朱根應　　程瑞動　　周亮　　李厥寶　　葉祥明

[摘要] 目的 通過觀察SD大鼠脊髓損傷后血糖的變化及其外周組織炎癥反應狀態(tài)，探討脊髓損傷并發(fā)2型糖尿病的可能機制。 方法 將24只SD大鼠隨機分為兩組：假模組和脊髓損傷組，其中假模組又分為假模普通飼料組（Sham+LFD）和假模三高飼料組（Sham+HFD）兩個亞組，脊髓損傷組分為脊髓損傷普通飼料組（SCI+LFD）和脊髓損傷三高飼料組（SCI+HFD）兩個亞組。以改良的Allens撞擊法制作脊髓損傷動物模型，在實驗開始前及8周時監(jiān)測各組體重、血糖、葡萄糖耐量試驗指標。于8周時取大鼠肝臟、脾臟及內臟脂肪組織，應用實時熒光定量PCR方法觀察各組織胰島素、TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10等炎癥因子的表達情況。 結果 各組大鼠體重均有明顯增長。脊髓損傷后大鼠血糖較損傷前明顯升高，外周組織 TNF-α、IL-1β、IL-6表達較假模組明顯升高，IL-10則較假模組明顯下降。相比Sham+LFD組，Sham+HFD組、SCI+LFD組以及SCI+HFD組大鼠組織中胰島素、TNF-α、IL-1β含量顯著增加，IL-10顯著減少；相比Sham+HFD組，SCI+HFD組大鼠組織中胰島素、TNF-α、IL-1β含量進一步增加，IL-10則進一步減少。 結論 脊髓損傷后外周炎癥反應在脊髓損傷后并發(fā)2型糖尿病中有重要作用。

[關鍵詞] SD大鼠；脊髓損傷；2型糖尿??；炎癥反應

[中圖分類號] R589 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）27-0038-04

Study on the effect of inflammatory reactions of peripheral tissues after spinal cord injury on concurrent type 2 diabetes mellitus

ZHU Genying CHENG Ruidong ZHOU Liang LI Juebao YE Xiangming

Department of Rehabilitative Medicine， Zhejiang Provincial Peoples Hospital， the Peoples Hospital Affiliated to Hangzhou Medical College， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To investigate the possible mechanism of spinal cord injury complicated with type 2 diabetes mellitus by observing the changes of blood glucose and the inflammatory response of peripheral tissue in SD rats after spinal cord injury. Methods A total of 24 SD rats were randomly divided into two groups： sham model group and spinal cord injury group. The sham model group was further divided into two subgroups： Sham+LFD group and Sham+HFD group. Spinal cord injury group was further divided into two groups： SCI+LFD group and SCI+HFD group. The animal model for spinal cord injury was made by modified Allen's impact method. Body weight， blood glucose and glucose tolerance indices were measured before experiment and 8 weeks after the experiment. At 8 weeks， the rat liver， spleen and visceral adipose tissues were collected. The expression of insulin and inflammatory factors such as TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-10 were observed by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The body weight in each group was increased significantly. Blood glucose in rats after spinal cord injury was significantly higher than that before injury. The expression of TNF-α， IL-1β and IL-6 in peripheral tissues was significantly higher than that in the sham model group， and IL-10 was significantly lower than that in the sham model group. Compared with the Sham+LFD group， the levels of insulin， TNF-α and IL-1β in Sham+HFD group， SCI+LFD group， and SCI+HFD group were significantly increased， and IL-10 was significantly decreased. Compared with Sham+HFD group， the levels of insulin， TNF-α and IL-1β in SCI+HFD group were increased further， and IL-10 was further decreased. Conclusion Peripheral inflammatory response after spinal cord injury plays an important role in the treatment of concurrrent type 2 diabetes mellitus after spinal cord injury.endprint

[Key words] SD rats； Spinal cord injury； Type 2 diabetes mellitus； Inflammatory response

