，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pCMV-Myc-LC3B-PLA2重組質(zhì)粒的鑒定

以本實(shí)驗(yàn)室保存的乳腺文庫(kù)為模板，用引物1和2擴(kuò)增獲得約375bp的目的片段LC3B；以合成的PLA2G10（43～165）為模板，用引物3和4擴(kuò)增獲得約 372bp的目的片段PLA2G10（43～165）（圖1）。以擴(kuò)增得到的 LC3B 和 PLA2G10（43～165）為模板，用引物1和4擴(kuò)增獲得約747bp的目的片段 LC3B-PLA2G10（43～165）（圖2）。將目的片段LC3B-PLA2G10（43～165）和載體質(zhì)粒雙酶切后連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑菌落進(jìn)行菌液PCR，PCR能擴(kuò)增出近似747bp的菌落，初步認(rèn)為是陽(yáng)性菌落，挑陽(yáng)性菌落提質(zhì)粒后用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，以空載體為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示，酶切的重組質(zhì)粒切開(kāi)為2條帶，分別為空載pCMVMyc和目的基因LC3B-PLA2的大?。▓D3），并經(jīng)測(cè)序證明重組質(zhì)粒pCMV-Myc-LC3B-PLA2構(gòu)建成功。

圖1 LC3B、PLA2G10（43～165）產(chǎn)物電泳圖

圖2 LC3B-PLA2G10（43～165）產(chǎn)物電泳圖

2.2 Western印跡檢測(cè)LC3B-PLA2在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的pCMV-Myc-LC3B-PLA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc質(zhì)粒為陰性對(duì)照，24h后提取蛋白進(jìn)行Western印跡，檢測(cè)LC3B-PLA2融合蛋白的表達(dá)，分別孵育Flag-HRP和β-actin-HRP抗體。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，在相對(duì)分子質(zhì)量約32 000處出現(xiàn)目的條帶LC3B-PLA2，證明重組質(zhì)粒pCMV-Myc-LC3BPLA2獲得表達(dá)（圖4）。

2.3 Western印跡檢測(cè)Atg4B對(duì)LC3B的切割作用

圖3 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-LC3B-PLA2雙酶切電泳圖

圖4 Western印跡檢測(cè)LC3B-PLA2的表達(dá)

分別將質(zhì)粒pcDNA3.0-Flag和pCMV-Myc-LC3B-PLA2、pcDNA3.0-Flag-Atg4B和pCMV-Myc-LC3B-PLA2共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞進(jìn)行Western印跡，結(jié)果顯示Atg4B和LC3B-PLA2均正確表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析表明，與對(duì)照pcDNA3.0-Flag相比，當(dāng)Atg4B存在時(shí)，LC3B-PLA2被更多地切割成LC3B單體（圖5）。

圖5 Western印跡檢測(cè)Atg4B對(duì)LC3B的切割

3 討論

細(xì)胞通過(guò)自噬降解自身蛋白和細(xì)胞器來(lái)重新生成核苷酸、氨基酸、脂肪酸、單糖、ATP，以維持代謝的正常進(jìn)行，使細(xì)胞抵抗饑餓[11-14]。研究表明：自噬能夠防止組織損傷，維持基因組的穩(wěn)定性；自噬能夠促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生；KRAS誘導(dǎo)的腫瘤和BRAF誘導(dǎo)的腫瘤更易引發(fā)自噬；自噬控制肺癌的進(jìn)程；自噬通過(guò)抑制p53的功能抑制腫瘤生長(zhǎng)；自噬減弱細(xì)胞在生命活動(dòng)中對(duì)谷氨酰胺的依賴(lài)；在p53缺失的KRAS誘導(dǎo)的腫瘤中，自噬維持脂質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡[15-17]。自噬可以通過(guò)抑制慢性組織損傷、炎癥、基因組不穩(wěn)定性，抑制腫瘤的起始，還可以在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下維持腫瘤細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)生存[18-20]。

目前，4種酵母Atg4人同源蛋白已被確立，即Atg4A、Atg4B、Atg4C和Atg4D。其中Atg4B對(duì)所有LC3蛋白都具有特異性，能夠切割pro-LC3，去酯化LC3-PE；而Atg4B對(duì)LC3B的切割活性和去酯化活性最高，活性最強(qiáng)[21-23]。在Atg4B-/-小鼠實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論在正常條件還是饑餓條件下，LC3的切割和去酯化都出現(xiàn)了顯著障礙[24]。Reed等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Atg4B的Ser383和Ser392位磷酸化異常時(shí)，Atg4B與酯化形式的LC3的相互作用減弱，從而表現(xiàn)出自噬異常[25]。Ellisen等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Redd1高表達(dá)時(shí)，Atg4B活性下調(diào)，pro-LC3向LC3-Ⅰ的轉(zhuǎn)化減少，自噬異常，導(dǎo)致有缺陷的線粒體大量積累，氧化磷酸化障礙，肌肉中ATP生成減少，運(yùn)動(dòng)能力下降[26]。

為了有效檢測(cè)Atg4B對(duì)LC3B的切割活性，我們構(gòu)建了pCMV-Myc-LC3B-PLA2真核表達(dá)質(zhì)粒，在HEK293T細(xì)胞中獲得表達(dá)；并且發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Atg4B表達(dá)時(shí)，LC3B-PLA2更多地被切割形成LC3B單體，證明LC3B-PLA2是有活性的，能夠用于檢測(cè)Atg4B的半胱氨酸酶活性。這為進(jìn)一步研究Atg4B在自噬過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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LC3B-PLA2 for Measuring Cleavage Activity of Atg4B

HONG Tian1,YAN Zhi-Feng2,ZHANG Li3,XU Xiao-Jie1*,YE Qi-Nong1*
1.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;2.Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;3.Guard Bureau of Health Care,Beijing 100017;China
*Co-corresponding authors,YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com;XU Xiao-Jie,E-mail:miraclexxj@126.com

Objective:To construct recombinant eukaryotic expression plasmid of LC3B-PLA2 and measure activi?ty of Atg4B.Methods:The fragment of human LC3B gene was obtained from a human breast cDNA library by PCR and cloned into pCMV-Myc vector together with PLA2G10.For expression analysis,HEK293T cells were tran?siently transfected with pCMV-Myc-LC3B-PLA2 and analyzed by Western blot.For the activity of Atg4B analysis,HEK293T cells were transiently transfected with pcDNA3.0-Flag and pCMV-Myc-LC3B-PLA2,or pcDNA3.0-Flag-Atg4B and pCMV-Myc-LC3B-PLA2,and analyzed by Western blot.Results:pCMV-Myc-LC3B-PLA2 was veri?fied by PCR and double-enzyme cleavage.Western blot showed that the recombinant plasmid was successfully ex?pressed,and the recombinant protein can measure the activity of Atg4B.Conclusion:The recombinant eukaryotic expression plasmid pCMV-Myc-LC3B-PLA2 has been constructed,and it express protein which plays a critical role for measuring the activity of Atg4B,laying a foundation for the future study of the role of Atg4B in autopha?gy.

LC3B-PLA2;Atg4B;autophagy;recombinant plasmid

Q78

A

1009-0002（2017）04-0490-05

2016-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金（81672602，81472589，81502264）；北京市科技新星計(jì)劃（Z141102001814055）；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院創(chuàng)新基金轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)項(xiàng)目（ZHYX003）

洪甜（1991- ），女，碩士研究生，（E-mail）htian1025@163.com

葉棋濃，（E-mail）yeqn66@yahoo.com；徐小潔，（E-mail）miraclexxj@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.016