常向前,王得順,張愛紅,徐力紅,林虹君

1.武警天津市總隊醫(yī)院 檢驗科，天津 300171；2.防化學(xué)院，北京 102205；3.空軍防化大隊，北京 102206

基于原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)的高靈敏度ELISA方法研究

常向前1,王得順1,張愛紅2,徐力紅3,林虹君3

1.武警天津市總隊醫(yī)院 檢驗科，天津 300171；2.防化學(xué)院，北京 102205；3.空軍防化大隊，北京 102206

目的：對傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，以提高其檢測靈敏度，拓展應(yīng)用范圍。方法：通過在傳統(tǒng)ELISA方法中引入原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)（ATRP）和納米金顆粒（GNPs），并將大量辣根過氧化物酶（HRP）與二抗結(jié)合，提高了HRP與抗原的結(jié)合比例，進(jìn)而實現(xiàn)了對待檢測物的信號放大。結(jié)果：優(yōu)化后的ELISA方法在對β淀粉樣蛋白的檢測中，檢測限（LOD）降低為原來的1/81。結(jié)論：改進(jìn)后的ELISA方法性能穩(wěn)定，靈敏度大幅提高，能夠用于對痕量目標(biāo)檢測物的檢測。

原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)；納米金；酶聯(lián)免疫檢測

1971年瑞典學(xué)者[1]和荷蘭學(xué)者[2]分別報道了將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA方法是利用抗原、抗體兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈現(xiàn)的互補關(guān)系對待測物進(jìn)行檢測，因此該方法具有高度的特異性。此外，該方法還可實現(xiàn)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上進(jìn)行定量。因此，酶聯(lián)免疫法是目前在痕量生物標(biāo)志物、目標(biāo)蛋白質(zhì)檢測中使用最廣的方法之一[3-5]。

盡管ELISA方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、使用方便等優(yōu)點，但隨著科研和實際應(yīng)用要求的不斷提高，其在疾病早期預(yù)防、超痕量目標(biāo)物檢測中仍不能滿足要求[6-10]。鑒于目前ELISA方法存在的局限性，我們通過引入原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（atom transfer radical polymer，ATRP）反應(yīng)和納米金顆粒（gold nanoparticles，GNPs）載體對其進(jìn)行改進(jìn)，建立了一種自組裝的信號放大方法。即，通過ATRP反應(yīng)在納米金表面引入大量活性支鏈，再將大量辣根過氧化物酶（horseradish peroxi?dase，HRP）連接到支鏈上，進(jìn)而提高了HRP和待測抗原的比例，明顯放大了檢測信號，大大提高了檢測靈敏度，降低了檢測限，拓展了該方法的應(yīng)用范圍和領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

血清（含β淀粉樣蛋白）來自北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院）；β淀粉樣蛋白一抗（Aβ-Ab1）、HRP標(biāo)記的二抗（HRP-Ab2）均購自Abcam公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma-Aldrich公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）購自南京市威圣化工貿(mào)易有限公司；檸檬酸鈉購自上海創(chuàng)順化工有限公司；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20 均購自北京化學(xué)試劑公司；實驗用水為二次蒸餾水。

Tecnai G2 20型透射電鏡（FEI香港有限公司）；85-2數(shù)顯型恒溫攪拌器（國瑞試驗儀器廠）；Milli-Q型純水儀（≥18 MΩ，Millipore公司）；Sor?vall Legend Micro 17 Centrifuge（Thermo公司）。

1.2 引發(fā)劑的制備

將0.3g 11-巰基-1-十一烷醇溶于6mL四氫呋喃（提供反應(yīng)的液體環(huán)境）中，再加入108μL吡啶（催化劑），混合后通入氮氣除氧，同時冰浴30min，之后緩慢滴加164μL 2-溴異丁酰溴，并持續(xù)攪拌4h（持續(xù)通氮氣），最后將反應(yīng)后的溶液用濾紙過濾，用氮氣吹干至略黏稠，得到引發(fā)劑，充氮氣后密閉于4℃保存。

1.3 ATRP修飾反應(yīng)

將制備的納米金置于含500μL反應(yīng)液（引發(fā)劑）的EP管中，將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上過夜反應(yīng)，用甲醇清洗掉剩余引發(fā)劑后，加入ATRP反應(yīng)液（2 mol/L GMA，0.02 mol/L CuCl，0.03 mol/L N,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯三胺，0.001 mol/L CuCl2，環(huán)己醇），再加入0.03 mol/L葡萄糖，常溫振搖反應(yīng)24h。

1.3.1 環(huán)氧基團的開環(huán)反應(yīng) 配制體積分?jǐn)?shù)為50％的異丙醇水溶液，并以其為溶劑配制體積分?jǐn)?shù)為60％的乙二胺溶液。將修飾有高密度環(huán)氧基團的納米金置于上述乙二胺溶液中（80℃）反應(yīng)4h，使氨基暴露。

