歐單鳳, 陳春霞, 馬曉冬, 田雪梅*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州 510631； 2. 華南師范大學(xué)腦科學(xué)與康復(fù)醫(yī)學(xué)研究院， 廣州 510631)

白藜蘆醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡中線(xiàn)粒體差異蛋白鑒定

歐單鳳1, 陳春霞1, 馬曉冬2, 田雪梅1*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州 510631； 2. 華南師范大學(xué)腦科學(xué)與康復(fù)醫(yī)學(xué)研究院， 廣州 510631)

文中分離提取白藜蘆醇處理的HepG2細(xì)胞線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)，以未處理HepG2細(xì)胞為對(duì)照，利用雙向電泳技術(shù)分離差異蛋白，飛行時(shí)間質(zhì)譜分析鑒定差異蛋白點(diǎn). 初步分析鑒定了4個(gè)顯著性差異蛋白，其中驅(qū)動(dòng)蛋白和著絲粒相關(guān)蛋白CENP-E在白藜蘆醇處理的HepG2細(xì)胞中表達(dá)降低，證明白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞周期有調(diào)節(jié)作用；線(xiàn)粒體加工肽酶表達(dá)降低，線(xiàn)粒體核糖體蛋白L7/L12表達(dá)升高，說(shuō)明白藜蘆醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡與其影響線(xiàn)粒體功能有關(guān).

白藜蘆醇； HepG2細(xì)胞； 線(xiàn)粒體； 蛋白質(zhì)組

Keywords： Resveratrol； HepG2 cell； Mitochondria; proteomics

二苯乙烯類(lèi)物質(zhì)是植物對(duì)抗真菌感染和紫外輻射等逆境生長(zhǎng)條件所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，白藜蘆醇(Resveratrol)即屬于此類(lèi)物質(zhì). 白藜蘆醇廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等多種食用和藥用植物中，具有抗氧化、抗炎、抗癌等功效，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是白藜蘆醇抗癌的重要機(jī)制之一[1-3].

線(xiàn)粒體與細(xì)胞的能量代謝和多種功能有關(guān)，線(xiàn)粒體功能異常將會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，繼而引起基因表達(dá)的改變[4]. 線(xiàn)粒體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞凋亡的一條重要通路[5]. 作者前期的研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能影響線(xiàn)粒體內(nèi)膜通道的開(kāi)放狀態(tài)[6]. 近期研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620中線(xiàn)粒體電子傳遞鏈超載，導(dǎo)致反應(yīng)性氧化物(Reactive Oxygen Species，ROS)生成增多，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]. 白藜蘆醇誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡也與線(xiàn)粒體功能失調(diào)有關(guān)[8]. 因此，白藜蘆醇的抗癌作用可能與影響腫瘤細(xì)胞的代謝有關(guān)，通過(guò)影響線(xiàn)粒體的功能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是白藜蘆醇抗癌作用的一種機(jī)理.

本研究分離提取人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)，采用雙向電泳分離線(xiàn)粒體總蛋白，飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行肽指紋圖譜分析鑒定差異蛋白質(zhì)，分析白藜蘆醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中的線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)的變化，以期發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)白藜蘆醇誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中線(xiàn)粒體的潛在作用靶點(diǎn).

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

白藜蘆醇、二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)購(gòu)自Sigma公司；線(xiàn)粒體提取試劑盒購(gòu)自Pierce公司；IPG干膠條(3～10NL，17 cm)、IEF Buffer(pH3～10)等雙向電泳試劑購(gòu)自Bio-Rad公司； DMEM培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純. 酶標(biāo)儀(Bio-Rad iMark)，等電聚焦儀(Bio-Rad Protean IEF Cell)和垂直電泳儀(Bio-Rad，ProteanⅡ )，質(zhì)譜儀(ABI 4700 TOF-TOF)， Dounce勻漿器購(gòu)自上海仕博生物技術(shù)有限公司.

1.2 材料

人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所. 以含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃ . 因線(xiàn)粒體功能異常發(fā)生在細(xì)胞凋亡過(guò)程的較早期，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[5]，100 μmol/L白藜蘆醇處理24 h是分離線(xiàn)粒體的最佳時(shí)間. 因此白藜蘆醇處理組為含100 μmol/L白藜蘆醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液中DMSO的最終體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)0.2%；對(duì)照組為含體積分?jǐn)?shù)0.2% DMSO的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h.

