劉長英 張 夢 魏從進 許亞珍 曹博寧 鄭 莎 范 偉 向仲懷 趙愛春

(西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部蠶桑生物學與遺傳育種重點實驗室 重慶 400716)

轉(zhuǎn)桑樹MAPK5基因擬南芥在不同逆境脅迫下的抗性分析*

劉長英 張 夢 魏從進 許亞珍 曹博寧 鄭 莎 范 偉 向仲懷 趙愛春

(西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部蠶桑生物學與遺傳育種重點實驗室 重慶 400716)

【目的】 植物促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在響應(yīng)生物與非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究通過分析桑樹(川桑)B家族MAPK基因MnMAPK5的亞細胞定位和啟動子活性，并將其轉(zhuǎn)入擬南芥中進行過表達研究，探討MnMAPK5在逆境脅迫下的作用機制?！痉椒ā?將MnMAPK5的上游啟動子連接到pBI121載體上，通過花粉介導法轉(zhuǎn)入擬南芥中，經(jīng)高溫、低溫、NaCl和PEG處理后進行GUS染色分析。通過構(gòu)建過表達載體，將MnMAPK5轉(zhuǎn)化到擬南芥中，用 T3轉(zhuǎn)基因植株進行抗逆境脅迫分析。【結(jié)果】MnMAPK5基因的編碼蛋白定位于細胞質(zhì)和細胞核中。在擬南芥中檢測MnMAPK5啟動子驅(qū)動的GUS活性的結(jié)果顯示，MnMAPK5啟動子活性受到了高溫、低溫、高鹽和干旱脅迫的誘導。在高鹽、干旱、低溫和H2O2處理條件下，過表達MnMAPK5抑制了轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)和生長。在鹽脅迫下，過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因植株中的MDA含量和POD活性，降低了CAT活性、可溶性糖含量和H2O2含量； 在干旱脅迫下，過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥中的MDA和H2O2含量，降低了CAT和POD活性； 在低溫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥相比野生型植株表現(xiàn)出更低的CAT活性、POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量； 在氧化環(huán)境脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的MDA含量顯著高于野生型擬南芥，而脯氨酸含量和可溶性糖含量要低。此外，在各個脅迫環(huán)境條件下，AtPOD、AtCAT和AtRD22等脅迫相關(guān)基因的表達量在轉(zhuǎn)基因植株低于野生型擬南芥?！窘Y(jié)論】MnMAPK5啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的活性受到了不同非生物脅迫的誘導。過量表達MnMAPK5降低了擬南芥對非生物脅迫的抵抗能力，表明MnMAPK5在逆境脅迫下起著負調(diào)控作用。

桑樹； MAPK； 非生物脅迫； 脅迫響應(yīng)； 啟動子

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用，可將細胞外的信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，影響其下游基因的表達，從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)各種生理反應(yīng)，響應(yīng)外界環(huán)境。植物中的MAPK基因最早在紫花苜蓿(Medicagosativa)中被鑒定，此后陸續(xù)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)等植物中被發(fā)現(xiàn)(Duerretal., 1993； Mizoguchietal., 1996； Zhangetal., 1998； Heetal., 2000)。隨著分子生物學和基因組測序的快速發(fā)展，MAPK基因家族的鑒定和功能研究已在多種單子葉和雙子葉植物中報道。前人研究表明，在擬南芥MAPK級聯(lián)中的AtMPK9和AtMPK12可調(diào)控干旱誘導的氣孔運動(Fabienetal., 2009； Salametal., 2013)，MPK6在鹽脅迫條件下參與調(diào)控磷脂酸的積累(Yuetal., 2010)，過表達MKK4能夠降低轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的水分損失率并提高其耐旱性(Tsugamaetal., 2012)。擬南芥AtMEKK1、AtMKK2和AtMPK4/MPK6被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控鹽脅迫(Teigeetal., 2004)，主要通過直接磷酸化來激活鹽脅迫響應(yīng)基因(如SOS1、ZAT6、RD29A和RD29B等)，從而提高植物的抗鹽能力(Yuetal., 2010； Liuetal., 2012)。植物MAPK也能夠響應(yīng)溫度脅迫。煙草細胞中的HAMK(heat-activated MAP kinase)可促使HSP70蛋白積累，調(diào)控對高溫脅迫的適應(yīng)(Surietal., 2008)。擬南芥和玉米(Zeamays)中的MAPK能夠被冷脅迫誘導(Ichimuraetal., 2000; Panetal., 2011)，過表達玉米ZmMPK4提高了轉(zhuǎn)基因煙草對低溫脅迫的耐受性(Zhouetal., 2012)。此外，MAPK還參與了植物對氧化脅迫、機械損傷和重金屬脅迫等非生物脅迫的響應(yīng)(Liuetal., 2010； Lumbrerasetal., 2010； Zhouetal., 2012)。盡管MAPK已在多種植物中被鑒定，但其在逆境脅迫中的功能主要在草本植物中被解析，在木本植物中還不清楚。