1.3.2 修飾醛基官能團 稱量67.84g磷酸氫二鈉和1.65g磷酸二氫鈉，溶于2 L去離子水中，配制成PBS溶液。以PBS溶液為溶劑，配制體積分?jǐn)?shù)為40％的戊二醛溶液。將1.3.1中獲得的暴露氨基的納米金置于戊二醛溶液中（10～30℃）反應(yīng)12h，即在納米金表面修飾上了醛基。

1.3.3 在納米金表面進(jìn)行抗體和HRP的固定用PBS溶液配制終濃度為2 mg/mL的一抗和HRP溶液（pH8.0），并加入氰基硼氫化鈉使其終濃度為5 mg/mL，混合均勻后作為反應(yīng)液。將1.3.2中獲得的表面修飾上醛基的納米金置于該反應(yīng)液中，4℃反應(yīng)24h后用50mmol/L Tris-HCl緩沖液（50mmol/L Tris溶液用HCl調(diào)至pH8）清洗。

1.3.4 聚合物側(cè)鏈?zhǔn)Ｓ嗳┗姆忾] 向PBS溶液中加入氨基乙醇至其體積分?jǐn)?shù)為1％，將1.3.3中的納米金放入其中，4℃反應(yīng)4～12h。反應(yīng)完成后用50mmol/L Tris-HCl緩沖液（配方同1.3.3中所述）清洗3次，于4℃保存，即獲得上述基于ATRP修飾的納米金-抗體結(jié)合物。

1.4 納米金的制備

將1mL 1％的氯金酸溶液加入100mL雙蒸水中，用力攪拌并加熱至沸騰，迅速加入4.5mL 1％的檸檬酸鈉溶液，充分?jǐn)嚢?，保持沸騰10min。這期間溶液顏色由灰變藍(lán)再變紫，最后為酒紅色。移去熱源，再攪拌15min，自然冷卻至室溫，即制得平均粒徑為16nm的納米金膠體，4℃保存?zhèn)溆?。其透射電鏡圖見圖1。

為了得到分散均勻、大小勻稱的納米金顆粒，首先將所用器皿用王水（濃HCl∶濃HNO3=3∶1）充分浸泡，然后用雙蒸水沖洗，烘干待用。因為此步驟需要絕對清潔的器皿，任何雜質(zhì)都會使制備的納米金顆粒團聚。

2 結(jié)果與討論

2.1 將納米金、抗體結(jié)合物用于ELISA檢測

對新建立的方法進(jìn)行性能測試，具體步驟如下：①將GST蛋白包被在96孔板上，于4℃過夜，次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液沖洗3次，每次3min；②加入按一定比例稀釋的制備一抗于上述已包被的反應(yīng)孔中，37℃孵育1h，然后洗滌；同時以正常一抗做對照，并用空白孔做假陽性對照；③于各反應(yīng)孔中加入臨時配置的TMB底物溶液 0.1mL，37℃孵育 10～30min；④用 2 mol/L 硫酸終止反應(yīng)；⑤用酶標(biāo)儀檢測D450nm值。

2.2 改進(jìn)后的ELISA方法評價

以β淀粉樣蛋白為樣品，對改進(jìn)的ELISA方法進(jìn)行性能評價。β淀粉樣蛋白不僅與神經(jīng)元的退行性病變有關(guān)，而且還可以激活一系列病例事件，包括星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、血腦屏障的破壞和微循環(huán)的變化等，是阿爾茨海默病患者腦內(nèi)老年斑周圍神經(jīng)元變性和死亡的主要原因。

改進(jìn)的ELISA法檢測β淀粉樣蛋白的具體步驟如下：①將β淀粉樣蛋白抗原固定在96孔板上；②用BSA進(jìn)行封閉；③加入一抗，讓其與抗原充分結(jié)合；④洗去未結(jié)合的多余一抗；⑤加入制備好的二抗；⑥加入酶底物，檢測讀數(shù)。

在傳統(tǒng)ELISA方法中，每一個抗原蛋白質(zhì)只能結(jié)合一個對應(yīng)一抗，而每個一抗也只能結(jié)合一個二抗和一個HRP；而在改進(jìn)的ELISA方法中，通過結(jié)合在ATRP支鏈上的納米金載體的放大作用，最終可與多個HRP結(jié)合，能夠?qū)⑤^小的檢測信號放大，提高了檢測的靈敏度。其原理見圖2。

為了進(jìn)一步考察新方法的性能，設(shè)計了如下實驗。如圖3，將配置好的待測樣品平均分成2份，從左至右依次按1/3的比例稀釋。a行采用改進(jìn)的方法進(jìn)行檢測，b行采用傳統(tǒng)ELISA法。從結(jié)果來看，改進(jìn)的方法可以對前8個點（a行中A～H）進(jìn)行有效檢測，而改進(jìn)前則只能對前4個點（b行中A～D）進(jìn)行有效檢測，即改進(jìn)的方法檢測限降低為原來的1/81。多次重復(fù)實驗結(jié)果表明，改進(jìn)的方法性能穩(wěn)定，重復(fù)性好，可用于對樣本中低濃度蛋白質(zhì)進(jìn)行靈敏檢測。

