趙路陽，張康，顧成磊,3，葉明俠，范文生，韓為東，孟元光

1.解放軍總醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科；b.基礎(chǔ)研究所，北京 100853；2.北京華信醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100016；3.解放軍第309醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100091

基于microRNA-mRNA配對表達(dá)譜進(jìn)行聯(lián)合分析的方法學(xué)進(jìn)展

趙路陽1a，張康2，顧成磊1a,3，葉明俠1a，范文生1a，韓為東1b，孟元光1a

1.解放軍總醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科；b.基礎(chǔ)研究所，北京 100853；2.北京華信醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100016；3.解放軍第309醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100091

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，主要通過降解靶基因或抑制靶基因的翻譯而調(diào)控表達(dá)。由于其作用機(jī)制復(fù)雜，目前尚未發(fā)現(xiàn)高效而低成本的靶標(biāo)定位方法。近年來，基于堿基互補(bǔ)配對原理的計(jì)算機(jī)預(yù)測法被廣為應(yīng)用，但此方法假陽性高，不同算法所得結(jié)果差異大，會(huì)誤導(dǎo)和干擾下游的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。因此，有研究者提出結(jié)合樣本配對mRNA表達(dá)量來進(jìn)一步定位靶基因，明確miRNA-mRNA相互作用方式，這種聯(lián)合分析的方法受到了普遍認(rèn)可。本文回顧了近年來基于miRNA-mRNA配對表達(dá)譜進(jìn)行聯(lián)合分析的方法學(xué)進(jìn)展，并簡要分析各類方法的應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，為后續(xù)研究者選擇方法提供參考。

microRNA；microRNA靶標(biāo)預(yù)測；microRNA-mRNA相互作用；聯(lián)合分析

microRNA（miRNA）是一類長19～22 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，主要在翻譯水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]。絕大多數(shù)miRNA的編碼基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成初級莖環(huán)結(jié)構(gòu)，隨后在Drosha的作用下形成發(fā)夾狀的前體miRNA，再由Dicer剪切成為雙鏈miRNA并整合入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體中。miRNA的5'端含有一段種子序列，可與mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）的調(diào)控元件相互作用，如果二者完全匹配，則靶mRNA被復(fù)合體降解，若為部分匹配則抑制靶mRNA的翻譯。既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)控機(jī)體多種病理生理學(xué)過程，如細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡，能量代謝，腫瘤發(fā)生，心血管疾病，糖尿病等[2]。因此，全面準(zhǔn)確地認(rèn)識(shí)miRNA的作用機(jī)制并了解相關(guān)生物學(xué)功能，將有助于揭示疾病的病因，發(fā)現(xiàn)診斷、預(yù)后標(biāo)志物，并為靶向治療提供參考和依據(jù)。

目前，使用基于堿基互補(bǔ)配對原理的計(jì)算機(jī)軟件對miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測的方法因成本低，對先驗(yàn)知識(shí)要求少而廣為應(yīng)用[3]。盡管通過軟件預(yù)測可以迅速獲得結(jié)果，但該方法的假陽性率和假陰性率高，不同軟件的結(jié)果差異較大，對下游功能學(xué)實(shí)驗(yàn)造成了干擾和誤導(dǎo)[4]。究其原因，主要是miRNA與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)短，特異性低，不同算法間極小的差異都會(huì)引起結(jié)果的巨大變化，同時(shí)軟件預(yù)測不能考慮某些情形下特異性miRNA和mRNA表達(dá)的情況[5]。在此背景下，通過計(jì)算機(jī)輔助算法整合miRNA和mRNA配對表達(dá)譜來確定miRNA-mRNA相互作用（miRNA-mRNA interactions，MMIs）的方法應(yīng)運(yùn)而生。由于miRNA表達(dá)發(fā)生改變時(shí)，其所調(diào)控的mRNA表達(dá)譜也隨之出現(xiàn)相應(yīng)的表達(dá)改變，所以利用miRNA與mRNA的配對表達(dá)譜可以高精度地分辯出功能性miRNA的靶向關(guān)系。在此，我們回顧了近年來miRNA-mRNA聯(lián)合分析的方法學(xué)進(jìn)展，并簡要分析各類方法的應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，希望能為后續(xù)MMIs研究者選擇分析方法提供參考。