桑樹(Morus)光合作用強、生長迅速，還具有對干旱、洪澇、鹽堿害和冷害等逆境脅迫良好的抵抗能力，而對桑樹的抗逆性機制的研究較少。在前期研究中鑒定了10個桑樹MAPK基因，發(fā)現(xiàn)其能夠被不同脅迫處理誘導表達，表明桑樹MAPK在不同的脅迫處理中發(fā)揮著一定的作用(Weietal., 2014)。為了探究MAPK在桑樹非生物脅迫響應(yīng)中的作用機制，本研究對川桑(Morusnotabilis)MnMAPK5進行上游啟動子活性分析，并探究其在擬南芥中過量表達對植株抗性的影響。

1 材料與方法

1.1試驗材料

生態(tài)型擬南芥Columbia(西南大學羅克明教授惠贈)用于遺傳轉(zhuǎn)化； 植物過表達載體pLGNL和pBI121由實驗室保存； 根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404(實驗室保存)用于擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2亞細胞定位載體的構(gòu)建

依據(jù)MnMAPK5(GenBank登錄號： KF683080)和EGFP基因序列信息及 pLGNL 載體上的多克隆位點，找到的合適的酶切位點有KpnI、BamH I、SpeI，并設(shè)計相應(yīng)的引物。以川桑葉片的cDNA為模板進行PCR擴增MnMAPK5，經(jīng)過T克隆驗證后將MnMAPK5與EGFP一同連接到pLGNL載體上，并通過凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中。將含陽性質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種至YEB 液體培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至 OD=0.8，然后用滲透培養(yǎng)基(MS+10 mmol·L-1MgC12+100 mmol·L-1AS+0.01% (W/V) MES)重懸菌體至OD600=0.8。使用重懸菌液侵染洋蔥(Alliumcepa)表皮細胞20 min后于16 h 光照/8 h 暗培養(yǎng) 16～24 h。最后取出洋蔥表皮用 DAPI 染色 4 min，壓片法制片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3MnMAPK5啟動子的功能分析

從川桑基因組數(shù)據(jù)庫(http://morus.swu.edu.cn/morusdb/)中獲取MnMAPK5的上游1 500 bp的序列作為啟動子分析序列，使用PlantCARE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在線軟件預測其順式作用元件。

根據(jù)獲得的MnMAPK5啟動子序列設(shè)計引物(上游引物序列： 5′-CCAAGCTTCTCAACTGTGTAG-3′； 下游引物序列： 5′-CGGGATCCTTTCTCCGATGA CTCTTTG-3′)，并在上下游引物中分別加上酶切位點Hind III 和BamH I，以川?；蚪M為模板進行PCR擴增，采用1%的瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，切下目的條帶，使用膠回收試劑盒回收，最后克隆進入pMD19-T載體中并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆并進行測序鑒定。將獲得的含MnMAPK5啟動子片段的T載體進行雙酶切，并利用T4連接酶(Promega)將酶切產(chǎn)物連接到pBI121載體上。

將構(gòu)建完畢的植物表達載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，侵染開花期的野生型擬南芥植株。用含有抗生素的 MS 培養(yǎng)基篩選收獲的 T0 代擬南芥種子，并進行GUS染色和分子檢測獲得陽性植株。經(jīng)過連續(xù)篩選得到的T3代種子用于后續(xù)試驗。將種子在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天，再將其轉(zhuǎn)入含有100 mmol·L-1NaCl或30%PEG的MS培養(yǎng)基中處理0，1，3，6，9，12，24 h。將MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天的擬南芥置于40 ℃和4 ℃環(huán)境下0，1，3，6，9，12，24 h。將處理后的材料進行GUS染色，并在解剖顯微鏡下進行拍照和記錄。

