孔苗苗，戴長松，葛凡，張海霞，沈穎，戴華

揚州大學(xué) 江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗室，醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225001

神經(jīng)菌毛素1b結(jié)構(gòu)域的克隆及表達

孔苗苗，戴長松，葛凡，張海霞，沈穎，戴華

揚州大學(xué) 江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗室，醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225001

目的：制備重組人神經(jīng)菌毛素1（NRP1）b結(jié)構(gòu)域蛋白。方法：采用PCR技術(shù)，從pGEM-NRP1克隆載體中擴增人NRP1b結(jié)構(gòu)域（HuNRP1b）cDNA，并將其克隆入pColdTF，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pCold-HuNRP1b并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，制備重組大腸桿菌BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b），低溫條件下用IPTG誘導(dǎo)重組菌的表達，制備重組蛋白TF-HuNRP1b。結(jié)果：酶切、測序結(jié)果表明pCold-HuNRP1b構(gòu)建成功，經(jīng)SDS-PAGE分析，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌后重組蛋白TF-HuNRP1b獲得表達，融合蛋白相對分子質(zhì)量約90×103。結(jié)論：獲得原核表達的重組HuNRP1b蛋白，為該蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)及其單克隆抗體的制備提供了有效的生物材料。

神經(jīng)菌毛素1；cDNA；克??；重組蛋白

神經(jīng)菌毛素 1（neuropilin 1，NRP1）是一種多功能的非酪氨酸激酶受體，其最初作為軸突導(dǎo)向因子 3（semaphorin 3，Sema3）的受體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有調(diào)控神經(jīng)元細胞的導(dǎo)向以及軸突生長的功能[1]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，NRP1在血管內(nèi)皮細胞及多種腫瘤細胞表面高表達，是血管內(nèi)皮細胞生長因子 165（VEGF165）的共受體[2]。NRP1 的相對分子質(zhì)量為 130×103～140×103，由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)及較長的胞外區(qū)組成，其胞外區(qū)又分a1/a2、b1/b2、c等3個結(jié)構(gòu)域[3]。NRP1通過其胞外區(qū)b結(jié)構(gòu)域與VEGF165結(jié)合，顯著提高VEGF165與血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR2，KDR）的結(jié)合能力，促進血管發(fā)育生成[4-5]。阻斷VEGF165與NRP1的結(jié)合，不僅能直接抑制腫瘤細胞的遷移，抑制移植瘤的形成，而且還能抑制腫瘤局部血管生成，間接抑制腫瘤生長[6-7]。由于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的病理性促進作用，NRP1逐漸成為繼VEGFR后抗腫瘤治療的新靶標。我們采用基因工程技術(shù)克隆得到人NRP1b結(jié)構(gòu)域（HuNRP1b）cDNA，并對其進行表達、純化，以期獲得重組HuNRP1b蛋白，為研發(fā)抗HuNRP1抗體，進一步研究NRP1的功能提供有效的生物材料。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自Trans?Gen Biotech公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室制備、保存；克隆載體pGEM-NRP1（含HuNRP1全長cDNA）購自Sino Biological公司；質(zhì)粒pColdTF，限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶購自Fermentas公司；超濾離心管購自Millipore公司；Axygen小量提取質(zhì)粒試劑、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒均購自愛思進生物技術(shù)有限公司；其他國產(chǎn)分析純試劑均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 HuNRP1b編碼基因的克隆

根據(jù)GenBank公布的HuNRP1基因mRNA序列，采用Primer Premier 5.0軟件輔助設(shè)計上下游引物，以pGEM-NRP1為模板，擴增HuNRP1b區(qū)cDNA，同時引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點。

引物為 P1（5'-GGGCATATGAAATGTATGGA AGCTCTGGGCAT-3'，下劃線為NdeⅠ酶切位點）和 P2（5'-ATTCTCGAGACAGCCCAGCAGCTCCAT TCT-3'，下劃線為XhoⅠ酶切位點）。PCR擴增條件：94℃ 5min；94℃ 50s，65℃ 40s，72℃ 40s，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。將擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，切取目的條帶，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收，回收產(chǎn)物用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，并同時雙酶切載體pColdTF，37℃酶切過夜。次日，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，分別切取載體及目的片段條帶，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，-20℃保存。用T4DNA連接酶連接經(jīng)雙酶切的pColdTF載體、HuNRP1bcDNA片段，4℃連接過夜。次日，取5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化菌涂布含氨芐西林（Amp）的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。次日隨機挑選單菌落，37℃搖床220r/min振蕩培養(yǎng)8h，同上步驟進行菌液PCR，同時以HuNRP1全基因cDNA為陽性對照，篩選陽性克隆子。將菌液PCR產(chǎn)物條帶與陽性對照組條帶位置一致的細菌，用Axygen小量提取質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定。將雙酶切鑒定正確的菌株送上海生工生物工程有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pCold-HuNRP1b。

