江雪 韓曉鳳 錢思宇 史丙俊 刁慶春

400011重慶市第一人民醫(yī)院 重慶市中醫(yī)院皮膚科

硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶個體化檢測在慢性光化性皮炎患者中的意義和應用

江雪 韓曉鳳 錢思宇 史丙俊 刁慶春

400011重慶市第一人民醫(yī)院 重慶市中醫(yī)院皮膚科

目的研究慢性光化性皮炎患者口服硫唑嘌呤后不良反應的發(fā)生與硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（TPMT）活性及基因型的關(guān)系，探討慢性光化性皮炎患者硫唑嘌呤優(yōu)化用藥方案。方法70例口服硫唑嘌呤治療的慢性光化性皮炎患者納入病例組，其中12例出現(xiàn)藥物不良反應（不良反應組），58例未出現(xiàn)藥物不良反應（無不良反應組）。同時，50例健康體檢者作為對照組。取EDTA抗凝血2 ml，制備紅細胞裂解液，采用高效液相色譜法測定TPMT活性。從全血中提取全基因組DNA，采用等位基因特異性PCR（AS-PCR）和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)檢測TPMT基因型。結(jié)果慢性光化性皮炎患者TPMT活性為（25.80±8.34）U/ml，對照組為（23.58±5.70）U/ml，兩組差異無統(tǒng)計學意義（t=0.782，P＞0.05）。不良反應組TPMT活性為（18.86±9.22）U/ml，無不良反應組為（27.27±6.72）U/ml，不良反應組TPMT活性明顯低于無不良反應組（t=3.437，P＜0.05）。測定2組共120份樣本TPMT基因型，發(fā)現(xiàn)基因突變7例（患者5例，健康對照2例），均為TPMT*3C（A719G）型雜合突變，基因型突變頻率為5.8%，等位基因突變頻率為2.9%。病例組與對照組TPMT*3C突變頻率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.108，P=0.742）。12例有不良反應者中發(fā)現(xiàn)TPMT*3C型突變3例，58例無不良反應者中2例，有不良反應組基因突變頻率顯著高于無不良反應組（χ2=40.093，P＜0.05）。結(jié)論慢性光化性皮炎患者口服硫唑嘌呤出現(xiàn)的不良反應與TPMT基因突變及低TPMT活性有關(guān)，積極調(diào)整低活性、突變型TPMT患者的藥物劑量能實現(xiàn)更安全的治療。

皮炎，光變態(tài)反應；硫唑嘌呤；藥物毒性；DNA突變分析；硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶

硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（thiopurine methyltransgerase，TPMT）是存在于人體內(nèi)的一種非金屬依賴性酶，能利用S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）作為甲基的供體與底物結(jié)合，特異地催化雜環(huán)類和芳香類化合物苯環(huán)6-位硫原子的甲基化。TPMT活性由基因多態(tài)性調(diào)控，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。89%的人帶有高活性TPMT等位基因純合子（TPMTH），11%具有中等活性的雜合子，1/300的人表現(xiàn)出酶活性完全缺失，即低活性TPMT等位基因純合子（TPMTL）；中等活性者及活性完全缺失者在使用標準計量的硫嘌呤類藥物時出現(xiàn)不良反應的風險更高［1］。TPMT活性受多因素影響，導致酶活性基因型和表現(xiàn)型不能完全統(tǒng)一。TPMT遺傳具有單基因共顯性遺傳特征，目前發(fā)現(xiàn)的突變類型超過35種，由專門的TPMT命名委員會命名［2］。常見類型為TPMT*2（G238C）、TPMT*3A（G460A 和 A719G）、TPMT*3B（G460A）和TPMT*3C（A719G），占總突變的95%以上［3］。我們通過研究慢性光化性皮炎患者服用硫唑嘌呤后不良反應發(fā)生情況，分析TPMT活性和TPMT基因型與硫唑嘌呤不良反應的關(guān)系，以降低患者在服用過程中不良反應發(fā)生的概率，提高治療安全性。

