魏田力，鄭文芝，麻粉蓮，姚立紅，陳愛珺，崔紅，鄭麗舒

1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京 100050；2.中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

呼吸道感染住院患兒Merkel細(xì)胞多瘤病毒檢測及臨床研究

魏田力1，鄭文芝2，麻粉蓮2，姚立紅2，陳愛珺2，崔紅1，鄭麗舒2

1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京 100050；2.中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

目的：了解北京地區(qū)Merkel細(xì)胞多瘤病毒（MCPyV）在呼吸道感染住院兒童中的流行情況和臨床特點。方法：采集北京友誼醫(yī)院兒科呼吸道感染住院患兒的鼻咽抽吸物樣本200份，并收集相應(yīng)的患兒臨床資料，采用Taq?Man real-time PCR方法檢測MCPyV LTAg基因，并經(jīng)測序確認(rèn)；MCPyV陽性樣本同時檢測常見的人呼吸道病毒混合感染情況。結(jié)果：200份標(biāo)本中共檢出MCPyV陽性6例，檢出率3％；感染兒童年齡從6月到5歲，其中年齡≤3歲的占83.3％（5/6）。診斷包括支氣管肺炎和急性支氣管炎，臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、咳嗽、喘息。6例陽性樣本均與其他呼吸道病毒混合感染，A型流感病毒和呼吸道合胞病毒混合感染最常見，6例陽性樣本MCPyV載量均低于10拷貝/μL。結(jié)論：real-time PCR方法檢測呼吸道感染住院患兒中MCPyV的感染率為3％，6例MCPyV陽性樣本均與其他呼吸道病毒混合感染且MCPyV載量較低，不能認(rèn)為MCPyV是兒童呼吸道感染的病因。

Merkel細(xì)胞多瘤病毒；TaqMan探針實時熒光定量PCR；呼吸道感染

人多瘤病毒（huamn polyomavirus，HPyV）為閉合環(huán)狀雙鏈DNA病毒，因其能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種腫瘤而得名，包括1971年發(fā)現(xiàn)的BKPyV、JCPyV,以及2007年以來發(fā)現(xiàn)的WUPyV、KIPyV、MCPyV、TSPyV、HPyV6、HPyV7、HPyV9、HPyV10、STLPyV、HPyV12和NJPyV等[1]，不同的多瘤病毒感染不同的靶器官并導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等疾病[2]。Merkel細(xì)胞癌（Merkel cell carcinoma，MCC）是一種罕見的、侵襲性的神經(jīng)內(nèi)分泌來源的皮膚腫瘤，主要發(fā)生于老年人和免疫缺陷病人。2008年，F(xiàn)eng等應(yīng)用數(shù)字轉(zhuǎn)錄消減技術(shù)，在MCC組織中檢測到Merkel細(xì)胞多瘤病毒（Merkel cell polyomavirus，MCPyV），并證明MCPyV與MCC相關(guān)[3]。 隨后，在各種樣本中均檢出MVPyV的基因片段，包括皮膚、呼吸道分泌物、腸道和腫瘤組織，在免疫抑制病人的血液中也存在[4-7]。雖然對MCPyV的分子生物學(xué)特征已有所了解，但是其與宿主之間的相互影響還不是很清楚，需要研究更多的關(guān)于人多瘤病毒的生物學(xué)和流行病學(xué)資料。TaqMan探針實時定量PCR檢測方法有較好的靈敏度和特異性，可以直接對產(chǎn)物進(jìn)行定量，且操作簡單自動化程度高。本研究建立了MVPyV LTAg基因的核酸Taq?Man探針實時定量PCR檢測方法，對200份呼吸道感染住院兒童的鼻咽抽吸物樣本進(jìn)行了檢測和MCPyV的流行病學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 采樣對象

2014年1～4月于北京友誼醫(yī)院兒科采集200例[男112例，女88例，性別比例1.44∶1，中間年齡為24個月（3d～14歲）]14歲以下呼吸道感染住院患兒的鼻咽抽吸物（NPA）樣本200份，并收集相應(yīng)的患兒臨床資料，所有收集的樣本經(jīng)過患兒父母的知情同意。NPA樣本采集后送到中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測方法的建立與評價