臨床中脊髓損傷患者胰島素抵抗、糖耐量異常發(fā)生率明顯增高，近年有研究表明[1，2]，脊髓損傷與2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）發(fā)生幾率顯著增加相關，而在進一步校正其他相關危險因素后，該相關性仍然存在，表明脊髓損傷是2型糖尿病發(fā)生的獨立危險因素。2型糖尿病系外周細胞對胰島素敏感性降低，血糖升高，體內胰島素代償性增加，導致糖代謝紊亂[3，4]。研究證實機體的慢性炎癥狀態(tài)是導致脂肪、肌肉及肝臟等胰島素抵抗的主要原因[5]，外周慢性炎癥在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。脊髓損傷后機體相對會產生異常應激反應導致免疫系統(tǒng)紊亂，過度活化的免疫細胞分泌多種炎性介質，IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子通過干擾胰島素信號傳遞，在胰島素抵抗的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[7，8]。臨床證實，給予糖尿病患者胰島素增敏劑治療，可明顯改善其慢性炎癥水平，提示胰島素抵抗與慢性炎癥緊密關聯[9]。脊髓損傷后腦與脊髓之間的生理性聯系和解剖連續(xù)性被破壞，反饋機制中斷或受損，使脊髓損傷后外周長期處于異常應激狀態(tài)，但相關研究目前尚無明確報道。本研究擬通過觀察SD大鼠脊髓損傷后外周組織炎癥反應狀態(tài)及其對胰島素敏感性的影響，探討脊髓損傷并發(fā)2型糖尿病的可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物及分組：選取24只健康SD大鼠（8周齡，雄性大鼠，體重150～180 g，普通級）為研究對象，經適應性飼養(yǎng)3 d后隨機分為假模對照組：假模普通飼料組（Sham+LFD）、假模三高飼料組（Sham+HFD），脊髓損傷組：脊髓損傷普通飼料組（SCI+LFD）、脊髓損傷三高飼料組（SCI+HFD），每組6只。普通飼料組進食國家標準固體混合飼料，三高飼料組進食配方三高飼料，誘發(fā)胰島素抵抗及糖尿病，每日自由飲水。各組在實驗前（0周）及實驗8周后進行體重測量。脊髓損傷組行改良Allens法造成脊髓不完全性損傷，具體方法如下所述，假模組行相同手術操作但不進行脊髓打擊損傷。

1.2 模型制備

采用改良的Allens撞擊法制作SCI動物模型[10]。實驗動物經5%水合氯醛（300 mg/kg體重）腹腔注射麻醉后，背部剃毛，常規(guī)消毒，定位棘突后以T10為中心作長約3 cm皮膚切口，鈍性剝離脊旁肌肉暴露脊椎后，微型咬骨鉗咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，暴露脊髓，以上操作過程中特別注意使硬脊膜完整。使用MASCIS Impactor（W.M. Keck Center of Rutgers University，USA）精確撞擊（10 g，11.5 cm），制作脊髓不完全損傷模型，模型成功標志：可見大鼠尾巴痙攣性擺動，雙下肢軀體回縮樣撲動，脊髓打擊部位淤血，雙下肢弛緩性癱瘓。假模組同樣進行上述操作，咬除椎板并暴露脊髓，但不進行重物撞擊。所有實驗大鼠術畢均逐層縫合切口，并消毒表面。術后注意保溫，單籠飼養(yǎng)，仔細護理。

1.3 血糖指標監(jiān)測

各組動物禁食8 h，尾部取血，采用便攜式血糖檢測儀（美國強生公司）檢測空腹血糖，再以2 g/kg體重腹腔注射葡萄糖，分別于注射后15、30、45、120、180 min尾部采血，測定血糖濃度。在8周后重復進行上述檢測。

1.4 標本取材

實驗8周時，在禁食8 h后，斷頭處死迅速取腦，盡快分離出下丘腦后浸入液氮中急凍，同時取肝臟、脾臟、睪周脂肪（內臟脂肪），分裝做好標記后置于-80℃的超低溫冰箱中保存，用于免疫熒光檢測。

1.5 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR測定所取各組大鼠肝臟、脾臟、睪周脂肪組織胰島素、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-6表達：取組織粉碎（脂肪組織按5 mL/1 g比例于含1 mg/mL膠原酶的緩沖液中消化45 min），加入裂解液勻漿，低溫離心，抽提總蛋白在SDS2聚丙烯酰胺凝膠上電泳，30 mA恒流條件下，4℃過夜，將蛋白電轉移到硝酸纖維素膜，封閉后，加入一抗（美國Abcam公司）后4℃孵育過夜。TBST洗膜后加二抗羊抗IgG（北京中山生物技術有限公司），常溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL化學發(fā)光試劑（美國Pierce公司）檢測陽性信號，采用ScionImage軟件計算條帶的相對光密度值。實驗重復3次。相對光密度值=實驗組或對照組光密度值/β-actin光密度值。

1.6 統(tǒng)計學方法

所得數據采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，組內不同時間比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析Oneway Annova，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體重變化

干預前（0周）及干預8周后在同等條件下進行體重測量，Sham+LFD組及Sham+HFD組大鼠體重較干預前均有明顯增加，三高飼料組增加幅度更高；類似的情況在脊髓損傷組大鼠中同樣可以看到，表明三高飼料及脊髓損傷對體重的增加均有明顯影響。見表1。