1.4MnMAPK5轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同脅迫下的功能

為進一步研究MnMAPK5的功能，構(gòu)建了MnMAPK5過表達的載體。根據(jù)報道的川桑MnMAPK5的CDS序列設(shè)計引物(表1)，并在上下游引物中分別加上酶切位點KpnI和BamH I，以川桑葉片的cDNA為模板進行PCR擴增，目的片段經(jīng)T克隆驗證后連接到pLGNL載體上，并按照1.3中描述的方法獲得T3 代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子用于脅迫處理試驗。將春化2天的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥消毒后均勻鋪到含1/2 MS的培養(yǎng)基上進行不同脅迫下的種子萌發(fā)試驗。將在正常MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天的擬南芥種子進行脅迫處理2周后，對根長進行統(tǒng)計。將在正常MS中培養(yǎng)1周的幼苗轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)2周后進行脅迫處理； 當野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型呈現(xiàn)明顯差異時，拍照、記錄，并測定其生理指標，包括丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、葉綠素含量、過氧化氫含量、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性等指標。

1.5實時熒光定量PCR檢測脅迫相關(guān)基因的表達量

參照RNA 抽提試劑盒說明書(TaKaRa)提取總RNA，分別取適量RNA進行電泳檢測，并用NANODROP 2000檢測RNA的濃度和質(zhì)量。以總RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)說明書合成cDNA第1鏈，并使用以內(nèi)參基因設(shè)計的引物檢測是否有基因組污染。

參照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq TM II Kits 說明書進行實時熒光定量PCR分析，反應(yīng)體系和運行程序參考作者此前的報道(Weietal., 2014)。以MnRPL15為內(nèi)參基因，使用2-ΔCt法計算MnMAPK5相對于內(nèi)參基因MnRPL15的表達量，其相對表達量定義為2-[Ct(target gene)-Ct(control gene)]。使用Excel進行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS16.0軟件進行差異顯著性分析。

表1 MnMAPK5基因擴增和實時熒光定量PCR所用引物Tab.1 The primer sequences used for amplification of MnMAPK5 and quantitative real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1MnMAPK5的亞細胞定位

使用CELLO version 2.5在線軟件預測MnMAPK5定位在細胞核和細胞質(zhì)中； 而使用cNLS Mapper 和NucPred在線軟件預測卻發(fā)現(xiàn)MnMAPK5的核定位信號很弱。為確定MnMAPK5的亞細胞定位情況，構(gòu)建了35S-MnMAPK5∷EGFP和35S-EGFP過表達載體(圖1A)，并將其分別在洋蔥表皮細胞中轉(zhuǎn)染。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(圖1B)，在轉(zhuǎn)化了35S-MnMAPK5∷EGFP的表皮細胞的細胞核和細胞質(zhì)有熒光信號，與轉(zhuǎn)化了35S-EGFP的表皮細胞相似，表明MnMAPK5行使功能的場所可能在細胞質(zhì)和細胞核中。

2.2MnMAPK5啟動子元件分析與活性分析

為研究MnMAPK5啟動子的活性，從川?；蚪M數(shù)據(jù)庫中獲得了MnMAPK5基因上游的的啟動子序列，并進行了克隆。使用PlantCARE在線軟件預測出MnMAPK5啟動子序列中含多種順式作用元件，主要包括脅迫(包括生物和非生物脅迫)相關(guān)元件、植物激素響應(yīng)相關(guān)元件和植物生長發(fā)育相關(guān)元件3種類型，如ARE、HSE、LTR、MBS、AuxRR-core和CGTCA-motif等(圖2)。

圖1 MnMAPK5 在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位Fig.1 Subcellular localization of MnMAPK5 in onion epidermal cellsA： 35S-MnMAPK5∷EGFP 和 35S-EGFP 的載體結(jié)構(gòu)示意圖； B： 35S-EGFP和35S-MnMAPK5∷EGFP 在洋蔥表皮細胞的瞬時表達。A: Structure diagram of the 35S-MnMAPK5∷EGFP and 35S-EGFP vectors; B: Transient expression of 35S-EGFP and 35S-MnMAPK5∷EGFP in onion epidermal cells.

圖2 MnMAPK5上游啟動子順式作用元件分析Fig.2 Analysis of cis-element in the 5′-upstream region of MnMAPK5長方形表示光響應(yīng)調(diào)控元件，橢圓表示生物和非生物脅迫響應(yīng)調(diào)控元件，菱形表示激素響應(yīng)調(diào)控元件，對三角表示生長發(fā)育相關(guān)調(diào)控元件。The rectangle repesents light responsive element, the ellipse represents cis-acting element involved in stress responsiveness, the rhombus represents hormone responsive element, and the hourglass represents growth and development related cis-acting element.

