張玉龍 池玉杰 馮連榮，2

(1. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 哈爾濱 150040； 2. 遼寧省楊樹研究所 蓋州 115213)

偏腫革裥菌錳過氧化物酶酶學(xué)性質(zhì)和染料脫色*

張玉龍1池玉杰1馮連榮1，2

(1. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 哈爾濱 150040； 2. 遼寧省楊樹研究所 蓋州 115213)

【目的】 研究白腐菌偏腫革裥菌(Lenzitesgibbosa)所產(chǎn)錳過氧化物酶(MnP)純酶的序列特征、酶學(xué)性質(zhì)及其對(duì)染料的脫色能力，為其應(yīng)用于木質(zhì)素降解、染料脫色奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?將純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后獲得的唯一L.gibbosaMnP條帶切割，采用Nano液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽測(cè)序技術(shù)對(duì)蛋白氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定。利用該SDS-PAGE圖譜，建立蛋白分子量與遷移率的標(biāo)準(zhǔn)直線，從標(biāo)準(zhǔn)直線上求出MnP純酶樣品的表觀分子量；參照酶活測(cè)定方法檢測(cè)最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性、最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性；采用lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求解米氏動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值。研究L.gibbosa菌種培養(yǎng)液和MnP純酶液對(duì)蒽醌類的茜素紅、偶氮類的剛果紅、雜環(huán)類的中性紅和三苯基甲烷類的結(jié)晶紫等4種不同類型染料的脫色能力。【結(jié)果】 串聯(lián)質(zhì)譜掃描出2條MnP的保守序列肽段，與克隆到的基因Lg-mnp1編碼的Lg-MnP1(GenBank登錄號(hào)：ACO92620)序列完全吻合，表明其所代表的酶蛋白Lg-MnP1就是唯一電泳帶中主要的蛋白。Lg-MnP1的表觀分子量為45.39 kDa，最適反應(yīng)溫度為35 ℃，在低于40 ℃的條件下都具有一定的催化能力，但溫度超過50 ℃后迅速失活；其最適反應(yīng)pH值為3.5，pH超過4.5反應(yīng)程度就迅速下降，在pH為2～3時(shí)最穩(wěn)定；在以2, 6-DMP為底物時(shí)，在21 ℃條件下其米氏常數(shù)Km為6.124 mmol·L-1。L.gibbosa培養(yǎng)液對(duì)染料在1 h的脫色率分別為茜素紅100%、中性紅22.17%、剛果紅19.09%，對(duì)結(jié)晶紫的脫色率很低，在36 h脫色率僅為0.018%。純化后的Lg-MnP1溶液對(duì)染料的最大脫色率在2 h分別為中性紅100%、剛果紅95.55%、茜素紅75.85%和結(jié)晶紫36.57%。【結(jié)論】 SDS-PAGE得到的唯一一條電泳帶中的MnP是Lg-MnP1。Lg-MnP1是一種中溫性、偏酸性的酶，與2, 6-DMP的親和力較大。L.gibbosa含有菌絲的培養(yǎng)液對(duì)茜素紅具有徹底的降解效果，但Lg-MnP1純酶液對(duì)中性紅、剛果紅和結(jié)晶紫的降解效率要遠(yuǎn)高于同時(shí)含有菌絲、漆酶和MnPs的培養(yǎng)液。