對象與方法

一、臨床資料

2015年2-12月在重慶市第一人民醫(yī)院（重慶市中醫(yī)院）皮膚科門診確診的70例慢性光化性皮炎患者納入病例組，其中男54例，女16例，年齡14～83（47.37± 1.82）歲。2016年7-9月在同院體檢中心體檢的50例健康人作為對照組。所選病例均符合慢性光化性皮炎診斷，2個月內(nèi)未接受輸血，1個月內(nèi)未接受任何免疫抑制劑治療，無其他免疫性皮膚病及系統(tǒng)疾病。70例患者口服硫唑嘌呤后，12例出現(xiàn)藥物不良反應（不良反應組），58例未出現(xiàn)（無不良反應組）。不良反應包括頭暈、嘔吐、腹瀉和骨髓抑制（白細胞計數(shù)＜3.0×109/L或中性粒細胞＜1.5×109/L）等，其中，中性粒細胞＜0.5×109/L且持續(xù)2周以上為嚴重骨髓抑制。本研究通過重慶市中醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

二、儀器和試劑

1260系列高效液相色譜儀（美國Agilent公司），DU800紫外/可見光分光光度儀（美國Beackman公司），MJ mini PCR擴增儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；D3010全血全基因組提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司），Taq酶擴增混合液［天根生化科技（北京）有限公司］，限制性內(nèi)切酶ACCⅠ和MwoⅠ（美國New England Biolabs公司）。

三、紅細胞TPMT活性檢測

采用高效液相色譜法測定TPMT的活性，以37℃每小時每毫升紅細胞催化生成1 nmol 6-甲基巰基嘌呤來表示TPMT的活性單位。

1.紅細胞裂解液的制備：用真空EDTA抗凝管采集患者全血2 ml。取1 ml全血至1.5 ml微量離心管（EP）中，2 800×g4℃離心10 min，去血清，留沉淀細胞。加入1 ml生理氯化鈉溶液重懸，同上述步驟離心，去上清液，留沉淀細胞。重復3次。加入與沉淀等體積的生理氯化鈉溶液重懸細胞，取100 μl重懸細胞液至1.5 ml EP管中。最后加入2倍體積的滅菌超純水，槍頭吹打混勻。4℃11 000×g離心1 min，將上清液（紅細胞裂解液）移至新1.5 ml EP管中，如不能及時檢測，可于-80℃凍存待用。

2.TPMT活性的檢測：在300 μl紅細胞裂解液中快速加入新鮮配制的3 mmol/L巰基嘌呤100 μl和1.2 mmol/L SAM 50 μl的混合液，渦旋 30 s，置于38℃恒溫搖床中精確孵育1 h。取出EP管后，向每管快速加入50 μl 72%高氯酸溶液，渦旋混勻，終止反應。將EP管11 000×g離心15 min。吸取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，注入高效液相色譜柱中測定。

3.高效液相色譜測定條件：色譜柱為Sepax Bio-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm，大連依利特公司）；流動相：乙晴∶超純水（10∶90，v/v），加入二硫蘇糖醇（DDT），終濃度為0.5 mmol/L；流速為1 ml/min；紫外線波長310 nm；發(fā)射波長390 nm；柱溫35℃；進樣量50 μl。

四、TPMT基因型檢測

1.引物設計：采用在線Primer3軟件設計引物序列，分別在第5、7、10號外顯子上設計G238C、G460A和A719G突變位點。設計引物序列見表1。

2.全血全基因組DNA提?。喊凑誐agen全血全基因組DNA提取試劑盒說明書，提取基因組DNA。最后加入55 μl TE緩沖液溶解DNA。經(jīng)分光光度儀測定，A260/A280值在1.8～2.0間。DNA在-20℃保存用于TPMT基因型鑒定。

3.G238C突變位點的檢測：采用等位基因特異性 PCR（AS-PCR）檢測 G238C位點的突變。TPMT238F1/TPMT238R和TPMT238F2/TPMT238R兩對引物分別擴增同一DNA樣本。PCR反應體系：2 × Taq酶PCR Mixture緩沖液5 μl，上下游引物各0.2 μl，DNA 模板 0.5 μl，去離子雙蒸水補足至10 μl。擴增條件采用降落PCR（Touchdown PCR），初始解鏈溫度54℃，每1個循環(huán)降低1℃。連續(xù)10個循環(huán)后，再以解鏈溫度50℃擴增26個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠分析。野生型基因純合子可被TPMT238F1/TPMT238R引物擴增得到245 bp產(chǎn)物；突變型基因純合子可被TPMT238F2/TPMT238R引物擴增得到245 bp產(chǎn)物；突變型基因雜合子可同時被上述2對引物擴增出245 bp產(chǎn)物。