2.3 結(jié)論

通過ATRP反應(yīng)將納米金引入傳統(tǒng)ELISA方法，大大提高了HRP與抗原的結(jié)合比例，對檢測信號進(jìn)行了放大，提高了方法的靈敏度，檢測限降低為傳統(tǒng)方法的1/81，進(jìn)一步拓展了該檢測方法的應(yīng)用領(lǐng)域。而且改進(jìn)的ELISA方法重復(fù)性好，性能穩(wěn)定?？梢灶A(yù)見，新方法將會在蛋白質(zhì)檢測和診斷學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。

圖2 改進(jìn)的ELISA方法信號放大示意圖

圖3 改進(jìn)后（a）和改進(jìn)前（b）的ELISA方法對β淀粉樣蛋白的檢測結(jié)果

[1] Orden D E V.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） quantitative assay ofimmunoglobulin G[J].Immunochemistry,1971,8:871-874.

[2]Weemen B K V,Schuurs A H W M.Immunoassay us?ing antigen-enzyme conjugates[J].FEBS Lett,1971,15:232-236.

[3] Wu Y F,Xue P,Kang Y,et al.Paper-based microflu?idic electrochemical immunodevice integrated with nanobioprobes onto graphene film for ultrasensitive multiplexed detection ofcancer biomarkers[J].Anal Chem,2013,85（18）:8661-8668.

[4] Du D,Wang L M,Shao Y Y,et al.Functionalized graphene oxide as a nanocarrier in a multienzyme la?beling amplification strategy for ultrasensitive electro?chemicalimmunoassayofphosphorylated p53（S392）[J].Anal Chem,2011,83（3）:746-752.

[5] Sia S K,Linder V,Parviz B A,et al.An integrated approach to a portable and low cost immunoassay for resource-poor settings[J].Angew Chem,2004,116:504-508.

[6] Dixit C K,VashistS K,O'Neill F T,et al.Develop?ment of a high sensitivity rapid sandwich ELISA pro?cedure and its comparison with the conventional ap?proach[J].Anal Chem,2010,82:7049-7052.

[7] Du D,Zou Z X,Shin Y,et al.Sensitive immunosen?sor for cancer biomarker based on dual signal amplifi?cation strategy ofgraphene sheetsand multienzyme functionalized carbon nanospheres[J].Anal Chem,2010,82:2989-2995.

[8] Qin D L,He X X,Wang K M,et al.Fluorescent nanoparticle-based indirect immunofluorescence micros?copy for detection of Mycobacterium tuberculosis[J].J Biomed Biotechnol,2007,2007（7）:89364.

[9] Pris A D,Mondello F J,Wroczynski R J,et al.Im?proved specific biodetection with ion trap mobility spectrometry（ITMS）:a 10-min,multiplexed,immuno?magnetic ELISA[J].Anal Chem,2009,81:9948-9954.

[10]Hayashi Y,Matsuda R,Maitani T,et al.Precision,limit of detection and range of quantitation in competi?tive ELISA[J].Anal Chem,2004,76:1295-1301.

High Sensitivity ELISA Method Research Based on Atom Radical Polymerization Reaction

CHANG Xiang-Qian1,WANG De-Shun1,ZHANG Ai-Hong2*,XU Li-Hong3,LIN Hong-Jun3
1.Department of Clinical Laboratory,Tianjin General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces,Tian?jin 300171;2.Institute of Chemical Defense,Beijing 102205;3.Air Force Defense Union,Beijing 102206;China
*Corresponding author,E-mail:hjlhappy7858@163.com

Objective:To improve the traditional enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） strategy for increas?ing its sensitivity and extending the application.Methods:A large amount of horseradish peroxidase（HRP） was in?troduced to secondary antibody by introducing atom transfer radical polymer（ATRP） reaction and gold nanoparticles（GNPs）.The modification improved the binding ratio of HRP to secondary antibody,achieved the object of detec?tion signal amplification,and improved the traditional detection sensitivity greatly.Results:Limit of detection（LOD） after improvement decreased to 1/81 of that in traditional ELISA method.Conclusion:The newly built ELISA method had good stability,excellent sensitivity,and was able to detect ultralow-abundancy analytes.

atom transfer radical polymer;gold nanoparticles;enzyme-linked immunosorbent assay

R392.1

A

1009-0002（2017）04-0534-04

更正聲明

應(yīng)第一作者張傳朋要求，本刊2016年第27卷第6期804～807頁刊發(fā)的論文《腸出血性大腸桿菌O157∶H7前噬菌體CP-933Y缺失突變株的構(gòu)建》，通信作者應(yīng)為王慧（E-mail：geno0109@vip.sina.com）。

《生物技術(shù)通訊》雜志社

2017-01-24

天津市科技計劃（14ZCDZSY00033）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（14JCQNJC12600）；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金（FYM201514）

常向前（1982- ），男，研究生學(xué)歷，（E-mail）changxq13820668062@163.com

通信作者：張愛紅，（E-mail）hjlhappy7858@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.026

特此聲明。