構(gòu)建了MnMAPK5驅(qū)動GUS基因表達的轉(zhuǎn)基因載體，并將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中獲得T0代的種子，經(jīng)過Kan抗性篩選和分子鑒定獲得了轉(zhuǎn)基因系。為檢測MnMAPK5啟動子在不同脅迫下的活性，將表達ProMnMAPK5-GUS的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥在100 mmol·L-1NaCl、40 ℃、4 ℃和30%PEG處理1，3，6，9，12，24 h后進行GUS染色，檢測MnMAPK5啟動子對各種脅迫的響應(yīng)模式。如圖3所示，轉(zhuǎn)基因幼苗經(jīng)過高鹽、高溫、低溫和干旱脅迫后呈現(xiàn)出GUS顏色，且在NaCl處理6 h、40 ℃處理9 h、4 ℃和30%PEG處理3 h后GUS顏色最深，說明MnMAPK5啟動子能夠響應(yīng)不同的非生物脅迫。

圖3 MnMAPK5啟動子在擬南芥中驅(qū)動的GUS基因在脅迫誘導下的表達Fig.3 MnMAPK5 promoter drived expression partterns of GUS in Arabidopsis thaliana

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性檢測圖4 Determination of the transgenic Arabidopsis thalianaA： 基因組PCR鑒定； B： GUS染色鑒定； C： 實時熒光定量-PCR鑒定。WT: 野生型擬南芥; OE: 超表達株系。A: PCR analysis using genomic DNA as the template; B: Histochemical GUS staining of transgenic lines; C: Quantitative real-time PCR analysis using cDNA as the template. WT: The wild A.thaliana plants; OE: The overexpressed transgenic plants.

2.3轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定

為深入探究MnMAPK5在植物脅迫響應(yīng)中的作用機制，將MnMAPK5基因轉(zhuǎn)化進入擬南芥中，經(jīng)卡那霉素篩選、GUS染色和分子檢測獲得5棵轉(zhuǎn)基因株系，選取3株轉(zhuǎn)基因株系(OE1、OE3和OE5)研究過表達MnMAPK5對擬南芥抗性的影響(圖4)。在鹽脅迫條件下，過表達MnMAPK5抑制了轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)和生長，其葉片黃化程度比野生型擬南芥更嚴重。由此可見，過表達MnMAPK5降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫的抗性。對NaCl脅迫后的生理指標測定發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥相比，過表達MnMAPK5降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥中的H2O2含量、可溶性糖含量和CAT活性，提高了MDA含量和POD活性，脯氨酸含量與野生型擬南芥相比沒有顯著變化。此外，AtCAT和AtRD22基因在正常情況下表達無差異，經(jīng)鹽脅迫處理后在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達量顯著低于野生型(圖5)。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽性分析Fig.5 Salt tolerance analysis of transgenic Arabidopsis thalianaC： 鹽脅迫下的生長狀況； J： 鹽脅迫下脅迫相關(guān)基因的表達分析。WT： 野生型擬南芥； OE： 超表達株系。誤差線表示標準偏差(SDs)。柱形圖上的字母不同表示同一處理下不同株系有顯著性差異(P<0.05)。下同。C: Growth under salt condition; J: The expression level of stress-related genes under salt stress. WT: The wild A.thaliana plants; OE: The overexpressed transgenic plants. Error bars on each column indicate SDs. Different letters above the bars indicate the significant difference of different lines under the same treatments at P<0.05. The same below.

使用PEG6000模擬干旱脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥表現(xiàn)出優(yōu)于轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率和生長情況。在營養(yǎng)生長階段，相較于野生型擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥經(jīng)干旱處理后出現(xiàn)更為嚴重的萎蔫和干枯死亡現(xiàn)象。該結(jié)果表明過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱的敏感性。通過測定干旱脅迫后植株的生理指標發(fā)現(xiàn)，過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥中的H2O2含量、MDA含量，降低了脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性和CAT活性。此外，AtPOD、AtCAT和AtMYB44基因的表達量在正常情況下無顯著差異，經(jīng)鹽脅迫處理后在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達量顯著低于野生型(圖6)。

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性分析Fig.6 Drought tolerance analysis of transgenic Arabidopsis thalianaC：干旱脅迫下的生長狀況； J： 干旱脅迫下脅迫相關(guān)基因的表達分析。C: Growth under drought condition; J: The expression level of stress-related genes under drought stress.