偏腫革裥菌； 錳過氧化物酶； 純化； 酶學(xué)性質(zhì)； 染料脫色

白腐真菌分泌的錳過氧化物酶(MnPs)能裂解木質(zhì)素聚合物、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等農(nóng)藥和染料中的側(cè)鏈和芳環(huán)部分，近年來國內(nèi)外很多的研究者都進(jìn)行了白腐菌的酶學(xué)性質(zhì)及MnPs、漆酶等在染料脫色領(lǐng)域的研究(Luetal., 2007; 趙麗紅, 2008; Sietal., 2013)。對(duì)MnPs的酶學(xué)性質(zhì)的研究主要集中在對(duì)MnP 相對(duì)分子量、等電點(diǎn)和米氏常數(shù)(Km)的測(cè)定；MnP 最適反應(yīng)溫度及pH 值；MnP 對(duì)溫度及pH 值的穩(wěn)定性(Chengetal., 2007)；Mn2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ca2+、Co3+、Mg2+等金屬離子對(duì)MnP 穩(wěn)定性的影響(Caietal., 2010)；不同底物如2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)、ABTS [2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]、藜蘆醇、愈創(chuàng)木酚對(duì)MnP 穩(wěn)定性的影響(Périéetal., 1996)。每種白腐菌所產(chǎn)的MnPs是有差別的，而且同一種白腐菌也可以產(chǎn)生幾種催化特性不完全相同的MnP同工酶(Steffenetal., 2002)。本試驗(yàn)在對(duì)偏腫革裥菌(Lenzitesgibbosa)分泌的MnPs進(jìn)行純化、獲得Lg-MnP純酶的基礎(chǔ)上，用SDS-PAGE檢測(cè)了MnP表觀分子量，對(duì)純化后的酶進(jìn)行氨基酸序列鑒定與酶學(xué)性質(zhì)研究，并用菌種培養(yǎng)液和純酶對(duì)茜素紅、剛果紅、中性紅和結(jié)晶紫等4種染料進(jìn)行了脫色降解研究，以期詳細(xì)了解Lg-MnP的性質(zhì)，以期了解菌種培養(yǎng)物和純酶各自對(duì)染料的脫色降解能力及其在木質(zhì)素降解、染料脫色領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用奠定酶學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1純化后的電泳樣品中氨基酸序列的測(cè)定

凝膠過濾柱層析后經(jīng)濃縮和冷凍干燥的MnP蛋白純化樣品(總MnP活力和比活力分別為43.38 U和33.63 U·mg-1)，經(jīng)SDS-PAGE后，將獲得的唯一MnP條帶切割，送ProtTech公司采用納米液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽測(cè)序技術(shù)進(jìn)行蛋白氨基酸序列的測(cè)定。對(duì)從凝膠中回收的唯一條帶中所含有的蛋白質(zhì)樣品，利用根據(jù)測(cè)序梯度改良的胰蛋白酶消化后的多肽混合物用LC-ESI-MS/MS 測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行具體分析，這一過程中，高效液相色譜(HPLC)和帶有一個(gè)離子捕捉器的質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)工作，HPLC中具有一個(gè)內(nèi)徑為75 nm的反相C18毛細(xì)管分離柱的測(cè)微計(jì)，獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在ProtTech公司軟件中搜索最新的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)，在得出報(bào)告之前還要對(duì)數(shù)據(jù)庫的輸出結(jié)果進(jìn)行手動(dòng)驗(yàn)證，更多試驗(yàn)的細(xì)節(jié)可參閱www.prottech.com。LC-ESI-MS/MS法的結(jié)果是基于獨(dú)立的肽段測(cè)序，可得到確切存在于樣品中的蛋白質(zhì)名單，對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定有近100%的可靠性，一般情況下由2個(gè)或以上的多肽組成的蛋白質(zhì)可靠性大于99.99%。

1.2SDS-PAGE檢測(cè)純化后的MnP蛋白表觀分子量

上述MnP蛋白純化樣品，用SDS-PAGE檢測(cè)分子量。計(jì)算已知分子量的蛋白質(zhì)Marker在電泳譜帶圖中的相對(duì)遷移率Rf，并和已知分子量作圖，建立標(biāo)準(zhǔn)直線，根據(jù)MnP酶液樣品唯一條帶的Rf值，從標(biāo)準(zhǔn)直線上求出MnP純酶的表觀分子量。

1.3MnP酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.1 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 參照酶活測(cè)定方法：分別向8只1 mL的比色皿中依次加入pH4.5的840 μL 50 mmol·L-1的丙二酸鈉、50 μL 10 mmol·L-1的MnSO4、50 μL 10 mmol·L-1的2, 6-DMP，在15、25、35、45、55、65、75、85 ℃下保溫5 min，再迅速加入50 μL純酶樣品和10 μL 10 mmol·L-1的H2O2，啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定MnP酶活，以相同溫度1 mL去離子水作為對(duì)照，以溫度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖(以酶活最高者為100%)。在8只1.5 mL離心管中加入0.5 mL酶液，分別在4、10、20、30、40、50、60、70 ℃下保溫1 h，然后在室溫下測(cè)酶活，以未保溫酶液的酶活力為100%。