1.3 線(xiàn)粒體分離

按Pierce線(xiàn)粒體提取試劑盒操作，具體步驟如下：分別收集白藜蘆醇處理組和對(duì)照組細(xì)胞；冰預(yù)冷PBS(pH 7.4)洗2次， 10倍體積的線(xiàn)粒體分離緩沖液(20 mmol/L HEPES-KOH，pH7.5，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，0.25 mol/L 蔗糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% 蛋白酶抑制劑)懸浮細(xì)胞，冰上放置10 min；細(xì)胞懸液冰浴勻漿，相差顯微鏡下觀察破碎細(xì)胞達(dá)到75% 以上，于4 ℃、1 000 g離心10 min，取上清液于4℃、1 200 g離心10 min，收集上清，于4 ℃、12 500 g離心20 min，收集沉淀加懸浮緩沖液(10 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.4，0.25 mol/L 蔗糖，1.0 mmol/L MgCl2)離心洗滌2次，即為富含線(xiàn)粒體的粗提物.

1.4 線(xiàn)粒體形態(tài)觀察

取少量線(xiàn)粒體粗提物進(jìn)行詹姆斯綠B(Jenu’s Green B)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察；取適量線(xiàn)粒體粗提物按常規(guī)方法制備電鏡切片，透射電子顯微鏡觀察線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu).

1.5 線(xiàn)粒體純化與蛋白質(zhì)提取

在15 mL離心管中先加入5 mL 1.5 mol/L的蔗糖溶液(含10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.5)，然后在液面上輕輕加一層5 mL 1.0 mol/L的蔗糖溶液(含10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.5)，形成10 mL的蔗糖濃度梯度溶液. 將線(xiàn)粒體粗提物以1.5 mL懸浮緩沖液懸浮，輕輕加于蔗糖濃度梯度溶液液面上，4 ℃、60 000 g離心30 min，線(xiàn)粒體在1.0 mol/L和1.5 mol/L蔗糖梯度交界處形成薄層，吸出交界處線(xiàn)粒體薄層，用懸浮緩沖液懸浮，4 ℃、20 000 g離心20 min,沉淀線(xiàn)粒體. 線(xiàn)粒體沉淀于細(xì)胞裂解液中裂解，獲得線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)溶液，用蛋白測(cè)定試劑盒(2D Qant kit)測(cè)定總蛋白含量，80 ℃保存待用.

1.6 雙向電泳分離差異蛋白

雙向電泳方法主要參考文獻(xiàn)[9]和Bio-Rad儀器操作手冊(cè)進(jìn)行.

制樣：分別取一定量的線(xiàn)粒體粗提物和純化的線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)樣品，加入已預(yù)先加有DTT和IPG緩沖液的Eppendorf管中,再加入相應(yīng)容積的沖泡脹液，混合好的樣品離心除去氣泡，為雙向電泳樣品. 用微量移液器沿水化盤(pán)槽的邊緣從左向右線(xiàn)性加入樣品；去除IPG膠條上的保護(hù)層，將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤(pán)中樣品溶液上30～45 min，至大部分吸收樣品被膠條吸收，然后沿著膠條緩慢加入礦物油，于等電聚焦儀-20 ℃水化11～15 h.

等電聚焦：將紙電極置于聚焦盤(pán)的正負(fù)極上，加5 μL超純水潤(rùn)濕；水化好的膠條瀝干礦物油，膠面朝下置于潤(rùn)濕好的濾紙片上雜交，去除表面上的不溶物，面朝下置于聚焦盤(pán)中，確保膠條與電極緊密接觸，在每根膠條上覆蓋2～3 mL礦物油；設(shè)置等電聚焦程序，進(jìn)行等電聚焦.

平衡膠條：將膠條轉(zhuǎn)移至樣品水化盤(pán)中，加入6 mL平衡緩沖液I，在水平搖床上緩慢搖晃15 min，取出膠條，在濾紙上瀝去多余的液體，放入平衡緩沖液II中，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15 min，取出膠條，用濾紙吸去多余的平衡液.