1.3 重組大腸桿菌 BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）的誘導(dǎo)表達及純化

1.3.1 重組大腸桿菌 BL21（DE3）（pCold-HuN?RP1b）的誘導(dǎo)表達 將重組質(zhì)粒pCold-HuNRP1b、空載體質(zhì)粒pColdTF分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，涂布含Amp的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單菌落，接種于5mL含Amp的LB培養(yǎng)基，37℃、220r/min振蕩過夜培養(yǎng)，將新鮮培養(yǎng)的重組菌按1∶50的比例接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)，待其D600nm達0.4左右，轉(zhuǎn)入16℃搖床培養(yǎng)0.5h，分別加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)，16℃連續(xù)培養(yǎng)24h，收取菌液。分別取1.0mL菌液，12 000r/min離心，PBS洗2次，用100μL PBS重懸，加入25μL 5×SDS 上樣緩沖液，煮沸 10min。12％SDS-PAGE，上樣量為 15μL，考馬斯亮藍染色0.5h后，脫色液脫色過夜，分析結(jié)果。

1.3.2 重組蛋白TF-HuNRP1b的可溶性表達分析取獲得的誘導(dǎo)表達菌 BL21（DE3）（pCold-HuN?RP1b）、BL21（DE3）（pColdTF）各 1mL，同上離心洗滌后，超聲波破碎細菌，離心收集細菌裂解上清及沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.3.3 重組蛋白TF-HuNRP1b的大量誘導(dǎo)表達、濃縮 如上條件大量制備BL21（DE3）（pCold-HuN?RP1b）表達菌2 L，PBS洗滌后，用30mL的PBS重懸菌體沉淀，超聲波破碎，同上離心，收集超聲波裂解上清，采用Ni金屬螯合層析柱（Bio-Scale Mini Profinity IMAC）純化重組蛋白。采用30 kDa的超濾離心管，4℃、5500r/min離心，截流蛋白溶液體積至2mL左右，濃縮、提高純化蛋白的濃度。繼續(xù)采用4℃超濾離心法，用PBS緩沖液交換濃縮蛋白溶液中含有的高濃度咪唑，使得目的蛋白溶解于PBS緩沖液中，超濾離心管中加入10mL PBS，混勻，4℃、5500r/min離心，截流至2mL左右，重復(fù)此步驟5次。收集超濾離心管中的溶液，檢測蛋白濃度，-70℃保存，用于后續(xù)免疫及檢測。

2 結(jié)果

2.1 HuNRP1b編碼基因cDNA的擴增及序列分析結(jié)果

以pGEM-NRP1為模板，擴增HuNRP1b基因cDNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后可見900bp左右的特異性條帶，與GenBank公布的HuNRP1b區(qū)編碼序列大小一致（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pCold-HuNRP1b的構(gòu)建

pColdTF、HuNRP1bcDNA片段經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切、切膠回收、連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，涂布Amp+平板。次日，從轉(zhuǎn)化的平板中隨機挑取5個單菌落進行菌液PCR，圖2第4、5、6泳道均出現(xiàn)900bp左右的條帶，其大小與預(yù)期相符。取菌液PCR鑒定正確的菌液，用Axygen小量提取質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，雙酶切后電泳鑒定重組質(zhì)粒，在約6kb及900bp位置出現(xiàn)2條清晰的條帶，大小分別與質(zhì)粒及目的片段大小一致（圖3），測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pCold-HuNRP1b構(gòu)建正確（序列略）。

圖1 HuNRP1b基因PCR擴增產(chǎn)物

2.3 重組大腸桿菌 BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）的誘導(dǎo)表達及重組蛋白TF-HuNRP1b的可溶性分析

將鑒定正確的pCold-HuNRP1b轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，重組菌 BL21（DE3）（pColdTMHuNRP1b）經(jīng) 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L IPTG 誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量90×103處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期目的蛋白一致，而且同樣誘導(dǎo)的空載體表達菌 BL21（DE3）（pColdTF）在這一位置未見條帶，僅在55×103處表達其標簽蛋白，表明融合蛋白TF-HuNRP1b得到成功表達，且重組菌在0.4mmol/L IPTG下誘導(dǎo)，目的蛋白獲得最佳表達（圖4）。將誘導(dǎo)表達后的重組菌BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）超聲波裂解、離心，分別取上清、沉淀進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明融合蛋白主要以可溶蛋白的形式表達（圖5）。

2.4 純化重組蛋白TF-HuNRP1b

圖2 菌液PCR分析重組菌

圖3 重組質(zhì)粒pCold-HuNRP1b的雙酶切鑒定

重組菌 BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）經(jīng) 0.4mmol/L IPTG大量誘導(dǎo)后，超聲波破碎，離心后收集上清進行Ni金屬螯合層析柱純化，純化蛋白經(jīng)截流、交換后經(jīng)SDS-PAGE分析，表明目的蛋白得到有效純化（圖6）。

3 討論

NRP1作為VEGF165的共受體，通過其b結(jié)構(gòu)域與VEGF165結(jié)合，可明顯增強VEGF165與VEGFR2的結(jié)合能力。阻斷由VEGF165介導(dǎo)的NRP1與VEGFR2的結(jié)合，能提供最高效的拮抗VEGF165-VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，NRP1可介導(dǎo)機體腫瘤細胞的免疫逃逸作用，其作用的發(fā)揮與b結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)，如Treg細胞表面的NRP1能夠作為Sema4A、TGF-β的受體，促進Treg細胞的存活和功能，介導(dǎo)Treg細胞以趨化VEGF165的形式富集到腫瘤部位，抑制機體抗腫瘤能力以及對抗腫瘤治療的效果。