由于在4 ℃條件下，擬南芥種子不能在MS培養(yǎng)基中萌發(fā)，選擇12 ℃作為低溫脅迫檢測種子的萌發(fā)率。12 ℃條件下，幼苗萌發(fā)后3天并未出現(xiàn)顯著差異。此外，營養(yǎng)生長階段的擬南芥在4 ℃脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥出現(xiàn)更嚴重的萎蔫和死亡現(xiàn)象，葉綠素含量顯著降低，表明過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對冷脅迫的敏感性。通過測定冷脅迫下的生理指標及脅迫相關(guān)基因表達發(fā)現(xiàn)，過表達MnMAPK5降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥中的脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性和CAT活性，AtPOD、AtCAT和AtRD22等脅迫相關(guān)基因的表達量都顯著低于野生型擬南芥(圖7)。

氧化環(huán)境脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥在H2O2處理后其萌發(fā)率和長勢不如野生型擬南芥。對H2O2處理下的生理指標及脅迫相關(guān)基因表達測定發(fā)現(xiàn)，過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的MDA含量，降低了脯氨酸含量和可溶性糖含量，AtPOD、AtCAT和AtABF4的表達量顯著低于野生型擬南芥(圖8)。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗冷脅迫分析Fig.7 Cold tolerance analysis of transgenic Arabidopsis thalianaB： 4 ℃下的生長狀況； I： 4 ℃下脅迫相關(guān)基因的表達分析。B: Growth under 4 ℃ condition; I: The expression level of stress-related genes under 4 ℃ condition.

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗H2O2脅迫分析Fig.8 H2O2 tolerance analysis of transgenic Arabidopsis thalianaB： H2O2脅迫下的生長狀況； G： H2O2脅迫下脅迫相關(guān)基因的表達分析。B: Growth under drought condition; G: The expression level of stress-related genes under H2O2stress.

3 討論

MAPK作為MAPK級聯(lián)途徑中最下游的蛋白激酶，在植物適應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮了極其重要的作用。根據(jù)植物MAPK的蛋白結(jié)構(gòu)域特點和功能差異，可分為A、B、C和D等4個亞家族。目前對植物中MAPK的相關(guān)研究主要集中于A家族MAPK(Ichimuraetal., 2002)，擬南芥中該家族的MPK3和MPK6已被證明是介導植物防衛(wèi)反應(yīng)和非生物脅迫響應(yīng)重要的調(diào)節(jié)元件(Beckersetal., 2009)。B家族MAPK在生物及非生物脅迫應(yīng)答中也起著重要的作用。研究表明，過表達煙草NtMPK4可提高植株對ROS的抵抗能力(Kenjietal., 2005)，AtMPK4可響應(yīng)低溫、干旱、機械損傷和滲透脅迫(Tomoyukietal., 2014)，過表達ZmSIMK1能夠提高植物的抗旱性和系統(tǒng)獲得抗病性(Wangetal., 2014)。但對B家族MAPK的功能還有待深入研究。本研究基于前期對川桑MAPK基因家族的分析，對MnMAPK5基因的功能進行進一步研究。通過對MnMAPK5的啟動子序列預測發(fā)現(xiàn)其含有多種參與脅迫響應(yīng)的順式作用元件，MnMAPK5啟動子驅(qū)動的GUS基因在擬南芥中的表達能夠響應(yīng)多種非生物脅迫處理，暗示MnMAPK5可能在非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著一定的作用。

為研究MnMAPK5在植物抗逆境脅迫中的作用，將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥中進行了過表達分析。在鹽脅迫、干旱、低溫和H2O2處理條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)和生長相比野生型受到了更嚴重的抑制，表明過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因植株對非生物脅迫的敏感性，暗示該基因在植物抗逆中可能是一個負調(diào)控因子。通過對擬南芥的生理指標分析發(fā)現(xiàn)，在正常生長條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的MDA含量、脯氨酸含量和POD活性等指標沒有顯著差異，但在干旱脅迫下，過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥中的MDA含量和H2O2含量，而降低了CAT和POD活性，表明過表達MnMAPK5可能導致了CAT和POD酶活性的降低，無法清除大量的H2O2，進而誘發(fā)細胞的膜脂過氧化物作用導致細胞膜的結(jié)構(gòu)被破壞。在低溫下，過表達MnMAPK5降低了CAT活性、POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量，表明植物在遭受冷脅迫時，使得膜系統(tǒng)既可從液晶態(tài)變成凝膠態(tài)進而發(fā)生相變，降低生物膜上的酶的活性(馬媛媛等， 2012)，導致植物不能進行正常的抗性反應(yīng)，而MnMAPK5促進了這一過程的發(fā)生。在鹽脅迫下，過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因植株中的MDA含量和POD活性，降低了CAT活性和可溶性糖含量，但H2O2含量也被降低，推測MnMAPK5可能通過影響其他途徑降低植株的抗鹽性。在氧化環(huán)境脅迫下，過表達MnMAPK5提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的MDA含量，降低了脯氨酸含量和可溶性糖含量，這表明在氧化脅迫下過表達MnMAPK5抑制了脯氨酸和可溶性糖合成，從而降低轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化脅迫能力。此外，在各個脅迫環(huán)境條件下，脅迫相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達量都要低于野生型擬南芥，這表明MnMAPK5可能通過負調(diào)控脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的表達降低植物的抗逆性。此前的諸多報道顯示MAPK在植物抵抗逆境脅迫中扮演著正調(diào)控的角色(Surietal., 2008； Liuetal., 2012； Tsugamaetal., 2012； Yuetal., 2010； Zhouetal., 2012)，而MnMAPK5具有負調(diào)控作用，豐富了對MAPK在抗逆境脅迫中的功能的認識，也為今后通過基因工程改良植物的抗逆性提供了新的視野。