1.2.1 核酸提取 常規(guī)處理收集的NPA樣本，用QIAamp MinElute Virus Spin Kit提取200份NPA中的病毒總核酸。

1.2.2 TaqMan real-time PCR方法的建立 利用在線軟件（http://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/）設(shè)計引物和探針，McPyV LTAg為靶基因。上游引物為McPyV-F（5′-TCTGGGTAT GGGTCCTTCTC-3′），下游引物為 McPyV-R（5′-C ATGGTGTTCGGGAGGTATATC-3′），熒光探針為McPyV-P（FAM-ACTGGGAGTCTGAAGCCTGGGATAMRA），擴(kuò)增產(chǎn)物長度為79bp。GenBank BLAST評價引物和探針的特異性。引物和探針均由Invitrogen公司合成。采用ABI公司的熒光定量檢測試劑盒（TaqMan Gene Expression）進(jìn)行擴(kuò)增，20μL 反應(yīng)體系包括 2×TaqMan Gene Expres?sion Master Mix 10μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各 1.8μL，探針（10 pmol/μL）0.2μL，模板2μL，無 RNA 酶雙蒸水 4.2μL。反應(yīng)條件：50℃2min，95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環(huán)。實時熒光定量PCR儀型號為MX3005P（Agilent Stratagene）。

1.2.3 TaqMan real-time PCR方法的靈敏性、特異性和可重復(fù)性評價 反應(yīng)產(chǎn)物與pMD18-T載體連接為pMD18-T/MC，提取質(zhì)粒測序正確后測定質(zhì)粒濃度，計算拷貝數(shù)。1/10梯度稀釋質(zhì)粒pMD18-T/MC，分別以 1010～100拷貝/μL 為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測方法的靈敏性。將本科室保存的其他多瘤病毒（HPyV6、WUPyV、KIPyV、JCPyV）陽性核酸樣本作為待檢樣本，用MCPyV的引物探針在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，同時設(shè)陰性（無RNA酶雙蒸水）和陽性（pMD18-T/MC質(zhì)粒）對照，評價檢測方法的特異性。用5個濃度（107～103拷貝/μL）的pMD18-T/MC質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，每個濃度重復(fù)4次，分別計算Ct值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV），評價檢測方法的可重復(fù)性。

1.3 臨床樣本NPA的檢測和流行病學(xué)分析

用上述建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法檢測200份NPA樣本核酸，對陽性樣本進(jìn)行測序鑒定。用普通PCR方法檢測確認(rèn)的MCPyV陽性樣本與常見呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒（RSV），人 偏 肺 病 毒（HMPV），人 博 卡 病 毒（HBoV），流感病毒（Flu）A、B、C，副流感病毒1～4（PIV1～4），人 冠 狀 病 毒（HCoV-229E、HCoVOC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1）的共感染性，以及與WUPyV和KIPyV的共感染情況[8]。對收集的臨床資料進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 TaqMan real-time PCR方法的靈敏性、特異性和可重復(fù)性分析

以不同濃度梯度的質(zhì)粒pMD18-T/MC為模板進(jìn)行real-time PCR，獲得擴(kuò)增曲線，檢測靈敏度為 1 拷貝/μL，檢測線性范圍為 1010～100拷貝/μL，陰性對照無擴(kuò)增信號（圖1A）；標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.997，表明線性關(guān)系較好（圖1B）。用建立的方法對本科室保存的其他多瘤病毒（HPyV6、WUPyV、KIPyV、JCPyV）陽性樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅陽性對照pMD18-T/MC質(zhì)粒出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他樣本及陰性對照均未出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線（圖2），表明本方法具有較好的核酸擴(kuò)增特異性。對5個不同濃度梯度（107～103拷貝/μL）的pMD18-T/MC質(zhì)粒模板重復(fù)擴(kuò)增檢測4次，Ct值變異系數(shù)均小于1.5％，證明該方法穩(wěn)定性和可重復(fù)性較好（表1）。

圖1 MCPyV TaqMan real-time檢測的靈敏性分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 NPA樣本的MCPyV檢測和流行病學(xué)分析

200份NPA樣本共檢出MCPyV陽性樣本6例（3％），包括2名男性患兒（2/112，1.8％）和4名女性患兒（4/88，4.5％），感染兒童年齡從6個月到5歲，大部分為嬰幼兒，年齡≤3歲的占83.3％（5/6）。陽性嬰幼兒主要診斷為支氣管肺炎和急性支氣管炎，癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、喘息。6例MCPyV陽性樣本在NPA中的病毒載量均小于10拷貝/μL，結(jié)果見表2。

2.3 MCPyV陽性樣本與其他呼吸道病毒混合感染情況

6例MCPyV陽性樣本均與其他呼吸道病毒混合感染，混合感染率為100％。其中A型流感病毒和RSV是最常見的混合感染，混合感染率分別為66.7％（4/6）和50％（3/6）。在混合感染中，最常見兩重混合感染，占50％（3/6），三重和四重混合感染分別為33.3％（2/6）、16.7％（1/6），結(jié)果見表3。