1.3.2 最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性 稱取一定量的丙二酸溶于去離子水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值使其分別成為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的50 mmol·L-1丙二酸鈉緩沖液，用這些緩沖液替代原來pH4.5的緩沖液后測(cè)定酶活力，以pH值為橫坐標(biāo)，以相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖(以酶活最高者為100%)。在室溫下，將50 μL純酶樣品分別加入到pH值為3、4、5、6、7、8、9的50 mmol·L-1丙二酸鈉緩沖液溶液中1和12 h，分別測(cè)定其殘余酶活力，以1 h和12 h的酶活為縱坐標(biāo)作圖(以在pH4.5中緩沖體系的酶活為100%)。

1.3.3 米氏動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值的測(cè)定 采用lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求解Km值：將2, 6-DMP分別配制成5、10、15、20和25 mmol·L-1濃度的溶液，作為底物。在采用不同濃度底物測(cè)定酶活的反應(yīng)體系中室溫保存5 min，再迅速加入50 μL純酶樣品和10 μL 10 mmol·L-1的H2O2，啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定A470，以計(jì)算酶促反應(yīng)初速度。以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以酶反應(yīng)的初速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，作lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，建立標(biāo)準(zhǔn)直線，求解標(biāo)準(zhǔn)直線方程式，再從標(biāo)準(zhǔn)直線方程式導(dǎo)出Km值。

1.4菌種培養(yǎng)液和MnP純酶對(duì)4種染料的脫色試驗(yàn)

1.4.1 4種染料最大吸收峰處的波長值、吸光度A與濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 選擇蒽醌類的茜素紅、偶氮類的剛果紅、雜環(huán)類的中性紅和三苯基甲烷類的結(jié)晶紫4種不同結(jié)構(gòu)類型的染料，分別配制50 mg·L-1的水溶液，用紫外分光光度計(jì)在波數(shù)300～800 nm區(qū)間內(nèi)掃描，以得到吸收光譜圖，從中查找4種染料最大吸收峰處的吸光值A(chǔ)o及其對(duì)應(yīng)的波長值λmax，以去離子水為對(duì)照。將4種染料分別配制成濃度為0、20、40、60、80、100 mg·L-1的溶液，在各自的最大吸收峰處波數(shù)值下測(cè)定其吸光度值A(chǔ)i，以濃度C(mg·L-1)為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)i為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)直線，得出吸光度值與濃度相互關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)方程。

1.4.2L.gibbosa培養(yǎng)液的染料脫色試驗(yàn) 利用已經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件培養(yǎng)L.gibbosa(張玉龍等，2012)，稱取4種染料各0.07 g，加入100 mL去離子水，滅菌后吸取5 mL加入到已經(jīng)培養(yǎng)15天的菌種液體培養(yǎng)基中，使各種染料的終濃度為50 mg·L-1。靜止培養(yǎng)脫色，在加入染料后的1 min、1 h、12 h、36 h，或直到達(dá)到最大脫色率為止，測(cè)定各自染料最大吸收峰波長處的吸光值A(chǔ)i，根據(jù)1.4.1中的標(biāo)準(zhǔn)直線將染料的Ao和Ai值轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的染料濃度Co和Ci，以不加染料的菌液為對(duì)照，計(jì)算其脫色率，脫色率(%)=[(Co-Ci)/Co]×100%。

1.4.3 MnP純酶液的染料脫色試驗(yàn) 純酶降解體系參照酶活測(cè)定體系：pH4.5的50 mmol·L-1丙二酸鈉緩沖液840 μL、10 mmol·L-1的MnSO450 μL、10 mmol·L-1的染料樣品50 μL、MnP純酶液50 μL、10 mmol·L-1的H2O210 μL。進(jìn)行2個(gè)對(duì)照試驗(yàn)：對(duì)照1是將50 μL酶液用緩沖液替代；對(duì)照2是將H2O2用緩沖液替代。上述各反應(yīng)在比色皿中進(jìn)行，第1 min、1 h、2 h、3h、4 h測(cè)定各染料在各自最大吸收峰處波數(shù)值下的吸光值。用1.4.1中的標(biāo)準(zhǔn)直線計(jì)算出染料濃度，用1.4.2中的方法計(jì)算脫色率。