1 MMIs分析流程

基于表達(dá)譜的MMIs分析主要包括數(shù)據(jù)的預(yù)處理、計(jì)算機(jī)分析和結(jié)果驗(yàn)證三部分（圖1）。從數(shù)據(jù)庫或高通量等方法獲得的miRNA和mRNA表達(dá)量經(jīng)過數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、差異表達(dá)分析等預(yù)處理后，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?biāo)本數(shù)量等條件選擇合適的計(jì)算機(jī)分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，獲得陽性的MMIs后采用RT-qPCR、干擾試驗(yàn)、螢光素酶等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以驗(yàn)證。本文重點(diǎn)對計(jì)算機(jī)分析這一步驟進(jìn)行綜述。

2 MMIs常見分析方法

基于配對表達(dá)譜的MMIs聯(lián)合分析根據(jù)統(tǒng)計(jì)方法的差異可分為以下6類：相關(guān)性分析法、回歸分析法、貝葉斯推理法、因果推論法、其他方法和綜合分析法（表1）。由于每種方法的側(cè)重點(diǎn)不同，各有優(yōu)勢，所以研究人員應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)類型和研究目選擇最佳的分析方法。

圖1 MMIs分析流程圖

表1 miRNA-mRNA常見分析方法

2.1 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析是對2個(gè)或多個(gè)變量進(jìn)行分析，以衡量變量間關(guān)系密切程度的一類統(tǒng)計(jì)方法。在MMIs中，miRNA主要對mRNA起負(fù)向調(diào)控作用（圖2A），因此重點(diǎn)關(guān)注負(fù)相關(guān)系數(shù)的結(jié)果，其絕對值越大說明相關(guān)性越強(qiáng)。Pearson相關(guān)系數(shù)是最常用來反映2個(gè)正態(tài)分布的變量間線性關(guān)系的統(tǒng)計(jì)量[6]。在計(jì)算MMIs時(shí)，須提供5例以上樣本的配對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；當(dāng)樣本量較少（3～5例）時(shí)，可采用Spearman相關(guān)系數(shù)方法進(jìn)行分析。Pear?son和Spearman方法的優(yōu)勢是計(jì)算簡便、結(jié)果明確，但只能反映變量間的線性關(guān)系，而實(shí)際數(shù)據(jù)中變量間存在大量非線性關(guān)系，為此，有研究者提出使用互信息（mutual information，MI）和最大信息數(shù)（maximal information coefficient，MIC）等模型來衡量變量間的非線性強(qiáng)度。MI是信息論中的一種度量方法，關(guān)注2個(gè)隨機(jī)變量之間的相互性，可以看成是一個(gè)隨機(jī)變量中包含的關(guān)于另一個(gè)隨機(jī)變量的信息量，適用于大樣本量的分析[7]，在MMIs分析中需要提供20例以上的配對表達(dá)譜（n＞20）。MIC是在MI的基礎(chǔ)上優(yōu)化發(fā)展起來的一種分析方法，具有普適性、公平性、對稱性等優(yōu)勢，當(dāng)樣本量足夠時(shí)，可以捕獲多種函數(shù)關(guān)系，被稱為大數(shù)據(jù)時(shí)代相關(guān)性分析的最佳算法[8]。

2.2 回歸分析

回歸分析是判別因變量和自變量間關(guān)系的重要方法之一，它可以估計(jì)2個(gè)或2個(gè)以上變量間的關(guān)系，明確多個(gè)自變量對因變量的影響強(qiáng)度，構(gòu)建預(yù)測模型。在實(shí)際MMIs中，1個(gè)miRNA可能調(diào)控多個(gè)靶基因，反之1個(gè)基因也可能被多個(gè)miRNA調(diào)控（圖2B）。因此，單純的相關(guān)性分析不能全面反映某種特定情況下miRNA-mRNA的實(shí)際關(guān)系，而回歸分析則彌補(bǔ)了這種不足，更符合miRNA-mRNA調(diào)控的真實(shí)情況。Jayaswal等首次用最小二乘法回歸對miRNA和mRNA表達(dá)值進(jìn)行了MMI分析[9]，隨后Li等完善了部分算法并建立了結(jié)腸癌特異性的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10]。近來，因?yàn)長asso回歸、Ridge回歸和Elasticnet等3種分析方法能應(yīng)對多重共線性數(shù)據(jù)，而被廣泛應(yīng)用于高通量數(shù)據(jù)相關(guān)性的預(yù)測中[11-13]。