4.G460A突變位點的檢測：采用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)檢測G460C位點的突變。采用TPMT460F/TPMT460R配對引物擴增DNA樣本，反應體系和條件均同前。擴增產(chǎn)物片段大小為711 bp。擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MwoⅠ60℃消化3 h，酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠分析。野生型基因純合子被切割為282 bp和429 bp片段；突變型基因純合子因酶切位點被破壞不能被切割，仍為711 bp片段；突變型基因雜合子則有分別為711、429和282 bp 3條片段。

表1 PCR引物

5.A719G突變位點的檢測：采用TPMT719F/TPMT719R配對引物擴增DNA樣本，反應體系和條件同前。擴增產(chǎn)物片段大小為373 bp。擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶ACCⅠ37℃消化3 h，酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠分析。野生型基因純合子不被切割，片段長度仍為373 bp；突變型基因純合子因突變產(chǎn)生酶切位點，被切割成283 bp和90 bp 2條片段；突變型基因雜合子則有分別為373、283和90 bp 3條片段。

五、統(tǒng)計學分析

使用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗（Kolmogorov-Smimov法和Shapiro-Wilk法），TPMT活性數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，用x±s描述數(shù)據(jù)，采用兩獨立樣本t檢驗分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、紅細胞TPMT活性與硫唑嘌呤不良反應

經(jīng)高效液相色譜測定，對照組TPMT活性為11.67～ 48.93（23.58± 5.70）U/ml，慢性光化性皮炎患者為4.28～ 53.62（25.80± 8.34）U/ml，兩組差異無統(tǒng)計學意義（t=0.782，P=0.439）。120例研究對象中，女性TPMT活性為（24.73±5.22）U/ml，男性為（25.62±6.78）U/ml，男女差異亦無統(tǒng)計學意義（t=1.027，P=0.566）。

慢性光化性皮炎患者中，有不良反應組TPMT活性為（18.86±9.22）U/ml，無不良反應組為（27.27±6.72）U/ml，不良反應組明顯低于無不良反應組，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.437，P＜0.05）。高活性TPMT者（＞40 U/ml）3例，均未出現(xiàn)不良反應，而中等活性者（10～40 U/ml）及低活性者（＜10 U/ml）共67例，其中12例出現(xiàn)不良反應，55例未出現(xiàn)不良反應。不同TPMT活性患者不良反應發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.074，P=0.369）。不良反應中，多為頭暈、惡心等輕度不良反應，2例在服藥2周后出現(xiàn)輕度血液系統(tǒng)危象：1例白細胞計數(shù)＜3.0×109/L，1例中性粒細胞＜1.5×109/L，這2例患者均為TPMT*3C雜合子基因型突變，平均TPMT活性為12.41 U/ml。

圖1 G238C、G460A和A719G基因型突變檢測瓊脂糖凝膠電泳圖 1A：G238C基因型突變檢測，1、3：TPMT238F1/TPMT238R引物擴增產(chǎn)物，均為245 bp，2、4：未擴增出TPMT238F2/TPMT238R引物擴增產(chǎn)物，5：標準參照物；1B：G460A基因型突變檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖，1：標準參照物，2、4：擴增產(chǎn)物，均為711 bp，3、5：MwoⅠ60℃消化3 h后的產(chǎn)物片段，可見429和282 bp片段；1C：A719G基因型突變檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖，1、3：擴增產(chǎn)物，373 bp，2、4：ACCⅠ37℃消化3 h后的產(chǎn)物片段，可見泳道2中有373、283和90 bp片段（90 bp片段過小，在凝膠中分辨率較低），而泳道4中仍為373 bp產(chǎn)物，5：標準參照物

二、TPMT基因型與硫唑嘌呤不良反應

測定2組共120份樣本TPMT基因型，部分凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。共發(fā)現(xiàn)基因突變7例，其中患者5例（7.1%），健康對照2例（4.0%），均為TPMT*3C（A719G）型雜合突變，基因型突變頻率為5.8%，等位基因突變頻率為2.9%。病例組與對照組TPMT*3C突變頻率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.108，P=0.742）。

病例組12例有不良反應者中，發(fā)現(xiàn)TPMT*3C型突變3例，基因型突變頻率為25%，等位基因突變頻率為12.5%；58例無不良反應者中，TPMT*3C型突變2例，基因型突變頻率為3.4%，等位基因突變頻率為1.7%，有不良反應組基因突變頻率顯著高于無不良反應組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=40.093，P=0.043）?；蛲蛔冃停═PMT*3C）低活性率為20.0%，野生型（TPMT*1）為1.5%，基因突變型人群TPMT低活性發(fā)生率明顯低于野生型人群，因例數(shù)太少，未做統(tǒng)計學分析。