SDS-PAGE電泳：分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，平衡后膠條在1倍電泳緩沖液中漂洗數(shù)次，膠面朝上，用塑料板將膠條輕輕地推入2塊玻璃板間,與分離膠膠面緊密接觸，以適量的瓊脂糖凝膠封口.

染色：硝酸銀和考馬斯亮藍(lán)染色.

分析：Umax PowerLook1100光密度儀獲取染色后的雙向電泳凝膠圖像，UV波長(zhǎng)為355 nm，重復(fù)速率為200 Hz，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500 Da. 掃描質(zhì)量范圍為700～3 200 Da，凝膠圖像經(jīng)Imagemaster 2D platinum 5.0分析軟件(Amersham Biosciences)分析，確定差異位點(diǎn).

1.7 質(zhì)譜鑒定差異蛋白

切取考馬斯亮藍(lán)染色凝膠上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，置于1.5 mL EP管. 1 mL純水清洗蛋白質(zhì)點(diǎn)3次，每次10 min. 加入脫色液(250 mL乙醇，80 mL冰醋酸，加水至1 000 mL)50 μL浸泡膠片，脫色2 min. 水洗2次，至蛋白質(zhì)點(diǎn)無(wú)色透明后，用體積分?jǐn)?shù)50%的冰醋酸50 μL脫水15 min，50 μL 200 mmol/L 乙醇吸脹5 min，50 μL冰醋酸脫水15 min，真空冷凍干燥1 h，并進(jìn)行蛋白還原與烷基化，膠內(nèi)酶內(nèi)切，提取多肽片段混合物點(diǎn)樣，用基質(zhì)輔助激光解吸P電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI2TOF MS)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜的分析，分析結(jié)果利用軟件Mascot distiller進(jìn)行識(shí)別. 通過(guò)Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.matrixscience.com)，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，并通過(guò)檢索不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定與功能預(yù)測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)的雙向電泳分析

分離后線(xiàn)粒體經(jīng)透射電鏡觀察和Jenus Green B染色檢測(cè)，完整性較好，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，線(xiàn)粒體粗提物蛋白的雙向電泳結(jié)果顯示，大約有1 100±50個(gè)蛋白斑點(diǎn)被檢出(圖1A)；純化后的線(xiàn)粒體大約有450±50個(gè)蛋白斑點(diǎn)可被檢出(圖1B). 用白藜蘆醇處理細(xì)胞的過(guò)程中線(xiàn)粒體會(huì)受到不同程度的破壞，采用密度梯度純化的方法純化線(xiàn)粒體粗體物會(huì)導(dǎo)致處理后線(xiàn)粒體丟失，減少差異蛋白，影響蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用線(xiàn)粒體粗提物進(jìn)行雙向電泳.

圖1 線(xiàn)粒體總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖

2.2 蛋白質(zhì)組的雙向電泳分析

銀染的靈敏度高，檢測(cè)的蛋白點(diǎn)多(圖2A、B)，但由于分析型雙向電泳上樣量少，并且硝酸銀染色后蛋白點(diǎn)在質(zhì)譜鑒定過(guò)程中，出峰率低， 因此選用考馬斯亮蘭染色(圖2C、D). 結(jié)果顯示，處理組和對(duì)照組細(xì)胞的線(xiàn)粒體中大約有860±60個(gè)蛋白點(diǎn)可被檢測(cè)，初步鑒定出4個(gè)差異點(diǎn)(圖3)，蛋白的表達(dá)體積差異(Vol%)均在150%以上. A、C和D蛋白在白藜蘆醇處理組表達(dá)下調(diào)，而B(niǎo)蛋白在白藜蘆醇處理組表達(dá)上調(diào).

圖2 HepG2細(xì)胞線(xiàn)粒體總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖

圖3 不同蛋白的差異表達(dá)

2.3 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定(表1)，4個(gè)差異蛋白分別是：驅(qū)動(dòng)蛋白(蛋白點(diǎn)A)、線(xiàn)粒體核糖體蛋白L7/L12(蛋白點(diǎn)B)、著絲粒相關(guān)蛋白CENP-E(蛋白點(diǎn)C)、線(xiàn)粒體加工肽酶(蛋白點(diǎn)D).