圖2 不同分析方法預(yù)測miRNA-Target相關(guān)性的示意圖

2.3 貝葉斯推理

傳統(tǒng)的預(yù)測方法在預(yù)測過程中大多只利用模型和樣本數(shù)據(jù)2種信息，而貝葉斯推理應(yīng)用了決策者的主觀信息，是對基于假設(shè)的先驗(yàn)概率進(jìn)行修正的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。在MMIs分析中應(yīng)用的預(yù)測假設(shè)是：①miRNA對mRNA起負(fù)調(diào)控作用；②當(dāng)多個(gè)miRNA作用于同一個(gè)靶標(biāo)時(shí)，對mRNA表達(dá)水平的影響是線性疊加。2007年，Huang等報(bào)道了一種運(yùn)算法則——GenMiR++，他們用這種算法獲得了一張包含104個(gè)miRNA和1597個(gè)靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)圖，并得出結(jié)論：與以序列為基礎(chǔ)的預(yù)測相比，GenMiR++預(yù)測與基因注解有更高的一致性，是更精確的預(yù)測方法[14]。之后，他們在原有版本基礎(chǔ)上完善了評估特異性序列（如高AU含量、雜交能量等）的功能，升級為GenMiR3模型[15]。由于GenMir++引入的不同推論的最大期望算法耗時(shí)很長，Su等引入了馬爾可夫鏈蒙特卡洛算法，開發(fā)了HCtarget模型，增加了計(jì)算的時(shí)效性[16]。

2.4 因果推論

因果推論在相關(guān)性的基礎(chǔ)上強(qiáng)調(diào)原因先于結(jié)果的特性，其應(yīng)用于MMI分析的理論依據(jù)是：相關(guān)分析、回歸分析和貝葉斯推理等研究方法關(guān)注miRNA-mRNA的相關(guān)性，而miRNA和mRNA之間的強(qiáng)相關(guān)性可能是由于mRNA對miRNA的調(diào)控作用或其他轉(zhuǎn)錄因子對二者共同的調(diào)控而產(chǎn)生的協(xié)同變化，不能說明二者之間的因果關(guān)系。經(jīng)典的因果推論方法是在對照研究中通過敲除miRNA后觀察靶mRNA表達(dá)發(fā)生的變化，但該方法耗時(shí)、耗力、耗錢。2000年P(guān)earl等首次提出應(yīng)用do-calculus方法對觀測數(shù)據(jù)進(jìn)行因果預(yù)測[17]。這種方法基于有向無環(huán)圖（directed absent graph，DAG）的因果框架，但在實(shí)際計(jì)算中有時(shí)難以獲得DAG，因此該方法不具有普適性。Maathuis等提出了一種名為IDA的方法，彌補(bǔ)了必須提供DAG結(jié)構(gòu)的缺陷[18]。Le等認(rèn)為miRNA與mRNA互作方式復(fù)雜，miRNA在調(diào)控mRNA的同時(shí)也會(huì)調(diào)控某些非編碼RNA，包括其他miRNA。因此，他們在IDA的基礎(chǔ)上增加了多對多的因果關(guān)系算法，并在miRNA敲除試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證[19]。

2.5 其他方法

Z-score是用來預(yù)測基因敲除試驗(yàn)結(jié)果的一種網(wǎng)絡(luò)方法，在敲除特定的miRNA后，可以計(jì)算出發(fā)生改變的基因偏離標(biāo)準(zhǔn)值的情況[20]。在分析MMI時(shí)，基于假設(shè)錄入的miRNA的表達(dá)量為最低值，以此模擬miRNA被敲除的情況，再對應(yīng)已知mRNA的表達(dá)量計(jì)算得分。Li等認(rèn)為，盡管回歸分析考慮了多個(gè)miRNA對同一個(gè)mRNA的競爭調(diào)控作用，但未考慮多個(gè)mRNA對同一個(gè)miRNA的競爭作用。當(dāng)一個(gè)miRNA具有大量靶基因時(shí)，因?yàn)樾枰偁幇薪Y(jié)合位點(diǎn)，對每個(gè)靶標(biāo)的調(diào)控作用將會(huì)被“稀釋”。于是，他們開發(fā)了ProMISe模型，側(cè)重預(yù)測mRNA與miRNA間的競爭性調(diào)節(jié)關(guān)系[21]。近來，Zoh等提出用典型相關(guān)分析方法很可能忽略二代測序中低表達(dá)（1～2個(gè)counts）數(shù)據(jù)間的強(qiáng)相關(guān)性，于是在Pearson相關(guān)系數(shù)和貝葉斯算法的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出PCAN模型，用于估算低表達(dá)量間的相關(guān)性[22]。