討 論

近年來藥物遺傳學和藥物基因組學研究迅速發(fā)展，使臨床醫(yī)師更加重視個體化用藥方案。TPMT活性和遺傳多態(tài)性與硫嘌呤類藥物療效及不良反應間的密切聯(lián)系已被證實。TPMT活性和基因型的檢測在國外已逐漸作為硫嘌呤類藥物使用前的常規(guī)檢查，尤其在皮膚科醫(yī)生中使用率更高［4-5］。英國的一份調(diào)查顯示［6］，67%英國臨床醫(yī)生會在患者服用硫唑嘌呤前進行TPMT檢測。而在2005年，F(xiàn)DA將給藥前的TPMT基因型檢測列入硫唑嘌呤/巰基嘌呤的藥品說明書中［7］，英國國家藥典也建議在使用巰基嘌呤類藥物前應進行TPMT檢測。但目前該項檢測僅在國內(nèi)少部分三甲醫(yī)院開展，且并未得到皮膚科醫(yī)生的重視。

硫嘌呤類藥物在臨床中的使用存在個體差異，其原因最早于1970年代末Weinshiboum等［8］在人紅細胞中發(fā)現(xiàn)TPMT的差異而被人所熟知。隨后他們展開了一系列研究，同樣也在淋巴細胞、肝組織、腎組織中發(fā)現(xiàn)了TPMT活性水平的差異。用藥后的藥物監(jiān)測存在滯后性，不能從根本上解決TPMT缺乏導致的一系列不良反應。因此，首次給藥前的TPMT檢測能夠幫助臨床制訂更為安全有效的給藥方案。

本研究顯示，發(fā)生不良反應的患者TPMT基因型突變率明顯高于未發(fā)生不良反應者，提示患者服用硫唑嘌呤后出現(xiàn)的不良反應可能與TPMT基因突變有關(guān)。硫嘌呤類藥物在體內(nèi)有3條代謝途徑，其中TPMT代謝途徑最為重要。TPMT是硫嘌呤類藥物體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，當TPMT發(fā)生突變時，酶活性受到影響（酶活性降低或丟失），直接導致機體對硫嘌呤類藥物的代謝，導致鳥嘌呤核苷酸（TGNs）產(chǎn)物堆積過剩，進入細胞內(nèi)引發(fā)DNA和RNA損傷、細胞凋亡，最終導致不良反應的發(fā)生。鑒于口服硫唑嘌呤個體差異較大，并與TPMT基因突變有關(guān)，為降低不良反應發(fā)生率，指導臨床醫(yī)生用藥，2011年美國臨床遺傳藥物學行業(yè)協(xié)會在Nature上發(fā)布了TPMT基因型檢測和巰基嘌呤用量的指南［9］。

但在研究中我們也發(fā)現(xiàn)，有小部分明確基因型突變的慢性光化性皮炎患者對口服硫唑嘌呤有良好的耐受性，且治療效果顯著，而有一些患者雖沒有明確的基因型突變，但卻出現(xiàn)一定程度的不良反應，提示TPMT基因型與表現(xiàn)型不完全一致。本研究顯示，采用TPMT基因突變預測口服硫唑嘌呤不良反應的發(fā)生準確性達84.3%（59/70）。有研究發(fā)現(xiàn)［10］，健康志愿者TPMT活性和基因型的一致性達到98.4%，而在中等活性人群中兩者的一致性降至86%。研究表明［11］，TPMT基因型較紅細胞TPMT活性在預測藥物不良反應上更準確，更適用于藥物前的初始篩查，而兩者聯(lián)合檢測，能有效降低TPMT缺失的漏檢率［12］，從而更好地降低藥物使用風險，為患者進行更優(yōu)化的個體化治療。因此，研究人員更推薦將基因型作為用藥前的初始檢測，基因型檢測能夠降低將TPMT缺失誤檢為TPMT中等活性的風險［11］。因TPMT活性過高需要增加用藥劑量以達到療效的患者，及部分基因型正常但酶中等活性的人群則需要進行表型檢測。