2.2 各組大鼠血糖指標比較

Sham+HFD組、SCI+LFD組及SCI+HFD組8周時的血糖水平較0周時均明顯增加，結果有統(tǒng)計學差異，Sham+LFD組8周時的血糖水平與0周相比，無統(tǒng)計學差異。推測三高飼料及脊髓損傷后均易出現血糖增高。見表2。

2.3各組大鼠組織中胰島素及IL-10、TNF-α、IL-1β及IL-6的含量比較

相比Sham+LFD組，LFD飼料飼養(yǎng)的SCI+LFD組、HFD飼料飼養(yǎng)的Sham+HFD組以及SCI+HFD組大鼠組織中胰島素、TNF-α、IL-1β含量顯著增加，IL-10顯著減少；相比Sham+HFD組，HFD飼料飼養(yǎng)的SCI+HFD組大鼠組織中胰島素、TNF-α、IL-1β含量亦有明顯增加，IL-10則顯著減少，結果均有統(tǒng)計學差異。以上結果表明，HFD飼養(yǎng)條件下，脊髓損傷對大鼠組織中胰島素、IL-10、TNF-α、IL-1β及IL-6含量有著重要的影響。大鼠組織中胰島素、IL-10、TNF-α、IL-1β及IL-6含量的ELISA檢測結果見表3。endprint

3 討論

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是由各種原因引起的脊髓結構、功能的損害，造成損傷水平以下不同程度的運動、感覺和自主神經功能障礙。脊髓損傷的治療與康復是現代醫(yī)學界的一大難題，脊髓損傷后并發(fā)癥的多發(fā)性也嚴重影響著患者的生活質量，其對代謝的影響近年來也越來越引起重視[1]。許多研究表明，脊髓損傷與2型糖尿病之間存在著密切的關系[1，2]。有文獻報道脊髓損傷后發(fā)生2型糖尿病的幾率從10%～22%不等[11-13]。

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）系外周細胞對胰島素敏感性降低，血糖升高，體內胰島素代償性增加，導致糖代謝紊亂。以往研究一般認為脊髓損傷患者血糖濃度常升高是應激反應所引起[14]，臨床上證實，給予糖尿病患者胰島素增敏劑治療，可明顯改善患者的慢性炎癥水平，提示胰島素抵抗與慢性炎癥緊密相關。近年研究表明，胰島素抵抗與慢性炎癥交互作用，促進2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[15]。慢性炎癥導致胰島素抵抗的機制主要是多種促炎細胞因子通過刺激炎癥信號通路干擾胰島素的信號傳遞過程所致，胰島素抵抗又可加重慢性炎癥。在2型糖尿病時脂肪細胞會分泌一系列的炎癥因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6等，會導致巨噬細胞向脂肪組織遷移、浸潤，產生更多的炎癥因子，而炎癥因子會導致胰島素敏感細胞內胰島素信號轉導受阻，從而造成胰島素抵抗[16，17]。肝臟的胰島素抵抗表現為血胰島素水平的升高，升高的胰島素不能有效地抑制肝糖的異生和餐后糖原的儲存減少，導致空腹和餐后血糖水平的升高。

以往研究多集中于糖尿病危險因素與胰島素抵抗之間的關系[18]，以及β細胞上胰島素信號通路的缺陷與β細胞凋亡的增加和糖尿病發(fā)生之間的關系[19，20]。近年來，氧化應激在糖尿病發(fā)生和發(fā)展中的作用逐漸引起人們的重視。有研究發(fā)現，長期的血糖控制不佳導致機體氧化應激損傷是糖尿病并發(fā)癥的共同機制，而氧化應激狀態(tài)可促進炎癥反應，炎癥反應反過來又可加重氧化應激狀態(tài)，因此，改善氧化應激狀態(tài)并抑制炎性因子可有效防治糖尿病并發(fā)癥[21]。

本研究通過對脊髓損傷大鼠的炎性因子的檢測，并與假模組進行比較，表明脊髓損傷后大鼠無論是正常飲食組還是高脂飲食組，其外周組織中胰島素、TNF-α、IL-1β及IL-6含量均較假模組顯著增加，而IL-10則顯著降低。而且高脂飲食組的變化較正常飲食組變化更為明顯。提示脊髓損傷后大鼠體內會產生明顯的外周炎性反應，生成更多的炎癥因子，這些炎癥因子可能會導致細胞內胰島素信號轉導受阻，從而造成胰島素抵抗，更進一步則會發(fā)展為2型糖尿病，部分揭示了脊髓損傷后2型糖尿病發(fā)生幾率上升的可能機制。這就為臨床上脊髓損傷后并發(fā)糖尿病進行干預提供了思路，即如何減輕機體的外周炎性反應，減少生成炎癥因子，從而降低脊髓損傷后發(fā)生2型糖尿病的幾率。

[參考文獻]

[1] Cragg JJ，Noonan VK，Dvorak M，et al. Spinal cord injury and type 2 diabetes：Results from a population health survey[J]. Neurology，2013，81（21）：1864-1868.