2.6 綜合分析法

為了完整準(zhǔn)確地預(yù)測miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，Le等將多種方法組合后進(jìn)行綜合分析，采用波達(dá)計(jì)數(shù)法排列統(tǒng)計(jì)，最終提供研究者最為關(guān)注的Top k靶標(biāo)列表（k值由研究者決定）。他們選用NCI-60數(shù)據(jù)庫中的EMT（Epithelial to Mesen?chymal Transition）數(shù)據(jù)、MCC（Multi-class cancer）數(shù)據(jù)庫中的多種癌癥數(shù)據(jù)及BR51（51 human breast cancer cell lines）數(shù)據(jù)庫中不同乳腺癌亞型的數(shù)據(jù)來綜合比較不同綜合分析方法的優(yōu)缺點(diǎn) ，利 用 Tarbase、miRecords、miRWalk 和 miRTar?Base等4個(gè)數(shù)據(jù)庫交集的結(jié)果驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果，最后得出Pearson+IDA+Lasso的組合是最優(yōu)選的綜合分析法的結(jié)論[23]。但由于綜合分析法應(yīng)用少，尚無足夠證據(jù)證明綜合分析法優(yōu)于單一分析法。

3 MMIs分析常用軟件

上述分析方法均可在相應(yīng)的參考文獻(xiàn)中找到對應(yīng)的算法公式或開發(fā)的軟件包供研究人員下載使用，以下重點(diǎn)對3個(gè)常用軟件進(jìn)行介紹。

MAGIA是由Bisognin等開發(fā)設(shè)計(jì)的一個(gè)MMI統(tǒng)計(jì)分析的網(wǎng)絡(luò)軟件，目前已升級到MAGIA2版本（http://gencomp.bio.unipd.it/magia2）[24-25]。使用者上傳miRNA和對應(yīng)的mRNA表達(dá)譜后，可以在8個(gè)miRNA靶標(biāo)預(yù)測數(shù)據(jù)庫（Microcosm、microrna.org、DIANA-microT、miRDB、PicTar、PITA、RNA22、TargetScan）中選擇交集或并集的靶基因，再根據(jù)數(shù)據(jù)量、研究方向選擇Spearman correlation、Pear?son correlation、MI（適用于20例以上的大樣本）和Meta-analysis（適用于非配對樣本）等4種統(tǒng)計(jì)方法中的一種進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果提供交互網(wǎng)絡(luò)圖和表格下載。MAGIA軟件具有操作簡單、使用方便、可直接提供調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖的輸出等優(yōu)點(diǎn)，但統(tǒng)計(jì)方法相對單一。

TaLasso是Muniategui等基于Lasso模型建立的網(wǎng)絡(luò)分析軟件（http://talasso.cnb.csic.es/）[26]，需要研究者提供配對的miRNA和mRNA表達(dá)譜。在靶基因預(yù)測環(huán)節(jié)，提供 miRGen、miRBase、miRan?da、TarBase、miRecords和miRWalk等6個(gè)數(shù)據(jù)庫可供選擇。在聯(lián)合分析時(shí)，除Lasso回歸外，還可以選擇GenMiR++或Pearson系數(shù)2種分析方法，結(jié)果提供得分和P值，并以表格形式輸出。如果繪制網(wǎng)絡(luò)圖片，則需要使用Cytospace等繪圖軟件對結(jié)果進(jìn)行二次制作。