近年已有文獻報道除TPMT外，ITPA、HPRT、XO、IMPDH等酶均與硫嘌呤類藥物代謝相關(guān)，但本研究僅分析了TPMT代謝酶。此外，還有一些TPMT未知突變位點也未考慮。因此，今后還需進行大樣本前瞻性研究，進一步優(yōu)化硫嘌呤類藥物的個體化應用。

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·讀者·作者·編者·

論文中有關(guān)實驗動物的描述

目前，使用各種動物進行的實驗性研究越來越多，但我們發(fā)現(xiàn)，作者對實驗動物所作的描述很不完整。根據(jù)1988年頒布的中華人民共和國國家科學技術(shù)委員會令第2號《實驗動物管理條例》和衛(wèi)生部1998年頒布的《醫(yī)學實驗動物管理實施細則》，論文中有關(guān)實驗動物的描述，要求寫清楚以下事項：①品種、品系及亞系的確切名稱；②遺傳背景或其來源；③性別、年齡、體重；④質(zhì)量等級及合格證編號；⑤飼養(yǎng)環(huán)境和實驗環(huán)境；⑥健康狀況；⑦對實驗動物的處理方式。醫(yī)學實驗動物分為四級：一級為普通級，二級為清潔級，三級為無特定病原體（SPF）級，四級為無菌級。衛(wèi)生部級課題及研究生畢業(yè)論文等科研實驗必須應用二級以上的實驗動物。

Significance and application of individualized detection of thiopurine S-methyltransferase in patients with chronic actinic dermatitis

Jiang Xue,Han Xiaofeng,Qian Siyu,Shi Bingjun,Diao Qingchun
Department of Dermatology,Chongqing First People′s Hospital and Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital,Chongqing 400011,China

Diao Qingchun,Email:qchundiao@vip.sina.com

ObjectiveTo investigate correlations of thiopurine S-methyltransferase（TPMT）activity（phenotype）and genotype with adverse reactions after oral azathioprine treatment in patients with chronic actinic dermatitis,and to explore optimal azathioprine dose for the treatment of chronic actinic dermatitis.MethodsTotally,70 patients with chronic actinic dermatitis treated with oral azathioprine were enrolled into this study and served as patient group,of whom,12 had adverse reactions to azathioprine.In addition,50 health checkup examinees were enrolled as the control group.EDTA-anticoagulated blood samples were collected from the patients and controls,and erythrocytes lysates were prepared.High performance liquid chromatography（HPLC）was performed to evaluate the activity of TPMT.Genome-wide DNA was extracted from the blood samples,and TPMT genotypes were detected by allele-specific PCR and PCR-restriction fragment length polymorphism（RFLP）analysis.ResultsThere was no significant difference in the TPMT activity between the patient group and control group（［25.80 ± 8.34］U/mlvs.［23.58±5.70］U/ml,t=0.782,P＞0.05）.However,the TPMT activity was significantly lower in patients with adverse reactions than those without（［18.86 ± 9.22］U/mlvs.［27.27 ± 6.72］U/ml,t=3.437,P＜0.05）.TPMT genotypes were detected among 120 samples,and a heterozygous mutation TPMT*3C（A719G）was found in the TPMT gene in 7 samples,including 5 in the patient group and 2 in the control group.The frequencies of the mutant genotype and allele were 5.8%（7/120）and 2.9%respectively.No significant difference in the frequency of TPMT*3C mutation was observed between the patient group and control group（χ2=0.108,P=0.742）.The TPMT*3C mutation was found in 3 of the 12 patients with adverse reactions,as well as in 2 of 58 patients without adverse reactions.Additionally,the frequency of TPMT*3C mutation was significantly higher in patients with adverse reactions than in those without（χ2=40.093,P＜ 0.05）.ConclusionAdverse reactions after oral azathioprine treatment are associated with TPMT mutations and decreased TPMT activity in patients with chronic actinic dermatitis,so appropriately adjusting the azathioprine dose in patients with low-activity and mutant-type TPMT can facilitate safe treatment.

Dermatitis,photoallergic;Azathioprine;Drug toxicity;DNA mutational analysis;Thiopurine methyltransferase

刁慶春，Email：qchudiao@vip.sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.03.009

重慶市中醫(yī)院院內(nèi)培育課題（2209014313）

Fund program:The intramural research program of Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital（2209014313）

2016-06-22）

（本文編輯：周良佳 顏艷）