2 結(jié)果與分析

2.1純化后的MnP電泳樣品中氨基酸序列鑒定

送檢樣品為SDS-PAGE得到的唯一電泳條帶，在電泳之前和電泳過程中蛋白質(zhì)樣品會(huì)受到多次干擾而充分變性，并分解成獨(dú)立的肽段，測(cè)序是從雜亂的多種肽段序列中尋找保守的MnPs等氨基酸序列，ProtTech公司的蛋白氨基酸序列鑒定結(jié)果見表1，單一電泳條帶中存在幾種分子量相近的蛋白質(zhì)肽段，表明純化的MnP樣品中含有多種蛋白。解析出的每種多肽序列數(shù)量可用來指示其在蛋白樣品中的相對(duì)含量，如一序列被多次掃描就是多次出現(xiàn)的。串聯(lián)質(zhì)譜掃描出2條MnPs的保守序列肽段，1條序列LTFHDAIGISPK的分子量是1 297.70 Da，重復(fù)出現(xiàn)25次，為MnP的遠(yuǎn)端組氨酸保守區(qū)；1條TVPEPFDTVDSILAR的分子量為1 658.85 Da，出現(xiàn)1次，為MnP的芳香環(huán)結(jié)合位點(diǎn)及其后序列。這2條MnPs肽段與筆者已經(jīng)克隆到的Lg-mnp1基因編碼的Lg-MnP1(GenBank登錄號(hào)：ACO92620)蛋白(閆洪波等， 2014)完全吻合，是L.gibbosa同一個(gè)MnP上的序列，在表1的Sequence Header中也明確顯示出來。由于肽段LTFHDAIGISPK數(shù)量最多，表明其所代表的錳過氧化物酶蛋白Lg-MnP1就是唯一電泳帶中的主要蛋白。表1最下方顯示1條漆酶的保守序列肽段ANPSFGTTGFAGGINSAILR，分子量為1 950 Da，出現(xiàn)1次，這是真菌漆酶特征性的LoopⅡ及其后面的序列，與筆者已經(jīng)克隆到的Lg-lac2基因編碼的漆酶Lg-Lac2(GenBank登錄號(hào)：AEQ28164)序列完全吻合，在Sequence Header中以gb|ADK13091.1|顯示出來。由于該肽段重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)少，表明其所代表的漆酶蛋白Lg-Lac2是非主要的蛋白。3條LiP的保守序列肽段分別出現(xiàn)1次、3次和3次，都列在同一個(gè)LiP下，與Eggert 等(1996)發(fā)表的朱紅密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)的LiP保守序列完全吻合，在Sequence Header中以gb|ADK60913.1|顯示出來。其中第1條肽段序列僅比第2條多一個(gè)賴氨酸K，其后24個(gè)氨基酸序列完全一致，是含有VPEP芳香環(huán)結(jié)合位點(diǎn)的序列。這3條LiP肽段所代表的LiP蛋白也是非主要的蛋白。由于筆者尚未克隆出完整的L.gibbosalip基因，無法得知LiP蛋白序列，這3條LiP的肽段序列還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 蛋白氨基酸序列鑒定結(jié)果①Tab.1 The appraisal result of amino acid sequences of different proteins

①* 如果某種肽段被多次測(cè)序，就會(huì)得到多個(gè)掃描號(hào)。If certain peptide segments are sequenced multiple times, multiple scan Numbers will be obtained.

2.2Lg-MnP1的表觀分子量

根據(jù)純化后MnP樣品SDS-PAGE譜帶圖繪制的蛋白Marker分子量與遷移率的標(biāo)準(zhǔn)直線見圖1，得出直線方程式。電泳圖中純化樣品的遷移率為64.56%，計(jì)算出Lg-MnP1的表觀分子量為45.39 kDa，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的MnPs純化后的表觀分子量相當(dāng)(Schneegaβetal., 1997; Bermeketal., 2004; Caietal., 2010)。電泳帶中主要蛋白Lg-MnP1其一級(jí)結(jié)構(gòu)得到的精確分子量為35.94 kDa，與表觀分子量45.39 kDa略有不符，推測(cè)原因可能是由于酶蛋白一級(jí)序列表達(dá)形成三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)糖基化而增加了分子量的結(jié)果，雖然成熟蛋白在電泳之前和之時(shí)三級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，血紅素輔基可能斷掉，但是連接的糖基化分子可能未斷裂掉。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)直線Fig.1 The standard curve of molecular weight of protein marker