圖2 MCPyV TaqMan real-time檢測的特異性

表1 MCPyV TaqMan探針實時定量PCR方法可重復(fù)性分析

3 討論

多瘤病毒科的病毒是感染人類的最小病毒之一，基因組長度和粒徑大小均相似，直徑40～45nm，無包膜的二十面體病毒粒子包括5000bp大小的環(huán)形雙鏈DNA基因組?；蚪M分為3個區(qū)域，即非編碼控制區(qū)（NCCR），編碼大T和小T抗原的早期基因和編碼衣殼蛋白VP1、VP2、VP3的晚期基因[9]。目前，HPyV家族有13個成員，包括1971年分離到的BKPyV和JCPyV，以及2007年以來檢測到的KIPyV、WUPyV等11種人多瘤病毒。發(fā)現(xiàn)WUPyV和KIPyV以來，世界各地的呼吸道樣本中都檢測到病毒序列，表明這2種病毒在呼吸道疾病人群中廣泛傳播[10]。人多瘤病毒中只有2種與人類特異性疾病相關(guān)：MCPyV與MCC相關(guān)[3]，MCC為罕見的皮膚病，在老年人和免疫抑制人群中常見；TSPyV與罕見的免疫缺陷病人的濾泡性皮膚病trichodysplasia spinulosa相關(guān)[11]。因為多瘤病毒數(shù)量在增加，因此其在疾病中的作用受到廣泛關(guān)注。

血清學(xué)研究表明，非MCC的健康成人MCPyV血清抗體陽性率為88％和57.9％，小于10歲的兒童MCPyV血清抗體陽性率為25％[12-13]，表明兒童期就已暴露于MCPyV。由于很多HPyV的初次感染發(fā)生在嬰幼兒時期，作為探討MCPyV對呼吸道致病性的第一步，我們用基于TaqMan探針的實時熒光定量方法檢測了呼吸道感染住院兒童NPA中的MCPyV感染情況。住院患兒200份NPA的MCPyV檢測率為3％，與另外2項NPA中的檢測結(jié)果類似（3/140，2.1％[14]；27/635，4.25％[15]），但低于意大利研究者對下呼吸道感染住院病人的呼吸道樣本的檢出率（15/87，17.24％）[16]。本研究顯示MCPyV主要在3歲以內(nèi)的兒童中檢出，最常見的癥狀是咳嗽和發(fā)熱。6名MCPyV陽性患兒均與其他常見的呼吸道病毒共感染,A型流感病毒和RSV最常見。其中2名MCPyV感染兒童與另一種呼吸道感染較為常見的多瘤病毒W(wǎng)UPyV共感染。在本研究中，MCPyV的病毒載量較低，均低于10拷貝/μL，且均與其他呼吸道病毒共感染，還不能表明MCPyV的是住院兒童呼吸道感染的病因。雖然不能肯定MCPyV是通過呼吸道傳播，但間接表明呼吸道是其可能的傳播途徑。關(guān)于MCPyV可能的分泌和傳播途徑，最近的研究表明環(huán)境樣本（門把手、自動售票機(jī)）中75％能檢測到病毒DNA。用DNA酶處理后進(jìn)行病毒載量檢測，5％的MCPyV DNA被保護(hù)，可導(dǎo)致MCPyV潛在感染[17]。此外，TSPyV、HPyV6、HPyV7和MCPyV在健康人的皮膚上可被檢出，在采集呼吸道樣本時要防止樣本污染。

盡管MCPyV在NPA的檢出率較低為3％，但本研究表明了其有可能的傳播模式。核酸擴(kuò)增和檢測技術(shù)的快速發(fā)展導(dǎo)致了病毒發(fā)現(xiàn)的革命性改變，在過去的幾年中發(fā)現(xiàn)了多種新的多瘤病毒，這一趨勢在未來幾年內(nèi)是否會延續(xù)尚待分曉，這些新發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒對人的致病性也需要進(jìn)一步的研究。

表2 MCPyV陽性呼吸道感染兒童的臨床特點

表3 MCPyV與其他常見呼吸道病毒混合感染情況

[1] Peng J,Li K,Zhang C,et al.MW polyomavirus and STL polyomavirus present in tonsillar tissues from chil?dren with chronic tonsillar disease[J].Clin Microbiol Infect,2016,22（1）:97.e1-3.

[2] Dalianis T,Hirsch H H.Human polyomaviruses in dis?ease and cancer[J].Virology,2013,437（2）:63-72.

[3] Feng H,Shuda M,Chang Y,et al.Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma[J].Science,2008,319:1096-1100.

[4] Dang X,Bialasiewicz S,Nissen M D,et al.Infre?quent detection of KI,WU and MC polyomaviruses in immunosuppressed individuals with or without progres?sive multifocal leukoencephalopathy[J]. PLoS One,2011,6（3）:e16736.

[5] Loyo M,Guerrero-Preston R,Brait M,et al.Quantita?tive detection of Merkel cell virus in human tissues and possible mode of transmission[J].Int J Cancer,2010,126（12）:2991-2996.