表1 差異蛋白鑒定結(jié)果和功能Table 1 Identification and function of the differentially expressed proteins

3 討論

線(xiàn)粒體是細(xì)胞能量代謝、生物合成和細(xì)胞死亡的調(diào)控中心，其功能異常會(huì)導(dǎo)致腫瘤、代謝性疾病、神經(jīng)退行性病變等許多疾病的發(fā)生[10-12]. 線(xiàn)粒體蛋白表達(dá)異常是線(xiàn)粒體功能異常的重要原因，通過(guò)線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)組學(xué)可系統(tǒng)研究正常和病變組織中線(xiàn)粒體蛋白表達(dá)的差異，從而揭示研究線(xiàn)粒體相關(guān)疾病的分子機(jī)制以及藥物的作用的可能途徑[13].

分離提取線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)是進(jìn)行線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟，由于藥物作用會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體不同程度的損傷，經(jīng)過(guò)比較線(xiàn)粒體粗提物和純化的線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)雙向電泳的結(jié)果，選擇利用線(xiàn)粒體粗提物進(jìn)行線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)組的差異分析. 白藜蘆醇處理后4種蛋白質(zhì)表達(dá)明顯發(fā)生差異，其中驅(qū)動(dòng)蛋白和著絲粒相關(guān)蛋白CENP-E 2種著絲粒蛋白是參與細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)，其表達(dá)下降說(shuō)明白藜蘆醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡可能與2種著絲粒蛋白的表達(dá)抑制有關(guān)，與白藜蘆醇影響細(xì)胞周期的功能相一致[1-2]. 線(xiàn)粒體中的蛋白質(zhì)大部分來(lái)自于細(xì)胞核DNA編碼的蛋白，驅(qū)動(dòng)蛋白和絲粒相關(guān)蛋白即屬于核編碼的蛋白，它們是否與線(xiàn)粒體的功能也有關(guān)還需進(jìn)一步研究.線(xiàn)粒體加工肽酶的表達(dá)變化說(shuō)明白藜蘆醇影響線(xiàn)粒體的功能活動(dòng).

核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分,在核糖體組裝和蛋白質(zhì)合成中起重要作用，近年來(lái)研究[14]發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白還具有廣泛的核糖體外功能,在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡以及一些病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用. 線(xiàn)粒體核糖體蛋白作為線(xiàn)粒體核糖體的組成部分，其發(fā)生缺失或突變也會(huì)影響線(xiàn)粒體蛋白的合成而可能導(dǎo)致線(xiàn)粒體疾病[15]. 本研究中發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體核糖體蛋白的表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明白藜蘆醇誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中線(xiàn)粒體核糖體蛋白可能為其作用靶點(diǎn)，影響線(xiàn)粒體功能，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡，其機(jī)制尚有待深入研究.

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Analysis of Mitochondrial Proteome in Apoptosis of HepG2 Cells Induced by Resveratrol

OU Shanfeng1， CHEN Chunxia1, MA Xiaodong2, TIAN Xuemei1*

(1.School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 2. Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The effects of resveratrol on HepG2 cells apoptosis were investigated. Mitochondrial proteins were extracted from control and resveratrol treated cells and separated by two-dimensional electrophoresis. The peptide mass finger-printing was analyzed by time-of flight mass spectrometer. Four significantly differentiated proteins were identified. Kinesin protein and centromere-associated protein E (CENP-E) were down-regulated in HepG2 cells treated with resveratrol, which testified function of resveratrol on cell cycle regulation. Down-regulation of mitochondrial processing peptidase and up-regulation of mitochondrial ribosomal protein L7/L12 in HepG2 cells treated with resveratrol suggested the relationship between apoptosis induced by resveratrol and mitochondrial dysfunction in HepG2 cells.

2016-12-14 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30300455)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020212504)

*通訊作者:田雪梅，教授，Email:xmtian69@163.com.

R329.2

A

1000-5463(2017)05-0059-04

【中文責(zé)編：成文 編輯助理：冷佳奕 英文審校：李海航】