2.3Lg-MnP1最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

圖2A所示為MnP最適反應(yīng)溫度曲線圖，初期隨溫度的升高酶促反應(yīng)逐漸升高，在35 ℃時(shí)達(dá)到最高，之后緩慢下降。適當(dāng)?shù)母邷啬芗铀倜复俜磻?yīng)，但是溫度過高會(huì)導(dǎo)致酶活性喪失，從而失去催化能力。圖2B所示為MnP對(duì)于溫度的耐受性，表明在低于40 ℃的條件下MnP都具有一定的催化能力，但是溫度超過50 ℃后活力迅速下降直至失活。

2.4Lg-MnP1最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性

圖3A和3B表明Lg-MnP1最適反應(yīng)pH值和不同pH下的穩(wěn)定性，其最適反應(yīng)pH值為3.5，超過4.5活性就會(huì)迅速下降，其在pH2—3時(shí)最穩(wěn)定。酶的最適反應(yīng)pH值與底物的基團(tuán)和參與催化基團(tuán)的pK值有關(guān)，pH會(huì)影響底物分子和酶蛋白分子的解離狀態(tài)，通常只有一種解離狀態(tài)最有利于酶與底物的結(jié)合，即在此pH下酶活力最高，過高過低都會(huì)影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至導(dǎo)致酶的變性失活。當(dāng)緩沖液的pH值改變不很大時(shí)，酶蛋白雖然不變性，但其活力會(huì)受到影響。已有報(bào)道MnPs最適反應(yīng)pH值一般為2～6(Chengetal., 2007)，而Lg-MnP1較適宜偏酸性的環(huán)境。

圖2 Lg-MnP1最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.2 The optimal reaction temperature and thermal stability of Lg-MnP1

圖3 MnP最適反應(yīng)pH值和在不同pH值下的穩(wěn)定性Fig.3 The optimal reaction pH value and stability under different pH value of MnP

2.5Lg-MnP1米氏動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值

圖4為以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以酶反應(yīng)的初速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，獲得的lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，獲得的標(biāo)準(zhǔn)直線方程式標(biāo)注其上，通過該方程式求得的X軸截距倒數(shù)的絕對(duì)值即為Lg-MnP1以2, 6-DMP為底物的米氏常數(shù)，在室溫21 ℃條件下Km=6.124 mmol·L-1，大多數(shù)純酶的Km值在0.01～100 mmol·L-1，該Km值表明Lg-MnP1與底物2, 6-DMP的親和力較大。

圖4 Lg-MnP1的lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.4 The lineweaver-Burk double bottom figure of Lg-MnP1

2.6染料的脫色降解結(jié)果

2.6.1 4種染料吸光度A與濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線 從4種染料最大吸收峰光譜圖查到最大吸收峰處的吸光值A(chǔ)o及其對(duì)應(yīng)的波長值λmax如下：茜素紅0.700、422 nm；剛果紅1.900、496 nm；中性紅3.615、517 nm；結(jié)晶紫3.811、568 nm。4種染料在其最大吸收峰處波數(shù)值下吸光度A與濃度C標(biāo)準(zhǔn)直線見圖5A-D。

2.6.2L.gibbosa培養(yǎng)液的染料脫色效果 4種染料濃度隨時(shí)間變化曲線見圖6A-C。L.gibbosa含有菌絲體的培養(yǎng)液對(duì)茜素紅的脫色率在1 h時(shí)就達(dá)到了100%；而對(duì)中性紅和剛果紅在1 h的脫色率分別為22.17%和19.09%，在36 h的脫色率分別為33.63%和25.09%；對(duì)結(jié)晶紫的脫色率很低，在36 h脫色率僅為0.018%。

圖5 4種染料最大吸收峰光譜圖和吸光度A與濃度C標(biāo)準(zhǔn)直線Fig.5 The maximum absorption peak spectrogram and Absorbance(A) and Concentration (C) standerd curve of four dyes