大腸桿菌作為外源蛋白表達的宿主菌，具有遺傳背景清晰、培養(yǎng)條件簡單，生長速度快，表達產(chǎn)量高等優(yōu)點。但其表達的外源蛋白容易聚集而產(chǎn)生沒有活性的包涵體沉淀，包涵體需要經(jīng)過復(fù)雜的溶解、復(fù)性、純化才能獲得有活性的蛋白，使得包涵體復(fù)性工作量大而復(fù)性蛋白得率低。本研究中采用了冷休克蛋白表達載體pColdTF，構(gòu)建重組表達菌BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）后，經(jīng)低溫誘導(dǎo)，獲得可溶性表達的融合蛋白TFHuNRP1b，且該表達系統(tǒng)帶有組氨酸標簽，便于目的蛋白的純化。

綜上，本研究為大量制備重組HuNRP1b提供了可能，為制備針對這一結(jié)構(gòu)域的抗體及進一步研究HuNRP1蛋白的生物學(xué)功能提供了有效的生物材料。

圖4 SDS-PAGE分析TF-HuNRP1b的表達

圖5 SDS-PAGE分析重組蛋白TF-HuNRP1b的可溶性表達

圖6 SDS-PAGE分析純化的重組蛋白TF-HuNRP1b

[1] Tordjman R,Lepelletier Y,Lemarchandel V,et al.A neuronal receptor,neuropilin-1,is essential for the ini?tiation of the primary immune response[J].Nat Immu?nol,2002,3（5）:477-482.

[2] Neufeld G,Cohen T,Shraga N,et al.The neuropil?ins:multifunctionalsemaphorin and VEGF receptors that modulate axon guidance and angiogenesis[J].Trends Cardiovasc Med,2002,12（1）:13-19.

[3] Roth L,Nasarre C,Dirrig-Grosch S,et al.Transmem?brane domain interactions control biological functions of neuropilin-1[J].Mol Biol Cell,2008,19（2）:646-654.

[4] Pellet-Many C,Frankel P,Jia H,et al.Neuropilins:structure,function and role in disease[J].Biochem J,2008,411（2）:211-226.

[5] Carmeliet P.Blood vessels and nerves:common sig?nals,pathways and diseases[J].Nat Rev Genet,2003,4（9）:710-720.

[6] Starzec A,Vassy R,Martin A,et al.Antiangiogenic and antitumor activities of peptide inhibiting the vascu?lar endothelial growth factor binding to neuropilin-1[J].Life Sci,2006,79（25）:2370-2381.

[7] Soker S,Takashima S,Miao H Q,et al.Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an iso?form-specific receptor for vascular endothelial growth factor[J].Cell,1998,92（6）:735-745.

[8] Sarris M,Andersen K G,Randow F,et al.Neuropilin-1 expression on regulatory T cells enhances their in?teractions with dendritic cells during antigen recogni?tion[J].Immunity,2008,28（3）:402-413.

[9] Delgoffe G M,Woo S R,Turnis M E,et al.Stability and function of regulatory T cells is maintained by a neuropilin-1-semaphorin-4a axis[J].Nature,2013,501（7466）:252-256.

Cloning and Expression of Human Neuropilin 1b Domain

KONG Miao-Miao,DAI Chang-Song,GE Fan,ZHANG Hai-Xia,SHEN Ying,DAI Hua*
Jiangsu Key Laboratory of Experimental&Translational Non-Coding RNA Research,Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases,Medical School,Yang?zhou University,Yangzhou 225001,China
*Corresponding author,E-mail:daihua@yzu.edu.cn

Objective:To develop recombinant human neuropilin 1b domain（HuNRP1b）.Methods:cDNA of HuNRP1bwas amplified by PCR technique from pGEM-NRP1 cloning vector and then subcloned into plasmid pColdTF.After screening and sequencing,the constructed recombinant plasmid pCold-HuNRP1bwas transformed into competent cell E.coli BL21（DE3） and expressed by the induction of IPTG.Results:Enzyme digestion and DNA sequencing results showed that pCold-HuNRP1bwas successfully constructed.SDS-PAGE analysis showed that the expressed product was a fusion protein with a molecular weight of 90 kDa.Conclusion:Recombinant protein HuNRP1bwas successfully constructed,which has laid a foundation for the production of recombinant HuNRP1band development of monoclonal antibodies against HuNRP1b.

neuropilin 1;cDNA;cloning;recombinant protein

Q78

A

1009-0002（2017）04-0447-04

2017-01-17

國家自然科學(xué)基金（81472815）；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實踐訓(xùn)練計劃（201511117064Y）

孔苗苗（1995-），女，本科生；戴長松（1989-），男，碩士；二者為共同第一作者

戴華，（E-mail）daihua@yzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.008