4 結(jié)論

桑樹MnMAPK5基因的編碼蛋白定位于細胞質(zhì)和細胞核中；MnMAPK5啟動子活性受到了高溫、低溫、高鹽和干旱脅迫的誘導； 過表達MnMAPK5降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥對高鹽、干旱、低溫和H2O2的抵抗能力。

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(責任編輯 徐 紅)

ResistanceofArabidopsisthalianaTransformedwithMulberryMAPK5underStressConditions

Liu Changying Zhang Meng Wei Congjin Xu Yazhen Cao Boning Zheng Sha Fan Wei Xiang Zhonghuai Zhao Aichun

(StateKeyLaboratoryofSilkwormGenomeBiologyKeyLaboratoryofSericulturalBiologyandGeneticBreedingofMinistryofAgricultureSouthwestUniversityChongqing400716)

【Objective】 Mitogen-activated protein kinases (MAPK) play key roles in response to biotic and abiotic stresses in plants. To investigate the function of mulberry (Morusnotabilis)MnMAPK5 in response to stress conditions, the activities of the promoter ofMnMAPK5 in transgenicArabidopsisthalianaunder stress conditions, subcellular localization ofMnMAPK5 and its overexpression inA.thalianawere analyzed.【Method】 The promoter ofMnMAPK5 was inserted into the plant expression vector pBI121 and transformed intoA.thalianaby the floral dip method . The activity of GUS was dectected in the transgenic plants treated respectively with high temperature, low temperature, NaCl and PEG. The overexpression vector was constructed and transformed intoA.thalianaand the T3 transgenic plants were used for resistance analysis.【Result】MnMAPK5 gene was found encoding a cytoplasm- and nucleus-localized protein．The results of GUS staining showed that the activity ofMnMAPK5 promoter was induced by high temperature, low temperature, salt and drought. TheMnMAPK5-overexpressed transgenicA.thalianashowed lower germination rates, shorter length, and worse growth than wildA.thalianaplants under salt, drought, low temperature and H2O2. Under salt stress, MDA content and POD activity were higher in theMnMAPK5-overexpressed transgenic plants while CAT activity, soluble sugar content and H2O2content were lower. Under drought, the MDA content and H2O2content in theMnMAPK5-overexpressed transgenic plants were higher than in the wild plants while CAT activity and POD activity were lower. Under low temperature stress, CAT activity, POD activity, proline content and soluble sugar content in the transgenic plants were lower than in the wild plants. Under H2O2stress, MDA content was higher in the transgenic plants than in the wild plants while proline content and soluble sugar content were lower. Besides, the expression levels ofAtPOD,AtCAT,AtRD22 and other stress related genes were lower in the transgenic plants than in the wild plants under all the above stresses.【Conclusion】 The activities ofMnMAPK5 promoter in the transgenicA.thalianashowed responses to different abiotic stresses. TheMnMAPK5-overexpressed transgenicA.thalianashowed declined resistance against abiotic stresses, and indicated thatMnMAPK5 may be a negative factor in response to stress conditions.

Morus； MAPK； abiotic stress； stress responses； promoter

S718.46

A

1001-7488(2017)09-0035-10

10.11707/j.1001-7488.20170905

2016-09-30；

2017-02-20。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-18-ZJ0201)； 國家農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè)) 科研專項(201403064)。

*趙愛春為通訊作者。