圖6 在L.gibbosa培養(yǎng)液內(nèi)4種染料濃度隨時(shí)間的變化曲線Fig.6 The concentration change curve of four dyes with time in the culture fluid of L.gibbosa

2.6.3 Lg-MnP1純酶液的染料脫色效果 Lg-MnP1純酶液對(duì)4種染料的脫色降解效果見圖7A-D，可以看出染料濃度一般在2 h內(nèi)迅速下降，并在之后的時(shí)間里趨于穩(wěn)定。對(duì)照1為不加酶液的反應(yīng)體系，對(duì)照2為加酶液不加H2O2的反應(yīng)體系。由于H2O2對(duì)染料同樣具有氧化降解作用，并且它是啟動(dòng)MnP催化降解反應(yīng)的因子，試驗(yàn)組數(shù)據(jù)減去對(duì)照2，就是酶在添加H2O2的情況下減去了酶不添加H2O2時(shí)的降解效果，即H2O2的作用；試驗(yàn)組數(shù)據(jù)減去對(duì)照1，就是減去了H2O2對(duì)染料的降解效果，排除掉H2O2對(duì)染料降解的干擾作用后，從而反映Lg-MnP1的真實(shí)降解能力。數(shù)據(jù)分析的結(jié)果表明，對(duì)于中性紅、剛果紅和茜素紅，試驗(yàn)組數(shù)據(jù)減去對(duì)照1總是比試驗(yàn)組數(shù)據(jù)減去對(duì)照2的降解效果要好(結(jié)晶紫的除外，但二者接近)，說明酶在不添加H2O2時(shí)對(duì)中性紅、剛果紅和茜素紅也有較強(qiáng)的降解效果，而單獨(dú)H2O2對(duì)染料降解能力較低。統(tǒng)計(jì)Lg-MnP1對(duì)4種染料的最大脫色率，在2 h分別為中性紅100.00%、剛果紅95.55%、茜素紅75.85%和結(jié)晶紫36.57%；在3 h剛果紅為96.29%，在4 h茜素紅為77.51%、結(jié)晶紫為51.82%。前3種染料的最大脫色率都是試驗(yàn)組數(shù)據(jù)減去對(duì)照1得到的，只有結(jié)晶紫是試驗(yàn)組數(shù)據(jù)減去對(duì)照2的結(jié)果。

圖7 Lg-MnP1純酶液對(duì)4種染料的脫色降解效果Fig.7 The decoloring effect with time to four dyes of the purified Lg-MnP1 solution

2.6.4L.gibbosa培養(yǎng)液和Lg-MnP1純酶染料脫色效果比較L.gibbosa在木質(zhì)素條件下能分泌漆酶和MnPs，其液體培養(yǎng)物除了液面液內(nèi)含有菌絲體外，液內(nèi)還含有這2種酶。純化后的Lg-MnP1其比活力和蛋白濃度都比培養(yǎng)液高很多，比較培養(yǎng)液和Lg-MnP1純酶對(duì)4種染料的脫色效果可知，中性紅、剛果紅和結(jié)晶紫，純酶的脫色效果明顯高于同時(shí)含有菌絲體、漆酶和MnPs的培養(yǎng)液，而且純酶的脫色時(shí)間縮短很多，通常在2 h就達(dá)到較高的脫色率。Lg-MnP1純酶對(duì)中性紅和剛果紅脫色效果顯著，這與慕慶峰等(2005)報(bào)道的白腐菌在Mn2+濃度較高Cu2+濃度較低的條件下對(duì)剛果紅脫色效果顯著相一致，推測(cè)L.gibbosaMnP對(duì)剛果紅的降解可能強(qiáng)于漆酶所起的作用，并且依賴于較高濃度Mn2+的存在。而對(duì)于茜素紅，培養(yǎng)液的脫色效果高于純酶，在1 h時(shí)就達(dá)到了100%，推測(cè)菌絲體或漆酶對(duì)茜素紅有較強(qiáng)的吸附脫色作用和酶促降解作用。