[6] Schowalter R M,Pastrana D V,Pumphrey K A,et al.Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin[J].Cell Host Microbe,2010,7（6）:509-515.

[7] Wieland U,Mauch C,Kreuter A,et al.Merkel cell polyomavirus DNA in persons without merkel cell car?cinoma[J].Emerg Infect Dis,2009,15（9）:1496-1498.

[8] Zheng W Z,Wei T L,Ma F L,et al.Human poly?omavirus type six in respiratory samples from hospital?ized children with respiratory tract infections in Bei?jing,China[J].Virol J,2015,12（1）:166.

[9] van Ghelue M,Khan M T,Ehlers B,et al.Genome analysis ofthe new human polyomaviruses[J].Rev Med Virol,2012,22（6）:354-377.

[10]Babakir-Mina M,Ciccozzi M,Perno C F,et al.The novelKI,WU,MC polyomaviruses:possiblehuman pathogens[J]?New Microbiol,2011,34（1）:1-8.

[11]van der Meijden E,Janssens R W,Lauber C,et al.Discovery ofa new human polyomavirusassociated with trichodysplasia spinulosa in an immunocompro?mized patient[J].PLoS Pathog,2010,6（7）:e1001024.

[12]Pastrana D V,Tolstov Y L,Becker J C,et al.Quanti?tation of human seroresponsiveness to Merkel cell poly?omavirus[J].PLoS Pathog,2009,5（9）:e1000578.

[13]Vahabpour R,Aghasadeghi M R,Salehi-Vaziri M,et al.Prevalence of Merkel cell polyomavirus in Tehran:an age-specific serological study[J].Iran Red Crescent Med J,2016,18（5）:e26097.

[14]Kantola K,Sadeghi M,Lahtinen A,et al.Merkel cell polyomavirus DNA in tumor-free tonsillar tissues and upper respiratory tract samples:implications for respi?ratory transmission and latency[J].J Clin Virol,2009,45:292-295.

[15]Goh S,Lindau C,Tiveljung-Lindell A,et al.Merkel cell polyomavirus in respiratory tract secretions[J].Emerg Infect Dis,2009,15（3）:489-491.

[16]Babakir-Mina M,Ciccozzi M,Lo Presti A,et al.Iden?tification ofMerkelcellpolyomavirusin the lower tract of Italian patients[J].J Med Virol,2010,82（3）:505-509.

[17]Foulongne V,Courgnaud V,Champeau W,et al.De?tection of Merkel cell polyomavirus on environmental surfaces[J].J Med Virol,2011,83（8）:1435-1439.

Clinical Study and Detection of Merkel Cell Polyomavirus in Hospitalized Children with Respiratory Tract Infection

WEI Tian-Li1,ZHENG Wen-Zhi2,MA Fen-Lian2,YAO Li-Hong2,CHEN Ai-Jun2,CUI Hong1*,ZHENG Li-Shu2*
1.Department of Pediatrics,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050;2.National Institute for Viral Disease Control and Prevention,China CDC,Beijing 100052;China
*Co-corresponding authors,ZHENG Li-Shu,E-mail:zhenglishu2000@sina.com;CUI Hong,E-mail:cuihong100@sina.com

Objective:To investigate the prevalence and clinical features of Merkel cell polyomavirus（MCPyV）in hospitalized children with respiratory tract infection（RTI） in Beijing.Methods:A total of 200 nasopharyngeal aspirates（NPA） were collected from hospitalized children with RTI in Beijing Friendship Hospital.LTAg gene of MCPyV was detected with an established TaqMan real-time PCR and confirmed by sequencing.All the MCPyV-positive specimens were screened for other common respiratory viruses.Results:The prevalence of MCPyV was 3％（6/200）,the infected children ranged in age from 6 month to 5 years and children ≤3 years of age accounted for 83.3％（5/6） of cases.6 MCPyV-positive patients were diagnosed with bronchopneumonia and acute bronchitis.The most common symptoms were cough,fever and asthma.All 6 MCPyV-positive patients were coinfected with other respiratory viruses,of which influenza virus A and respiratory syncytial virus were most common.Additional?ly,their viral loads were lower than 10 copies/μL NPA specimen.Conclusion:The prevalence of MCPyV was 3％in NPA specimens from hospitalized children with RTI,measured by real-time PCR.Regarding the 100％coin?fection rate and the low viral load,MCPyV is not considered to be the cause of respiratory diseases.

Merkel cell polyomavirus（MCPyV）;TaqMan real-time PCR;respiratory infection

R373;Q78

A

1009-0002（2017）04-0510-05

2017-02-11

魏田力（1973- ），女，主治醫(yī)師，（E-mail）denysu2003@163.com

鄭麗舒，（E-mail）zhenglishu2000@sina.com；崔紅，（E-mail）cuihong100@sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.021