miRLAB是Le等設(shè)計(jì)的一款基于R語言的軟件包（http://bioconductor.org/packages/release/bioc/ht?ml/miRLAB.html）[27]，下載安裝后可在本地進(jìn)行全部分析內(nèi)容。該軟件提供了3個(gè)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫包，也可直接通過模塊中TCGA數(shù)據(jù)庫中的鏈接進(jìn)行下載，或上傳自備數(shù)據(jù)。獲得原始數(shù)據(jù)后還可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、差異分析等預(yù)處理。在數(shù)據(jù)分析模塊中，提供了12種MMI分析方式（Pearson相關(guān)、Spearman相關(guān)、Kendall等級相關(guān)、距離相關(guān)、Hoeffding相關(guān)、隨機(jī)相關(guān)系數(shù)、MI、Lasso回歸、Elastic-net回歸、IDA、Z-score和 ProMISe）以供選擇。在數(shù)據(jù)整合環(huán)節(jié)，在常規(guī)靶基因預(yù)測基礎(chǔ)上增加了HITS-CLIP、PAR-CLIP和iCLIP的分析方式，可以直接揭示miRNA分子與其結(jié)合蛋白的相互作用。在結(jié)果驗(yàn)證環(huán)節(jié)，提供了既往驗(yàn)證的miRNA數(shù)據(jù)庫和干擾試驗(yàn)。此外，還提供GO和KEGG等下游分析模塊。與MAGIA和TaLasso相比，miRLAB的優(yōu)勢在于MMI分析方式多，使用范圍廣，但須掌握一定的R語言基礎(chǔ)知識(shí)方能進(jìn)行操作。

4 結(jié)語

目前人們對miRNA的研究仍處于早期探索階段，大部分研究還局限于通過生物信息學(xué)軟件結(jié)合miRNA的部分特征對其靶標(biāo)和功能進(jìn)行預(yù)測。但這種方法假陽性率高，不具有普遍適用性，預(yù)測效果并不樂觀。隨著高通量技術(shù)的廣泛應(yīng)用，利用miRNA和mRNA表達(dá)譜進(jìn)行聯(lián)合分析越來越受到人們的認(rèn)可并逐漸普及。盡管現(xiàn)有模型預(yù)測的結(jié)果仍然不夠準(zhǔn)確，且需要下游實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但隨著對miRNA作用機(jī)制的深入研究，基于配對表達(dá)譜進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測的方法也在日漸豐富和完善。相信在不久的將來，在多學(xué)科研究人員的共同努力下，MMIs將會(huì)出現(xiàn)更加便捷、全面、準(zhǔn)確的研究方法。

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Progressin the Integrative AnalysisofmicroRNA and mRNA Expression Data

ZHAO Lu-Yang1a,ZHANG Kang2,GU Cheng-Lei1a,3,YE Ming-Xia1a,FAN Wen-Sheng1a,HAN Wei-Dong1b,MENG Yuan-Guang1a*
1.a.Department of Gynecology and Obstetrics;b.Institute of Basic Medicine;Chinese PLA General Hopsital,Bei?jing 100853;2.Department of Gynecology and Obstetrics,Beijing Huaxin Hospital,Beijing 10016;3.Department of Gynecology and Obstetrics,PLA 309 Hospital,Beijing 100091;China
*Corresponding author,E-mail:meng6512@vip.sina.com

microRNAs（miRNAs） are endogenous non-coding small RNAs that interact with their mRNAs by de?grading or inhibiting translation of the targets.Up to date,there is still no low-cost and effective miRNA target screening method because the regulatory mechanisms are complex.In recent years,some investigators built several computational methods based on sequence complementarity of the miRNA and the mRNAs.However,the results are various out of different algorithms and have huge rate of false positives,which caused great troubles in down?stream experiments.Therefore,methods of using the expression values of miRNAs and mRNAs to refine the re?sults has been proposed,which have shown to effectively identifying the most prominent interactions.Here,we summarized these methods that combining both miRNA expression values and mRNA expression values and to pre?dict miRNA targets,outlined the advantages and disadvantages of different methods,and provided directions for fu?ture investigation.

microRNA;microRNA target prediction;microRNA-mRNA integration;integrative analysis

Q78;Q811.4

A

1009-0002（2017）04-0545-06

2016-12-22

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81571411）

趙路陽（1988- ），女，博士研究生，（E-mail）zlynfyd@163.com

孟元光，（E-mail）meng6512@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.029