3 討論

本試驗(yàn)氨基酸測(cè)序結(jié)果表明，SDS-PAGE電泳的唯一條帶雖然不是純一的蛋白肽段，但其中多數(shù)屬于同一個(gè)MnP蛋白，表明L.gibbosa的MnP已得到基本純化。Lg-MnP1純酶在4～40 ℃之間均有良好的催化穩(wěn)定性，筆者的跟蹤檢測(cè)也表明該純酶在4 ℃時(shí)保存1個(gè)月后依然具有催化活性。純酶的脫色效率高，需要H2O2的協(xié)助。在氨基酸測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了3條LiP氨基酸保守序列，與朱紅密孔菌L.gibbosa能夠分泌LiP，P.cinnabarinus的LiP氨基酸保守序列類似，說明L.gibbosa在液體培養(yǎng)條件下不但有MnPs和漆酶產(chǎn)生，也有少量的LiP產(chǎn)生，但是酶活檢測(cè)都沒有檢測(cè)到LiP活性。LiP活性沒有檢測(cè)到，推測(cè)原因一是表達(dá)量可能很低；二是測(cè)定方法可能還需改進(jìn)。酶活性的測(cè)定通常以這種酶能夠作用的某種特異性底物來衡量，測(cè)定LiP的底物藜蘆醇為3，4-二甲氧基苯甲醇，是具有芳香結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物之一，用這種底物可能即使酶液里有微量的LiP，也不容易測(cè)定出來。筆者已克隆到一個(gè)疑似LiP的基因片段(閆洪波等， 2014)，但由于尚未得到全長，還無法確定與在氨基酸測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的LiP氨基酸保守序列的關(guān)系。在蟲擬蠟菌(Ceriporiopsissubvermispora)等白腐菌中，也發(fā)現(xiàn)了在培養(yǎng)液中沒有檢測(cè)到LiP活性，卻克隆到LiP基因的現(xiàn)象(Rajakumaretal., 1996)。

4 結(jié)論

SDS-PAGE得到的唯一一條電泳帶中的MnP是Lg-MnP1。Lg-MnP1是一種中溫性、偏酸性的酶，與2, 6-DMP的親和力較大。L.gibbosa含菌絲的培養(yǎng)液對(duì)茜素紅具有徹底的降解效果，但Lg-MnP1純酶液對(duì)中性紅、剛果紅和結(jié)晶紫的降解效率要遠(yuǎn)高于同時(shí)含有菌絲、漆酶和MnPs的培養(yǎng)液。

慕慶峰，趙 敏，錢 程. 2005. 血紅密孔菌對(duì)剛果紅脫色的共培養(yǎng)體系優(yōu)化的研究.中國造紙學(xué)報(bào), 20(2): 95-100.

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(責(zé)任編輯 王艷娜)

本刊顧問張齊生先生逝世

世界著名木材加工和人造板工藝學(xué)專家、中國和世界竹材加工利用領(lǐng)域的開拓者、中國工程院院士、《林業(yè)科學(xué)》第十屆編委會(huì)顧問張齊生教授，因病醫(yī)治無效，于2017年9月25日上午9：43分在南京逝世，享年78歲。

張齊生先生曾任林業(yè)部第三、四屆科技委員、中國工程院農(nóng)業(yè)學(xué)部副主任、中國工程院科學(xué)道德委員會(huì)委員、國家林業(yè)局專家咨詢委員會(huì)會(huì)員、中國竹產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)副會(huì)長等職務(wù)。他長期從事木材加工與人造板工藝以及生物質(zhì)能源多聯(lián)產(chǎn)技術(shù)的研究工作，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)界享有盛譽(yù)。他治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、敏于思考、勤于實(shí)踐、善于創(chuàng)新，始終站在學(xué)術(shù)前沿，圍繞國家重大需求開展研究，在工程技術(shù)和推廣應(yīng)用方面卓有建樹。他首次將竹子大規(guī)模引入工業(yè)化利用領(lǐng)域，推動(dòng)了我國竹材加工產(chǎn)業(yè)的形成和發(fā)展，使我國竹材加工業(yè)居世界領(lǐng)先地位，為竹材加工利用事業(yè)做出了創(chuàng)造性的貢獻(xiàn)。他與時(shí)俱進(jìn)、開拓創(chuàng)新，在“農(nóng)林生物質(zhì)氣化多聯(lián)產(chǎn)”核心技術(shù)、關(guān)鍵設(shè)備等方面取得了重大突破，為我國低碳經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了積極貢獻(xiàn)。