[2] Lai YJ，Lin CL，Chang YJ，et al. Spinal cord injury increases the risk of type 2 diabetes：A population-based cohort study[J]. Spine J，2014，14（9）：1957-1964.

[3] Hevener AL，Febbraio MA，Stock Conference Working Group. The 2009 stock conference report：inflammation，obesity and metabolic disease[J]. Obes Rev，2010，11（9）：635-644.

[4] Paniagua JA. Nutrition，insulin resistance and dysfunc-tional adipose tissue determine the different components of metabolic syndrome[J]. World J Diabetes，2016，7（19）：483-514.

[5] Wu Wei，Shi Fubiao，Liu Dianxin，et al.Enhancing natr-iuretic peptide signaling in adipose tissue，but not in muscle，protects against diet-induced obesity and insulin resistance[J]. Sci Signal，2017，10（489）：1-11.

[6] Esser N，Legrand-Poels S，Piette J. Inflammation as a link between obesity，metabolic syndrome and type 2 diabetes[J]. Diabetes Res Clin Pract，2014，105（2）：141-150.

[7] Yang T，Wu L，Wang H，et al. Inflammation Level after Decompression Surgery for a Rat Model of Chronic Severe Spinal Cord Compression and Effects on Ischemia-Reperfusion Injury[J]. Neurol Med Chir，2015，55（7）：578-586.endprint

[8] Yuan B，Liu D，Liu X1. Spinal cord stimulation exerts analgesia effects in chronic constriction injury rats via suppression of the TLR4/NF-κB pathway[J]. Neurosci Lett，2014，581（3）：63-68.

[9] 黃宇清，劉蓉. 胰島素增敏劑對2型糖尿病患者一相分泌的影響[J]. 中國老年學雜志，2012，32（15）：3357-3359.

[10] Allen AR. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column：A preliminary report[J]. JAMA，1911，57（10）：878-880.

[11] Bauman WA，Adkins RH，Spungen AM，et al.Is immo-bilization associated with an abnormal lipoprotein profile？ Observations from a diverse cohort[J]. Spinal Cord，1999，37（7）：485-493.

[12] Lavela SL，Weaver FM，Goldstein B，et al.Diabetes mellitus in individuals with spinal cord injury or disorder[J]. J Spinal Cord Med，2006，29（4）：387-395.

[13] Javadi M，Hafezi-Nejad N，Vaccaro AR，et al. Medical complications and patient outcomes in Iranian veterans with spinal cord injury[J]. Adv Clin Exp Med，2014，23（2）：269-275.

[14] Ambrozaitis KV，Kontautas E，Spakauskas B，et al. Patho-physiology of acute spinal cord injury[J]. Medicina（Kau-nas），2006，42（3）：255-261.

[15] Baker RG，Hayden MS，Ghosh S，et al. NF-κB，inflam-mation，and metabolic disease[J]. Cell Metab，2011，13（1）：11-22.

[16] Pedersen BK. IL-6 signaling in exercise and disease[J].Bio chem Soc-Trans，2007，35（5）：1295-1297.

[17] Shah A，Mehta N，Reilly MP. Adipose inflammation，insulin resistance，and cardiovascular disease[J]. J Paren-ter Enteral Nutr，2008，32（6）：638-644.

[18] 王淼，趙東，王薇，等. 北京地區(qū)1359名非糖尿病人群心血管危險因素與胰島素抵抗的關系研究[J]. 中華流行病學雜志，2010，31（4）：366-369.

[19] 劉瑞，胡仁明，王慶華. β細胞的胰島素抵抗促進糖尿病的發(fā)生[J]. 中國糖尿病雜志，2010，18（8）：634-636.

[20] De Koning EJP，Bonner-Weir S，Rabelink TJ.Preservation of beta-cell function by targeting beta-cell mass[J].Trends in Pharmacological Sciences，2008，29（4）：218-227.

[21] Shay KP，Moreau RF，Smith EJ，et al. Alpha-lipoic acid as a dietary supplement： Molecular mechanisms and therapeutic potential[J]. Biochim Biophys Acta，2009， 1790（10）：1149-1160.

（收稿日期：2017-07-11）endprint