張齊生院士的不幸逝世是中國林業(yè)科教事業(yè)的巨大損失，也是《林業(yè)科學(xué)》的巨大損失。他關(guān)心期刊工作，審稿認(rèn)真負(fù)責(zé)，為期刊發(fā)展付出了心血和汗水，帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)在《林業(yè)科學(xué)》發(fā)表多篇文章，深受廣大作者和編輯人員的尊重和愛戴。張齊生院士潛心科研、不斷創(chuàng)新的治學(xué)精神，身體力行、誨人不倦的為師風(fēng)范，愛黨愛國、甘當(dāng)春蠶的崇高品德，積極向上、樂觀豁達(dá)的人生態(tài)度，將激勵(lì)我們努力工作，為提高《林業(yè)科學(xué)》辦刊水平、促進(jìn)林業(yè)科技繁榮而努力奮斗。

張齊生院士永遠(yuǎn)活在我們心中！

本刊編輯部

EnzymologyCharacteristicsandDyeDecolorizationofManganesePeroxidasefromLenzitesgibbosa

Zhang Yulong1Chi Yujie1Feng Lianrong1, 2

(1.SchoolofForestry，NortheastForestryUniversityHarbin150040; 2.ThePoplarInstituteofLiaoningProvinceGaizhou115213)

【Objective】 In order to get a clear picture of the sequence signature, characteristics, and decolorizing ability to four types of dyes of the purified manganese peroxidase (MnP) produced by white-rot basidiomyceteLenzitesgibbosastrain CB-1.【Method】 A single MnP protein band detected in the SDS-PAGE electrophoresis of the purified sample was cut and sequenced by Nano LC-ESI-MS/MS peptide sequencing technology. The characteristics of the purified MnP were studied, the apparent molecular weight of the purified MnP was calculated by the standard curve of protein molecular weight and mobility according to SDA-PAGE pattern, the optimal reaction temperature and thermal stability, the optimal reaction pH and pH stability were determined by enzymatic activity measuringmethod , Michaelis-constantKmwas solved by lineweaver-Burk double bottom figure. The decolorization ability of culture fluid and purified MnP ofL.gibbosato four types s of dyes, namely, alizarin red, neutral red, congo red, and crystal violet were studied, respectively.【Result】 Two conserved amino acid sequences of MnP scanned by Tandem MS perfectly match with Lg-MnP1 (GenBank Accession No. ACO92620) sequence, indicating that Lg-MnP1 represented by two conserved peptides is the main protein in the only electrophoresis band. The apparent molecular weight of Lg-MnP1 is 45.39 kDa. Its optimal reaction temperature is about 35 ℃, it has some catalytic ability and stability during 40 ℃ but rapidly becomes inactivated beyond 50 ℃. Its optimal reaction pH value is 3.5, its catakytic activity rapidly decreases when pH value is above 4.5, and it is the most stable in pH 2-3 when it is kept for more than 10 hours. Its Michaelis-constantKmis 6.124 mmol·L-1at 21 ℃ with 2,6-DMP as substrate. The decolorization percent of culture fluid is 100% to alizarin, 22.17% to neutral red, and 19.09% to congo red at 1 h, respectively, but low to crystal violet and only 0.018% at 36 h, whereas that of the purified Lg-MnP1 solution at 2 h is 100% to neutral red, 95.55% to congo red, 75.85% to alizarin, and 36.57% to crystal violet.【Conclusion】 The MnP in the only band of SDS-PAGE is Lg-MnP1. Lg-MnP1 is a mesophile and partial acidic enzyme and with higher affinity to 2,6-DMP. The culture fluid with mycylia ofL.gibbosahas a thoroughly decolorizing ability to anthraquinone dye, while the purified Lg-MnP1 has a higher decolorizing efficiency to neutral red, congo red, and crystal violet than the culture fluid with mycylia, laccases and MnPs.

Lenzitesgibbosa； manganese peroxidases(MnPs)； purification； characteristics in enzymology； dye decoloring

S718.81

A

1001-7488(2017)09-0073-08

10.11707/j.1001-7488.20170909

2016-06-07；

2016-11-10。

東北林業(yè)大學(xué)博士研究生自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2572016AA04)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2016006)。

*池玉杰為通訊作者。